C7188 Úvod do molekulární medicíny 4/12 Moderní metodické přístupy v molekulární medicíně II GENOMIKA II Ondřej Slabý & Jiří Sána Lékařská fakulta & CEITEC, Masarykova univerzita Masarykův onkologický ústav Fakultní nemocnice Brno ^ C E I T E C Úvod do molekulární medicíny 4/12 Microarray sample p r o c e s s i n g w o r k f l o w Strana 2 Úvod do molekulární medicíny 4/12 Treated (log2 ratio) '9.5 Linear Best Fit Line Gene Expression Arrays: Scatter Plot 5.5 7 9 11 13 Untreated (log2 ratio) 15 Two fold line Strana I Úvod do molekulární medicíny 4/12 Normalizace dat ukázky normalizačních metod -kompenzace nelinearity dat mezi jednotlivými čipy a uvnitř daného čipu Pozitivní kontroly: "Housekeeping" geny s „konstantní" expresí ve tkáních kontrolní genetický materiál (referenční vzorek) kontroly účinnosti hybridizace - artreficiální sekvence Negativní kontrola: -pozadí hybridizace -Affymetrix - mutace v jednom nukleotidu sondy Odečtení pozadí - background substraction (griding,local background, median, empty spot,...) Strana 4 Úvod do molekulární medicíny 4/12 Normalizace Lowess: princip Loess (or lowess) : Locally WEighted Scatterplot Smoothing (vyhlazování) Normalizace závislá na intezitě signálu Místi Local1 Y 4 * i 10 12 14 16 10 12 U 16 Strana 6 Úvod do molekulární medicíny 4/12 1) Identifikace biologicky významných genů -geny s reprod u kovátelnou signifikantně rozdílnou expresí mezi jednotlivými podmínkami experimentu -poměr exprese v jednotlivých experimentech -t-test (test rozdílnosti průměrů exprese v jednotlivých skupinách) -Significance Analysis of Microarrays (SAM) založeno na t-testu -Multifaktoriální ANOVA (nejsignifikantnější geny pro dané skupiny) t TlůR Multiple Array Co(Úsnjimá,,< Statislitliýpristúp Ů&tolsnalyiy \lliL1Ti ľŕflĽHJTf\4 ll l*íi ? # í ti fliuiM m r i vrrrv-f i' 'yľ b"i !t rm a f"ň | TYÍ.LI ľ/G/? MultipleExperiment Viewer (TMEV) http://www. tm4. org/ Strana 7 Úvod do molekulární medicíny 4/12 2) Ukázky multidemenzionálních metod analýzy čipových dat Shlu kovacíanalýzy Shluková analýza je jednou z nejpoužívanějších vícerozměrných statistických metod Jedna se o explorativni techniku, která se používá zejména v případech, kdy nemáme žadne o priori znalosti o struktuře uvnitř dat. Dabrá prognóza DFS>36m Spatná prognóza DFS<3Gm H G F MYB K R A S C D 8 2 E T V 4 MYi".: T I M P Z každý gen je reprezentován vektorem jehož souřadnice, jsou hodnoty exprese genu v jednotlivých experimentech, vzdálenost je měřena mezi vektory nebo centroidy Úkolem shlukovacích metod je tedy najit v datech skupiny prvků (shluky) tak, že prvky jednotlivých skupin budou v jistém smyslu více podobné než prvky z jiných skupin, tzn. nalezené skupiny prvků budou co nejvíce homogenní Snažíme se nalézt mezi zkoumanými geny (resp. biologickými vzorky) skupinky genů (resp. biologických vzorků), které vykazují v průběhu experimentu, tedy za působení specifických podmínek, podobné chování. Strana 8 i mezi všemi geny a nalezení nejmenší. iy jí podobné a vytvoří se klastr. i clusterů se hledají vzdálenosti mezi lustering) nezen Hierarchické klastrování Úvod do molekulární medicíny 4/12 Centroidové metody - K-means minimalizovaná