C7188 Úvod do molekulární medicíny 1/10 Definice Historie Obsah kurzu Ondřej Slabý & Jiří Šána Lékařská fakulta & CEITEC, Masarykova univerzita Masarykův onkologický ústav Fakultní nemocnice Brno © Ondřej Slabý & Jiří Šána, 2021 logo_MOU GS011558 Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 2 Vymezení pojmu MOLEKULÁRNÍ MEDICÍNA [1] Massoud TF, Gambhir SS, Trends in Molecular Medicine, 2007 MOLECULAR MEDICINE is a branch of medicine that develops ways to diagnose and treat disease by understanding the way genes, proteins, and other cellular molecules work. Molecular medicine is based on research that shows how certain genes, molecules, and cellular functions may become abnormal in diseases such as cancer. according to National Cancer Institute (NCI) Molekulární medicína je obor založený na aplikaci poznatků a metod molekulární biologie do klinické medicíny vedoucí k cílené prevenci a vyššímu stupni integrace diagnózy a terapie. Molekulární medicína je širší pojem, nesprávně synonymicky používané pojmy: ~ Personalizovaná medicína ~ individualizovaná medicína ~ „adresná“ medicína ~ Translační medicína („from bench to bedside“) Zahrnuje obory jako farmakogenetika/genomika, nutrigenetika/genomika, ale také mikrobiologickou DNA diagnostiku, prenatální diagnostiku,... Koncepce a hlavní náplň oboru MOLEKULÁRNÍ MEDICÍNA 1)Identifikace individuálních genetických dispozic ke konkrétním chorobám a formulace preventivních opatření (molekulární epidemiologie, např. nutrigenomika) 2)Aplikace molekulárně-biologických metod do klinické diagnostiky (mikrobiologická DNA diagnostika, prenatální diagnostika,...) 3)Zdokonalení diagnostiky a přesnější formulace nozologických jednotek zohledňující jejich molekulární patologii 4)Identifikace nových terapeutických cílů (molekulárních struktur buňky) co nejvíce specifických pro dané onemocnění 5)Příprava léčiv nové generace (21st century therapeutics, cílená léčba, buněčná terapie, genová terapie,...) 6)Individualizace léčby na základě genetického pozadí jedince 7)Zdokonalení a zrychlení transferu technologií z laboratoří k lůžku pacienta (from bench to bedside) 8)Bioetika a právo Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 3 C:\___allimages\medicineelsi\ATCG_people.jpg INTEGRACE DIAGNÓZY A TERAPIE!!! 1)Kardiologie – SNP eNOS, apoB, LDLreceptor, MTHFR, ACE, plazminogen, inhibitor aktivatoru plazminogenu, ... psychiatrie zavislosti-DDR2, CCR5 HIV vstup do bunky spolecne s CD4 – mutace vede ke vzniku defektniho proteinu,BRCA1, BRCA2 – karcinom prsu, ovaria, RB1-retinoblastom, TP53=LiFramen, MLH1, MSH2, PMS1, MEN1, VHL-karcinom ledvin,atd. GENSCAN GHC a jine, nutrigenomika – individualizovany jidelicek,... 2)Priklad karcinomu prsu basal like, luminal likeA-C,Her2, breast like, klasifikace velkobunecneho Blymfomu, hypertenze,... ACE inhibitory 3 a 4) Terapeuticke cile – EGFR 5) KRAS, DPD, UGT – UDP glukuronosyl transferase, warfarin - CYP2C9 erbitux kolorektalni karcinom Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 4 Pacienti neodpovídající na léčbu nebo vykazující závažnou toxicitu Pacienti se stejnou diagnózou Pacienti odpovídající na léčbu bez znaků závažné toxicity INTEGRACE DIAGNÓZY A TERAPIE PRECIZNÍ MEDICÍNA!!! Dogma JEDNA NEMOC=JEDNA LÉČBA Zrušení dogmatu JEDNA NEMOC=JEDNA LÉČBA Nosologická jednotka je dnes definována jako konkrétní příčina, která vede k rozvoji typického souboru příznaků. Tato „konkrétní“ příčina ovšem v naprosté většině případů není definována na molekulární úrovni. Neexistují dva naprosto stejné případy téže nemoci Jen velmi malá