Vánoční výzdoba DNA aneb světýlka, elektrony a háčky ve službách biochemiků a biologů Miroslav Fojta Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i./CEITEC MU 4.11.2015 Ostrava, 5.11.2015 Brno http://static4.depositphotos.com/1012083/289/v/950/depositphotos_2890157-Christmas-Tree.jpg http://www.ibp.cz/OPVK/images/OPVK_Vert.jpg Moderní biofyzikální metody: pokročilé praktické vzdělávání v experimentální biologii (CZ.1.07/2.3.00/09.0046) http://www.stavba-domu.cz/repository/Image/galerie/normal/vanoce-2.jpg Co je to DNA? purinové báze thymin (T) pyrimidinové báze cytosin (C) adenin (A) guanin (G) dvoušroubovice 2-deoxyribóza fosfát D:\dokumenty\OPVK\do přednášky\514px-DNA_chemical_structure.svg.png párování bazí v řetězcích DNA purinové báze thymin (T) pyrimidinové báze cytosin (C) adenin (A) guanin (G) dvoušroubovice 2-deoxyribóza fosfát D:\dokumenty\OPVK\do přednášky\514px-DNA_chemical_structure.svg.png párování bazí v řetězcích DNA http://www.prf.jcu.cz/data/imgs/16/251/974b.jpg http://static4.depositphotos.com/1012083/289/v/950/depositphotos_2890157-Christmas-Tree.jpg https://static.prozeny.cz/images/stories/12-prosinec/12/almi-dekor-2.jpg http://www.vanocni-ozdoby.info/images/vanocni_ozdoby_4.jpg http://rytmusvychod.cz/soubory/obsah/chrudim/2013/img-zvonek.jpg http://www.tragic-christian.org/.a/6a00d83455629c69e20192abdcf43b970d-800wi http://www.vanocni-ozdoby.info/images/vanocni_ozdoby_4.jpg http://www.tragic-christian.org/.a/6a00d83455629c69e20192abdcf43b970d-800wi http://365psd.com/images/premium/thumbs/110/candle-286945.jpg http://365psd.com/images/premium/thumbs/110/candle-286945.jpg http://365psd.com/images/premium/thumbs/110/candle-286945.jpg http://365psd.com/images/premium/thumbs/110/candle-286945.jpg http://www.vanocni-ozdoby.info/images/vanocni_ozdoby_4.jpg http://www.vanocni-ozdoby.info/images/vanocni_ozdoby_4.jpg http://rytmusvychod.cz/soubory/obsah/chrudim/2013/img-zvonek.jpg http://www.tragic-christian.org/.a/6a00d83455629c69e20192abdcf43b970d-800wi http://365psd.com/images/premium/thumbs/110/candle-286945.jpg Redox značky (hrátky s elektrony) Reaktivní skupiny (háčky a věšáčky) Fluorofory (světýlka) Ochranné skupiny prof. Michal Hocek (ÚOCHB AVČR Praha) http://www.uochb.cz/web/document/cms_library/135.jpg Hocek M (2014) Synthesis of Base-Modified 2 '-Deoxyribonucleoside Triphosphates and Their Use in Enzymatic Synthesis of Modified DNA for Applications in Bioanalysis and Chemical Biology. J Org Chem 79:9914-9921 Jak uvidět DNA? • https://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/b/bf/Beer_lambert1.png https://agctsequencing.files.wordpress.com/2012/04/figure11.jpg http://www.i60.cz/obrazky/velke/duha_201204202255280.jpg DNA je ve viditelném světle bezbarvá Báze DNA absorbují ultrafialové světlo IF Můžeme si pomoci fluorescencí? Fluorofory absorbují fotony UV nebo viditelného záření a poté je zase emitují (obvykle s nižší energií) DNA nijak zajímavě nefluoreskuje... https://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/b/bf/Beer_lambert1.png http://www.mpbio.com/images/product-images/molecular-structure/04802511.png http://www.madsci.org/posts/archives/1999-02/919869466.Mb.1.jpg ...ale fluoreskují některé látky, když se na DNA navážou! ethidium bromid http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/gel_0.jpg http://i.ytimg.com/vi/KKmiKKMDDhY/maxresdefault.jpg http://www.genemedresearch.ox.ac.uk/images/gel.jpg https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/36/Two_percent_Agarose_Gel_in_Borate_Buffer_cast_i n_a_Gel_Tray_%28Top%29.jpg Elektroforéza DNA v agarózovém gelu: třídění molekul DNA podle velikosti https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a6/Gel_electrophoresis_apparatus.JPG příprava gelu elektroforéza http://www.sedeer.com/wp-content/uploads/2012/03/GelElectrophoresis.jpg nanesení vzorků kde je DNA??? + ethidium + UV foto Je možné vidět gen? •Gen je (ne zcela přesně řečeno) úsek DNA kódující protein •několik stovek párů bází z několika miliard (v lidkém genomu) https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTKdhrGAPnlUxcAHyTPSUfKPpKU25pBH4cG_e5bi8xeGCv K7BFo https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/78/Sparkler.JPG/220px-Sparkler.JPG https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/78/Sparkler.JPG/220px-Sparkler.JPG https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/78/Sparkler.JPG/220px-Sparkler.JPG http://operaplus.cz/pix/5/4/9/0/5490-svetova-operni-divadla-metropolitni-opera-new-york-1-4.jpg http://operaplus.cz/pix/5/4/9/0/5490-svetova-operni-divadla-metropolitni-opera-new-york-1-4.jpg http://operaplus.cz/pix/5/4/9/0/5490-svetova-operni-divadla-metropolitni-opera-new-york-1-4.jpg https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/78/Sparkler.JPG/220px-Sparkler.JPG GAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTG AGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGC CCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCAT GAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGC TCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGC GATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTG GCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTC AGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTA TCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGG AAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATG AGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGA GGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCC CCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAAT GAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTG AGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGC CCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCAT GAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGC TCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGC GATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTG GCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTC AGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTA TCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGG AAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATG AGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGA GGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCC CCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAAT 1963 Julius Marmur: renaturace DNA + denaturace (za horka) renaturace (při pomalém ochlazování) hybridizační sonda -známá sekvence navržená (syntetizovaná) tak, aby se párovala s cílovou DNA, která nás zajímá -může být značená target DNA -detekovaná pomocí hybridizační sondy GCTTATGCTGGAAT CGAATACGACCTTA CGAATACGACCTTA GCTTATGCTGGAAT Hybridizace DNA (RNA): tvorba dvoušroubovice z řetězce sondy and komplementárního cílového řetězce http://blog.bio.cz/articles_images/be94639fff8da623ee82af1f8d01eb3559fa4f5a.png Vícebarevné značení? Genové čipy Kobold 246.jpg (42165 Byte) http://cg.uchospitals.edu/sites/default/files/chromosomes.jpg https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSquFjWntO-T_619QM6-dI1FyWGoMcf_eExSEUpAqOqeGP WgGyz http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-12492Fluorescence-in-situ-hybridization_460.jpg http://d32ogoqmya1dw8.cloudfront.net/images/microbelife/research_methods/microscopy/fish_diagram.gi f Fluorescenční in-situ hybridizace Modrá barva: fluorescenčně „obarvená“ celková DNA Proteiny rozsvěcují světýlka na DNA •některé fluorofory špatně „svítí“ ve vodě, ale dobře v nevodném prostředí • •navázaný protein vodu vytěsní a fluorescence se zesílí Riedl J et al., Chem Sci 3, 2797 (2012). Světlo medúzy: zelený fluoreskující protein (fluorofor svítí lépe, když nemůže rotovat: např. je-li uvězněn v proteinu) http://proteopedia.org/wiki/images/thumb/2/24/Green1ema.png/400px-Green1ema.png http://scienceblogs.de/lindaunobel/wp-content/blogs.dir/32/files/2012/07/i-aa5c3b71018d2c51ef58ce70 86232a82-image-gfp-mouse-crop-copy.jpg http://payload284.cargocollective.com/1/11/373440/7985813/Glow_Mouse_Camera3_0001_CC2.jpg Jak vánoční výzdobu DNA uskutečnit? •můžeme si nechat chemicky vyrobit a koupit značenou DNA (drahé, a koho baví umělé stromečky?) • •obyčejnou DNA můžeme značit pomocí chemických reakcí • • • •DNA můžeme poskládat pomocí enzymů přímo ze značených stavebních kamenů Značení DNA pomocí enzymů a modifikovaných stavebních kamenů – deoxynukleosid trifosfátů templát dATP dGTP dCTP dTTP DNA polymeráza Prodlužování primeru (podstata replikace DNA) File:Desoxyadenosintriphosphat protoniert.svg ACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATG TGGTACTCGCGACGAGTCTATCGCTAC ACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATG primer templát dATP dGTP dCTP dTTP DNA polymeráza ACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATG primer Prodlužování primeru (podstata replikace DNA) File:Desoxyadenosintriphosphat protoniert.svg templát primer dGTP dATP dCTP dTTP DNA polymeráza Prodlužování primeru s modifikovanými dNTP File:Desoxyadenosintriphosphat protoniert.svg ACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATG ACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATG TGGTAGTCGCGACGAGTCTATCGCTAC templát primer dGTP dATP dCTP dTTP DNA polymeráza ACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATG Prodlužování primeru s modifikovanými dNTP File:Desoxyadenosintriphosphat protoniert.svg skupina prof. Michala Hocka syntéza modifikovaných dNTP http://www.uochb.cz/web/document/cms_library/135.jpg Můžeme vidět změnu jednoho písmenka v DNA (bodovou mutaci)? • GAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTG AGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGC CCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCAT GAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGC TCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGC GATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTG GCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTC AGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTA TCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGG AAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATG AGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGA GGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCC CCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAAT GAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTG AGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGC CCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCAT GAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGC TCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGC GATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTG GCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATAGCTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTC AGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTA TCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGG AAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATG AGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGA GGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCC CCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAAT GAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTG AGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGC CCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCAT GAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGC TCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGC GATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTG GCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATAGCTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTC AGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTA TCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGG AAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATG AGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGA GGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATGAGGTTGTGAGGCGCTGCC CCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAAT templát primer ddGTP ddATP ddCTP ddTTP DNA polymeráza Detekce mutací ACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATG ACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATG T Kobold 246.jpg (42165 Byte) File:Desoxyadenosintriphosphat protoniert.svg File:Desoxyadenosintriphosphat protoniert.svg templát primer ddGTP ddATP ddCTP ddTTP DNA polymeráza Detekce mutací ACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATG GCCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATG C Kobold 246.jpg (42165 Byte) File:Desoxyadenosintriphosphat protoniert.svg http://wiki.rvp.cz/@api/deki/files/24639/=B-elekt%2525C5%252599ina.jpg?size=webview Místo světýlek elektrické proudy? http://www.zahadyzivota.cz/wp-content/uploads/blesk_hlavni.jpg Elektrochemické metody … polarografie -I -E Xm-n Xm n e- identifikace elektrochemicky aktivní látky (co to je) kvantifikace (jaká je koncentrace) kapající rtuťová elektroda Nobelova cena 1959 Jaroslav Heyrovský -I -E Xm Xm-n n e- •visicí rtuťová kapková elektroda •pevné elektrody Xm Xm-n n e- Elektrochemické metody … voltametrie tn_Emil Emil Paleček (od 50 let): polarografie DNA nature1 nature2 DSCF0004 http://foto.vlada.cz/g2data/albums/tiskove/listopad/ceska_hlava/EA7A3690.JPG Česká Hlava 2014 potential/V vs. SCE G Gox Aox CA -1.5 -1.0 -0.5 0 0.5 1.0 1.5 1 3 Tox Cox carbon electrodes mercury and amalgam electrodes Elektroaktivita DNA reduction adsorption/desorption oxidation oxidation of a G reduction product „Spektrum“ redox potenciálů různých značek a palette of labels producing distinct electrochemical responses nitrophenyl Kombinace benzofurazanu a nitrofenylu A B BFred NO2red BFred NO2red Přístup vhodný pro snadné seldování relativních změn v zastoupení jednotilvých bazí v daném úseku DNA 3BF a/nebo 3NO2 v 30-meru DNA Poměry výšek píků BF/NO2 6e- 4e- 4e-? 4e- HMDE PGE 1.5 2.25 3.0 0.5 1.0 4.5 0.5 expected ratios of electrons involved (HMDE) Balintova J., et al. Chem Eur J 19, 12720 (2013). https://static.prozeny.cz/images/stories/12-prosinec/12/almi-dekor-2.jpg http://rytmusvychod.cz/soubory/obsah/chrudim/2013/img-zvonek.jpg Háčky a věšáčky http://www.urbanek-ul.cz/files/Lankove-garnyze/_640x480/hacek-lankova-g-nikl.jpg http://www.urbanek-ul.cz/files/Lankove-garnyze/_640x480/hacek-lankova-g-nikl.jpg http://www.urbanek-ul.cz/files/Lankove-garnyze/_640x480/hacek-lankova-g-nikl.jpg http://www.vanocni-ozdoby.info/images/vanocni_ozdoby_4.jpg -DNA se opatří háčky při její enzymatické syntéze (malé chemické skupiny) -k nim je pak možno připojit další molekuly Zachycení proteinu na DNA nesoucí vhodný háček Dadova J. et al., Angew Chem Int Edit 52, 10515 (2013). Michaelovy akceptory •reakce Michaelových akceptorů na DNA s –SH skupinami proteinu •podmínkou je správné navázání proteinu na sekvenci DNA, kterou rozpoznává, aby se obě reaktvní skupiny dostaly do vzájemné blízkosti Molekulární rybaření http://www.ultrafishing.cz/files/products/images/thumb2/23238.jpg Dadova J, Vrabel M, Adamik M, Brazdova M, Pohl R, Fojta M, Hocek M (2015) Azidopropylvinylsulfonamide as a New Bifunctional Click Reagent for Bioorthogonal Conjugations: Application for DNA–Protein Cross-Linking. Chem-Eur J 21:16091-16102 •vychytávání specifického proteinu z buněčného lyzátu Děkuji za pozornost! http://static4.depositphotos.com/1012083/289/v/950/depositphotos_2890157-Christmas-Tree.jpg Moderní biofyzikální metody: pokročilé praktické vzdělávání v experimentální biologii (CZ.1.07/2.3.00/09.0046) http://www.ibp.cz/OPVK/images/OPVK_Vert.jpg