vnitroshluková variabilita a zároveň maximalizovaná mezishluková variabilita •start s náhodnou pozicí předem definovaného počtu K-centroidů •opakovaný pohyb centroidů, dokud nedosáhnou stability a nezahrnou veškeré prvky systému opakování = 0 Strana 10 Úvod do molekulární medicíny 4/12 Centroidové metody - K-means •start s náhodnou pozicí předem definovaného počtu K-centroidů •opakovaný pohyb centroidů, dokud nedosáhnou stability a nezahrnou veškeré prvky systému opakování = 1 Strana 11 Úvod do molekulární medicíny 4/12 Centroidové metody - K-means •start s náhodnou pozicí předem definovaného počtu K-centroidů •opakovaný pohyb centroidů, dokud nedosáhnou stability a nezahrnou veškeré prvky systému opakování = 3 Strana 12 Úvod do molekulární medicíny 4/12 3) Klasifikační metody Principem klasifikačních metod v analýze dat z DNA čipů je vytvoření rozhodovacího pravidla, které by na základě naměřených hodnot genové exprese umožňovalo přiřazení pacienta do jedné z předem definovaných tříd (například zdravý, nemocný). Z toho je zřejmé, že by se „dobré" rozhodovací pravidlo založené na expresních datech mohlo zařadit po bok stávajících diagnostických metod a výrazně tak přispět ke zpřesnění diagnostiky závažných onemocnění (klasifikační stromy, Support Vector Machines (SVM), metoda k-nejbližších sousedů,..) MOLEKULÁRNI KLASIFIKACE NÁDORU: precizní klasifikace je základem léčebného úspěchu, současné metody jsou založeny na morfologii, imunohistochemii, genetice a klinické odpovědi řada diagnostických nejasností (heterogenita) ČIPY: -identifikace nových jednotek na podkladě profilu genové exprese -reklasifikace stávajících jednotek -identifikace skupin či jednotlivých genů „markem" specifických pro dané jednotky ldi?ntifirariar of MnlKuLir Subgroup1 ;fíf Diffuse Large B-Cell Lymphoma • H : . . ;i •: i DLBC.: Vjí u ltd • v m Origin \':c ":ľ •.' CeflPťl E Cíli PljiL-GerniiridlCuntirf J Lili tt * e NFwB Pafliwau <5erifl|lc í 3lns / Arnplinrai*Qn& of 3q Gaiis i ArrplifiĽatMfií cfug ůnins f Jkm-cJiŕ icatjsni i f lBfl Si*rt*aJ rota Strana 13 Úvod do molekulární medicíny 4/12 Molekulární klasifikace velkobuněčného B-lymfomu LX^I I_v3 M l I_y1 C n i 0 1 - L X M ? C L C L - L 0 3 • Hl Oi -CO=F.C L O L ••>:•_'•:• C L C L - C O C - i r.i i r i . r j W f l Tr3f-i s i r r i n a l C e n I e r Q Ti.--i .-r. C í t - n - i i i a l C ^ i l t f i i - i J Ľ H L f i . C L C L -OOOUC L C L -t-osu Ľ L Q . O O G J C L C L D C Ů • m O J -no* Ľ L C L O O G i C L C L - l > » J n i o i - O T Ľ I S li=4~rCI D L C L - L - L - 5 S I . i "i N ľ ^ t Ľ L O L • D L C L H - - fc. n i 0 1 - c o s - ? D L C L - D O " O C L C L - C O : S c:i.r.i. • %.«*•:.* Ci_Ci_-iL-C-- 3 D L C L - C O G C Ľ L C L OOOG D 1 _ C L - rjo • 4 r.i o i - c o 4 ß U L O L OOĽE^ C L U L W X i t n i o i - f j o i o Ľ I _ I L T _ • ? D L C L - C J O Ů C . n i o i o č - J Ľ L U _ OOI " tJloo = b! I q l / - C U 4 C L B i J - J ^ S : - k j M 1-11H fcv.i :1 R ri - hg 4-3--4J-! C l O O Z Ü J n l i - l a V - C D J L L I I L - f l _=dlEHOCUJ R m i i i - k j W ^ HM Hk->.ii- R . i . - : - igřj" --• D b o a U : a n h - i g ^ . O Ĺ i J L L Qh Lltz-z- = I - ú j i k d l Í U Í | + L r c : l i m • i o o = TVijamt C D f l i i - 3 S l i - n . C w l B ^ j y T.CD-1+ i - " S U K » = I 4 i c o n 3 l 3 l C D 4 + ü n s b i r . T i- y -n i.