část lidských nemocí má jednoduchou, dokonce jedinou příčinu (některé dědičné nemoci a závažné infekce) I zde - hemofilie, tuberkulóza a AIDS kolísají individuální příznaky tak značně, že je nutné hovořit pouze o celkovém klinickém obrazu 1. Genetické dispozice ovlivňují průběh téměř všech nemocí 2. Mohou existovat rozdílné molekulární podtypy v rámci jedné diagnózy Příklad molekulární klasifikace karcinomu prsu Existuje pět molekulárních podtypů karcinomu prsu Sorlie et al, PNAS, 2001 Strana 5 Úvod do molekulární medicíny 1/10 Úvod do molekulární medicíny 1/10 Zrušení dogmatu JEDNA NEMOC=JEDNA LÉČBA Nejsou dvě léčby stejné = účinky jednoho léčiva se liší v závislosti na genetickém pozadí jedince = farmakogenetika, farmakagenomika Volba správné terapie nikoliv pouze na základě diagnózy, ale také vzhlededem ke schopnosti organismu nakládat s příslušnou látkou (vliv genetiky, vliv prostředí – interakce složek potravy) Farmakokinetika – např. metabolická schopnost organismu (CYP2D6, DPD) → toxicita, rezistence Farmakodynamika – přítomnost molekulárních změn → rezistence Předpoklad farmakogenetiky a farmakogenomiky: Genetické změny (prediktivní markery) spojené s fenotypy toxicity a rezistence jsou předem identifikovatelné. Strana 6 Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 6 Cíl tzv. precizní medicíny (precision medicine) Molekulární epidemiologie Molekulární patologie Molekulární diagnostika Molekulární farmakologie výzkum MOLEKULÁRNÍ MEDICÍNA aplikace aplikace výzkum Cílená prevence, integrace diagnózy a terapie Úvod do molekulární medicíny 1/12 © Ondřej Slabý, 2011 Strana 2 bruegel-elder_tower_babel_1 molekulární biolog lékař Pouze ilustrace Myšleno pouze jako stavba, nikoliv EU parlament! Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 8 Proč je investováno tolik financí do výzkumu a vývoje v oblasti MOLEKULÁRNÍ MEDICÍNY? „If it were not for the great variability among individuals, Medicine might be a Science not an Art“ Sir William Osler, The Principles and Practice of Medicine, 1892 Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 20 smile009.gif image by pure100 Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 9 Historie molekulární medicíny – „počátky“ 1715 Giovanni Battista Morgagni, 1858 Rudolf Virchow 1859 Charles Darwin, 1865 Gregor Mendel, 1910 Thomas Hunt Morgan 1949 – Linus Pauling – pojem Molekulární onem. 1953 – James D. Watson a Francis Crick – sekundární struktura DNA Nobelova cena – 1962 1957 – Francis Crick a George Gamov CENTRÁLNI DOGMA molekulární biologie Asi nejslavnejsim ranym patologem byl Morgagni lokalizoval nemoci do organu zakladatel patologicke anatomie, Německy patolog Virchow – tkane, bunky mikroskopicka anatomie •vzniku druhů přírodním výběrem, O pohlavnim vyberu •První ucelenou evoluční teorii vytvořil Jean Baptiste Lamarck (viz lamarckismus), ale dnešní vědci vycházejí spíše z teorie, kterou později předložil Charles Darwin (viz darwinismus, neodarwinismus), který spojil myšlenku postupné evoluce druhu s přírozeným výběrem, jakožto příčinou a hybnou silou evoluce. Kromě evoluce biologické se uplat'nuje i evoluce kulturní. Neodarwinismus je souhrnné označení pro současné hlavní paradigma evoluční teorie vzešlé z Darwinova učení. Zahrnuje zejménaNovou syntézu, tj. dřívější spojení darwinismu, Mendelovy genetické teorie a populační genetiky,genocentrický pohled na evoluci, jak byl popsán v pracích George C. Williamse a zpopularizován a rozveden v knihách Richarda Dawkinse (viz sobecký gen) aširoký adaptacionismus, přesvědčení, že hlavním motorem