= : r — i j i :I: L: -1 - ~i = - rr T l~ ;.• "íl F H i •'• I "134- +F FiriiTi wsuT J _ . k B i ĹlBBT O C I L*1 2 0 0 1 I J-I 3.? t ' J Ľ H L • C L C L - O O * Fl ľi H L + Fl_-1 ^ : C 0 1 & + • - : . -" T.-1 •"• -• F L • • Fi -1 i ; c : n i ů + r i _ - n ; C L > 1 ^ i F I _ - 5 : C C " 1 9 + I H k » = b d i i r c i r o ' y I C c o = Ü : r a rmsI rj .z-r-zl ü b Q d & Cl_L-rJO HI I -Fft • J L L n - .: Ol I -R " OI_l_ C L L - 7 I « Ľľl I -T • JI • C L L I 2 C L J L - 3 S Ľľl I - R ? I Ľ L C L Ö X G :G a r r n i r ^ z i I c e n t r e B N I . l y m p h ri---r^i.1 .--nr;iI PŕH :E-1 i n g A t G 1 i •.• rifň-d T T h a n ±X<Ľf r"r>± J c e l l IruErEi F L P;-Ľ í l i n-:? Ľ - k K x J B C L L I P a n ES c e l l • G e r m i n a l C e n t r e B c e l l I I T c e l l A c t i v a t e d EL c e l l P r o l i f e r a t i o n L y m p h n o d e 2 I Vzato z: Nature February, 2000 Paper by Allzadeh. A et al Distinct types of diffuse large B-ceii lymphoma identified by Gene expression p Strana 14 Úvod do molekulární medicíny 4/12 Overall survival (ygars) GC B-like DLBCL Activated B-like DLBCL T T T T T T (£> « m í O j T - G f t i c u í M i - O T - T J - . - * 1 1 1 T 1 I i i i • i i • i f T i I t 1 1 I i ^ i i • j • i i ^ i i i i i i x _ ' i i ^ i n 0 { J O O ( J O O O O O O O O O O t J C J O Ľ > ( J O ^ a a Q D a a D Q a a o a a a a a D a a D D a • o o o Q a a Strana 15 Úvod do molekulární medicíny 4/12 ALL AML UB-l(CI[lSSri Mysin bffi í hiin(M312 i LI HbT-1 DyľiĽiiJiglt duiti (U33-11) TmoiKJttM** H ,áíZL3]]i) SWnrU23L7íi Rd>iiái\-J(Yaí)SL3 bl'Lonoľlii'TiiTiiliJi-pirTttiJipií (Lľífifl JL) LYW (JH1605E1 C D 3 3 f M I 3 ] ? 7 ) AJií*ift-i;:irii: Labeled or cftNft •NA. mlĽrrjrray Jí? genes CcmpířativB úrmryiií or gnne M'j!.í:iil;ir .íŕjcinLufe ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ Sada 70 genů - patent Úvod do molekulární medicíny 4/12 ~u PROTOKOL KLINICKE STUDIE „MINPACT ( M i c r o a r r a y In N o d e n e g a t i v e Disease m a y A v o i d C h e m o T h e r a p y ) P a c i e n t k y s k a r c i n o m e m p r s u : T 1 - 3 N 0 M 0 Registrace do studie, rebiopsie t u m o r u a odesláním vzorku nativní tkáně do centra studie I S t a n o v e n í p r o g n ó z y p a c i e n t e k (riziko r e l a p s u c h o r o b y ) : 1. "randomizace"pacienta 1. klinicko-patologický prognostický systém (Adjuvant OnLine) 2. 70-genový prognostický profil genové exprese t u m o r u Rozpočet-20 mil. EUR Pořádá síť TRANSBIG 40 institucí 21 zemí Zařazení 5000 pacientek v prvních 3 letech Oba prognostické systémy vyhodnotily nízké riziko časného relapsu choroby Výsledky obou prognostických systémů jsou ve vzájemném rozporu I Oba prognostické systémy vyhodnotily vysoké riziko časného relapsu choroby 2. randomizace pacienta C h e m o t e r a p i e : NE ANO 3. randomizace pacienta Chemoterapie: A) s antracyklinem B) s kapecitabinem/docetaxelem 1 H o r m o n o t e r a p i e NE: ER- A N O : ER+ R o c h e A m p l i C h i p C Y P 4 5 0 • Approved for clinical use in US and EU • Gene variations of CYP2D6 and CYP2C19 - Metabolism of -25% of all prescription drugs - Determine phenotype: poor, intermediate, extensive, or ultrarapid metabolizer • Intended to be an aid for physicians - Individualized treatment and dosage www.noche.com www.amplichip.us Strana 21 Úvod do molekulární medicíny 4/12 mikroRNA: nová úroveň regulace genové exprese mikroRNA čipy Proč se zabývat výzkumem mikroRNA? 196« Fr#nci? Crick ~.n:i Leslie Orgel prcpos-ed lhát RNA was the fir&t information molecule. 1990 Bot.irifni researcher* working with petunias discovered gene \il«ní iiiíj. 1970 4 1995 Gvc. gndl KtmptlUH L; M:>VL:H::: that dsRNA could lead to gene ijlenting while working on C etegans. 2001 Tom TuscM's group 3t the Ma* Planck Institute of Biophysical Chemistry d iscave red that *iK NA rnolatule-s cause • j _zzi-z riz ii• -• = • •== in mammalian cells- 1990 4:1995 100000 u J2 •9 80000 2000 u O Q. ' í J 60000 40000 20000 1977 Harry Noller proposed the roleof rRNA in translation of mRNA into prolein m n l i n l i i 1990-1992 The Human Genome Project was Initiated and sequence information began to increase exponent a I ly- 1998 Andy Fire and Craig Mell-o coined He lurni RNAi tor the gene silencing mechanism performed bydsRNA 1 noli:L 1111.'i ! 1 :\orr-\%. E ä q q q q q o p q p q p q p q q N N N N N N N N N N N N N N N Nature Biotechnology 21, 1441 - 1 4 4 6 (2003) microRNA microRNA & cancer 3.10.2020 PubMed - „MicroRNA AND Cancer" - 20 995 odkazů MicroRNA" - 60 724 odkazů1 Strana 22 Úvod do molekulární medicíny 4/12 Proč se zabývat výzkumem mikroRNA? The colorectal microRNAome Jordan M. Cummin*1 . Ylrtfnrj He*. Rethwa J, Learv1 , tav Pagllsrinlh , Lul? A, Dlaz, Ji.*, Tobias íjoblonť, Omer Baiad', 2vl Gentwlch1 , Anna L. W r a n s k a * , Emmanuel LabourieP, Christopher OayinoncT1 , Brian S. (tokens1 1 , H i r t i n u u u h l , Kenneth YV. Kinzler', Ben Vogelsteint , n r and Vlttor í. Velujlesťut , n FTJA-i | MiirhJ, JHK | LDL 103 | na 10 | HI7-KS2 A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets st»i*no volini**". G*nrje A.caiin*', crun^eong uu*. stoiariAmfci', Amen* cimiriini:'. Fji»iB peiroti**, Rut ViSDW*, M * * n * lorta*. Claudia KolOo*. Marmeia Ferritin1 , Rdiyn L. Pnielit', Hojumu VAiiAihjrj1 , Giovanni Lama1 , Akto Warpa. Andrea Vetdiion*", Maiiimo Heyrini1 , Oinit c. Kmrrlti, and Cart) M. C i w * " PNiS | February U. M M | vol. 103 | no. 7 | 325U1S1 A MicroRNA Signature Associated with Prognosis and Progression in Chronic Lymphocytic Leukemia George Adrian Calin, M.D.r Ph.D.. Manuela Ferritin, Ph.D., AmeliaCimmino, W.D., Ph.D., Gianpiero Di Leva, Ph.D., Masayoshi Shimizu, B,S.h Sylwia E. Woitik, M.Sc., Marileita V, lurio, Ph.D., Rosa Viswe, PU.D.. Hurettin lifer 5ever, Ph.D., Mullet Fabbri, M.D., Rodnlfo luliano, Ph.D.,Tiziana Palumbo, Ph.D., Flavia Pichkifri, Ph.D., Claudia Roldo, M.D.. Ramifu Garzonh M O , Onzia Sevignam, Ph.D., Laura Rassenti. Fti.D., Hait&juerg Alder, Ph.D., srefano Volinia, Ph.D., Chang-goris;. LI. Ph.D., ThomasKips:. M.D., Pn.D.r Massimo Negrini, Ph,D„ and Carlo M. Crow, M,D. M rHGLJ MED3£j:i7 WWWHEJN.GIG OCTGE-En 37. MIcrůRNA Gene Expression Deregul ation in Human Breast Cancer M:.irik'ii;L V . [ u r l ' i Muiiiii'ta 1Ť rrw.i ii..J t l i ; u ip-CumA L i u , ' A n w In \ t r o i i « t ' . J R i m i r ď * S p l i a u . ' üik'ia friihliHNii. ]ir™ M j g n V M j a H i n m E^MfrioJL M u l l e r 1-uliliri. \ L i n u c J j ( i o n i j i L J i i x . .Hilvi? ^ I c n u n d , ' J u u n P. L t i l j x v o . ' .