vývoje organismů je neustálé přizpůsobování se podnětům prostředí a že naprostou většinu znaků současných organismů lze vysvětlit nějakou dřívější adaptací. •olekulární podstata některých biologických systémů, jako jsou krevní srážení, imunitní systém, vidění apod., je velmi složitá a Behe se domnívá, že tyto systémy jsou neredukovatelně komplexní (irreducibly complex). Neredukovatelně komplexní je ten systém, který je tvořen několika dobře propojenými, vzájemně interagujícími částmi, jež přispívají k základní funkci tohoto systému, přičemž odstranění kterékoli části vede ke ztrátě funkce systému. Behe uvádí, že Darwin ve své knize „O vzniku druhů“ říká:Jestliže by mohla být demonstrována existence komplexního orgánu, u nějž by nebylo možné, aby vznikl díky četným následným malým modifikacím, moje teorie by se zhroutila. (Přeložil E. P.)Když Darwin asi před 150 lety navrhoval svoji teorii, nemohl znát molekulární podstatu života. Živé organizmy se jevily jako poměrně jednoduché systémy a z hlediska našeho současného poznání můžeme říci, že pro Darwina představovaly „černé skříňky“, do jejichž podstaty nemohl nahlédnout. Behe se trpělivě snaží čtenáři vysvětlit, že některé biologické systémy jsou na molekulární úrovni neredukovatelně komplexní. •V roce 1933 dostal Nobelovu cenu za lékařství a fyziologii za objevy role chromozomů v dědičnosti. Věren svému šlechetnému duchu, podělil se s odměnou za cenu se svými kolegy Sturtevantem a Bridgesem.Morgan se svými spolupracovníky odvodili z rozsáhlých pokusů s křížením drozofil, že geny jsou umístěny na chromozomech, a to v lineárním pořadí a že geny umístěné na stejném chromozomu tvoří jednu vazbovou skupinu. •Barbara McClintock (16. června 1902, Hartford, Connecticut – 2. září 1992, Huntington, New York) byla americká novátorská vědkyně a světově uznávaná cytogenetička. Zavedla například pojem skákající gen (genetická informace je pohyblivá). Za tento objev obdržela v roce 1983 Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství. Byla také oceňena Wolfovou cenou za lékařství. 1966 – Marshall Nirenberg, Heinrich Mathaei a Severo Ochoa rozluštili genetický kód Nobelova cena 1968 Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 10 1970 David Baltimore izoloval enzym reverzní transkriptázu z RNA retroviru 1972 Paul Berg vytvořil první rekombinantní molekulu DNA 1974 Paul Berg navrhuje v Science dobrovolné moratorium na techniky rekominantní DNA 1974 Frederick Sanger zavedl metodu sekvenace DNA 1976 První biotechnologická společnost založená v Kalifornii GENENTECH, Inc – první lék připravený in vitro pomocí genového inženýrství – lidský inzulin uvedený na trh 1982 Paul Berg 1978 David Botstein zavedl metodu polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (restriction fragment length polymorphisms-RFLP) Zásadní metoda pro identifikaci jednonukleotidových polymorfizmů (SNPs) Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 11 EcoR1 – GAATTC Restrikční endonukleázy 1983 Kary Mullis v Cetus Corporation zavedl polymerázovou řetězovou reakci (PCR) Karry Mullis s hvězdou seriálu CSI: Las Vegas Marg Helgenberger 1998 – objev RNA INTERFERENCE Craig Mello a Andy Fire u C. Elegans –NOVÝ NÁSTROJ GENOVÉ TERAPIE Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 19 © Ondřej Slabý, 2009 mello_banquet2_photo Craig Mello na slavnostním banketu po udílení Nobelových cen za rok 2006. Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 21 HUMAN GENOME PROJECT 1985-1990: diskuse o sekvenování lidského genomu – “nebezpečné” - “nesmyslné” - “nemožné” 1988-1990: Založen HUMAN GENOME PROJECT (HGP) 20 laboratoří z USA, Velké Británie, Japonska, Francie, Německa a Číny Asi 2800 lidí, vedoucí: Francis Collins, NIH Mezinárodní spolupráce: HUGO (Human Genome Organisation) Cíle: – genetická mapa lidského genomu – fyzická mapa: marker každých 100 kbp – sekvenování modelových organismů (E. coli, S. cerevisiae, C. elegans, Drosophila, myš) – objevit všechny lidské geny (předpokl. 60-80 tisíc) – sekvenování celého lidského genomu (3000 Mbp) do r. 2005 s rozpočtem 3 bil. USD Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 22 Květen 1998 • Craig Venter zakládá soukromou biotechnologickou společnost CELERA GENOMICS, Inc. a vyhlašuje záměr sekvenovat celý lidský genom za 3 roky a 300 mil. USD metodou whole-genome shotgun, několik desítek zaměstnanců (sponzorováno Applied Biosystems) • V té době výsledek práce HGP: sekvenováno cca 4 % lidského genomu. Celera Genomics & akad. spolupracovníci publikují draft genomu Drosophila melanogaster (cca 2/3 z 180 Mbp) • ... whole-genome shotgun lze použít i pro velké genomy • ... Lidský genom: závod mezi Human Genome Project a Celera Genomics Únor 2001 - Remíza HGP publikuje draft lidského genomu v časopisu Nature 15.2.2001. Celera Genomics publikuje svou sekvenci lidského genomu v Science 16.2.2001. „Discovery can´t wait“ 20-CollinsVenter Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 23 20-13-AltSeqStrategies-L Srovnání přístupu veřejného konsorcia a Celera Genomics Pracovníci veřejného konsorcia byli zavázáni tzv. Bahamskou deklarací, která stanovila, že se výsledky sekvenování musí do 24 hod. vystavit veřejně na internetu, aby všechna pracoviště mohla využít výsledků ostatních. Tato data ovšem využívali i pracovníci Celery, kteří ovšem nebyli Bahamskou deklarací vázáni a své výsledky nezveřejňovali. Clone-by-clone Whole-genome shotgun 20-11-ChromosomeWalking-L Craig Venter Září 2007, 10 mil. USD 32 million DNA fragmentů, 20 billionu bazí Total variants: 4.1 million 3.1 million SNPs 4000 genů mělo pozměněné proteinové produkty Venter netrpí CF ani Huntigtonovou chorobou James D. Watson Říjen 2007 Méně než 1 mil. USD Publikován v GeneBank Trvalo méně než 2 měsíce Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 24 Následovaly sekvenační analýzy dalších jedinců z různých etnik, které přinesly podstatné informace o interpersonálních rozdílech ve struktuře genomů. aug1-3.jpg human-genome-page-from-book.png 3,2 miliard jednotek DNA kódu: •127 knih •1000 stran na knihu •cca 25000 znaků na stranu Informační obsah lidského genomu •25kb na stranu aug1-3.jpg Informační obsah lidského genomu +á 5 years old boy with diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG), histology AA-GBM, Ki67 – 60% Somatic mutation in HIST1H3B K28M (poor prognosis) and E545K in PI3K gene -> hyperactivation of PI3K/Akt signalling pathway -> (miltefosine/impavido the only approved Akt inhibitor) Miltefosine DRUG REPURPOSING! Leishmaniasis miltefosine After 17 months stabilization PET negativization Case report 1 – somatic mutation Take home 1)Co je molekulární medicína? 2)Co znamená spojení „integrace diagnózy a terapie“? 3)Jaké jsou důvody a následky individualizace léčby? 4)Jaké milníky v historii molekulární biologie umožnily vznik oboru molekulární medicína a jaké nejnovější poznatky její rychlý vývoj v posledních letech? 1) 1) 1) Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 34 Úvod do molekulární medicíny 1/10 Doporučená literatura Strana 35 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 1/10 Strana 36 © Ondřej Slabý, 2009 Dotazy?