-iniu1 H r K c i i h c r j i . 1 PILTCI MUKUIII.1 ' NLrliiiH) Vülinlj].' riiiln fti'iici,. f i n ? r ^ r JV r^iliiih i^Llri^i^i l|iiL1 rmnli. MLIHMIIK» Ni'prini. unci <"jirki W. CMK^1 CWMtr R H ÍMH: « . |1B|. Ai^bÉI 1S. S K B MicroRNA expression profiles classify human cancers . EzsquieI Alvarez-Saavedra-', Justin Lamb', David Peck'.iun L u u \ Gad Getz' \ Eric A. Mis-ka"' Alejandro Sweet-Corde ro1 *, Benjamin L. Ebert1 *, Raymond H. Ma Adolfů A.FĚrrando+ JamesR. Downing*, Tyler Jacks", H. Robert Horvitz3 & Todd R,Colubu , r •ft! 433(9 JuHE MOS *l^0,10n/nitn«T« MicmKMA ť\prwsfoti iilturdrioiis dře linked m timiim^nťsis titul Di>ii-nci>pliisti(.L processus in püiKTpatk Jut ml ;nlťnix1 \.minom;i Ah Vntlrunk*1 . I \ I L m u m ' . J Jiilliľ. i t .LIIIKU'. tí Sipi.>S". A MliplirKU-ll'. h l j J k a i r v r M and SA H a J i n u Orcogent (2007). 1-11 Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis Noiornu Yanaiharc.1 Natasha Ccplsn.2 Elrse Bowman.1 Masahiro Ssike.1 Kerwke KUTÍCÍ molo,1 Ming Yi.3 Robert U. Slepheni.3 Aikou CHíamolo.^ Jon Vokola^ Tadao TtjnůkQr J George Aďian Caín.^ Chorg-Go-ng Liuí Carlo i*. Croce* end Curtis C. Hcfris1 , 1 c*ncMciuj. -ftíHítMAiQimiiHQtEiiFviirííHC. ca 10.101^.03.3004.01.015 Strana 23 Craig Mello na slavnostním banketu po udílení Nobelových cen za rok 2006. Úvod do molekulární medicíny 4/12 Biogeneze a funkce mikroRNA Pri-miRNA Pre-miRNA Nucleus Exporting) Qu miRNA: miRNA* ™* -M duplex Unwind ir/Virrrrrrr ^ - " ' " ' n i i i i i n x u - i 1. Transkripce miRNA genu 2. pri-miRNA jsou zpracovány pomocí RNáz Drosha a Pasha 3. pre-miRNA exportovány pomocí Exportinu 5 do cytoplazmy 4. Zpracovaní pomocí RNázy Dicer Strana 25 Úvod do molekulární medicíny 4/12 microRNA: licensed to kill messenger 5. Aktivní vlákno je inkorporováno do komplexu RISC Biogeneze a funkce mikroRNA 6. Represe translace nebo degradace mRNA v závislosti na míře komplementarity miRNA: miRNA*-M_M duplex j Unwind J - ' - " ' " i f i i n i i i u i ~"""\n m siRNA duplex \ Asymmetric RISC assembly Some miRNA Ribosome Target mRNA RISC RISC Translational repression RISC mRNA cleavage Strana 26 Úvod do molekulární medicíny 4/12 Struktura mRNA - interakce regulačních oblastí Translational control Subcellular localization Stability Strana 27 Úvod do molekulární medicíny 4/12 J a k ý j e r o z d í l m e z i m i R N A a s i R N A ? Funkce obou je regulace exprese siRNAje původem dsRNA siRNA souvisí s cizorodou RNA (obvykle virovou) a je 100% komplementární miRNA je původně ssRNA, která formuje vlásenkové dsRNA struktury miRNA reguluje post-transkripční genovou expresi Cytoplasm jtliHNA* 1111 1 umíním min [jtjpijjx Ribosarrie Asymmetrie RISC Some aseemtjiy [mnimninir-i ^ rniRNA Tangrjt rtlRNA RISC RISC Translations! repression RISC m RNA cleavage He and Hannon, Nature Reviews Genetics, 2004 Úvod do molekulární medicíny 4/12 Základní fakta o mikroRNA miRNA poprvé popsal Ambros a kol. (1993) u C. elegans (lin-4) Přibližně 3% predi kovaných lidských genů jsou geny pro miRNA (> 1000 miRNA) miRNA mají potenciál regulovat asi 1/3 kódujících genů Některé miRNA jsou kódovány více než jedním genem Geny kódující miRNA jsou často klastrovány (klastr miR-17) Geny miRNA jsou lokalizovány v mezigenových oblastech v intronových oblastech nebo antisense řetězcích známých genů nniRNA family members can be very similar eg let-7 family:m m u 1 i n m u i t i m u r i n m u i n m u i n m u i n m u -let- -let- -letl e t - -let- -let• l í T - -let- 7a 7 t 7 d 7e 7 f 7 g • ~ i J G A G G U A G J A G G U U G J A U A S " J J U G A G G U A G J A G G U U G"JGU 3 G"J"J "JGAGGU A G J A G S U J G J A U S " J " J A G A G G U A G J A G S U U GC A U AS"J"J J G A G G U A G ; j A G 3 U U G J A U A S U J "JGAGGUAG~JAGAU~JG~JAUAS~J"J "JGAGGU AG"JAGUU"JG"JAC A S J J "JGAGGU A G J A G U U U G~JGC U G"J"J • ' • Pr:: rtliRNA miRNA gsnas Nucleus Cytoplasm idmirmlHNAdiipleii iOre-strand incorporated in:o R l i C ^TTTTTT TCTT-TT Tumor iuppreíMt gene Tflfgel niRNA in RNA Translalkiri inhibilion ***** /Tumor suppressor gene expression \ jQnnr Oncogens t Oncogene expression i Strana 29 Úvod do molekulární medicíny 4/12 Zapojení mikroRNA do Vogelsteinova modelu kolorektálního karcinomu NORMAL EPITHELIUM EARLY COLORECTAL CARCINOMA WNT pathway activation tGFR signaling activation TGFß response inactivation Loss o f PS 3 function L-MT, M M P 5, fCAM5 j ... Downstream activation tmiR-135 ß-tatenin ^míR-143, ^míR-LSa, J,lei7 TProíiferation V TProíiferation T Survival Loss of growth inhibitory effects ofTGFß DNA damage Oncogenic stress 4rmiR-34a-c Suppressed üpoptosis miRNA function? T Proliferation t m i R - 2 1 —I -i/ Epithelial gene expression ECIVI b r e a k d o w n EMT p r o m o t i o n T METASTASIS Slaby et al, Molecular (Cancer, 2009 Strana 30 Úvod do molekulární medicíny 4/12 Real-Time PCR - modifikovaná TaqMan technologie ke kvantifikaci miRNA miRNA RT primer Step 1: Stem-loop RT I 11 I 11 I 11 I I I I MINII cDNA Step 2: Real-time PCR VForward primer TaqMan probe Reverse prim er Strana 31 Úvod do molekulární medicíny 4/12 mikroRNA čipy Hybridizační čipy - analogická technológie jako u DNA čipu Ambion, Exiqon, Agilent, Affymetrix, Invitrogen NCode mJíVarH™ ml RNA LafelinaťJ r r ť . W " n-in Mŕ r-ijv 3*1 Real-Time PCR čipy Applied Biosystems Low density orrroys (LDA) microRNA array verze 2.0 (panel A+B) QuantiMir, SABiosciences, miRANDA *ÍÍÍÍJJ] LDA mikrofluidnf destičko (384 miRNA) r%fjrWPcfjr™ríÉa pum Probe 5*tio SIH? HHr.hWJ'HHHhhhWJH J llyhric svcrni^-f c-e Strana 32 Úvod do molekulární medicíny 4/12 Význam mikroRNA v nádorové biologii Rozdílné expresní profily mezi nádorovou a nenádorovou tkání Breast Colon Lung Pancreas ProstateStomach Hybridize and Analyze V o l i n i a e t a l . , PNAS, 2006 Shluková analýza 540 vzorků šesti druhů solidních nádorů a příslušných nenádorových tkání. Strana 33 Žlutá znamená zvýšenou expresi oproti kontrolnímu (nenádorovému) vzorku Biotechnologické společnosti zaměřené na miRNA diagnostiku Společnost Produkt miRNA Typ onemocnění Fáze vývoje MiRXES GASTROCIear Panel s 12 miRNA Nádor žaludku Dostupné miR-29b-1-5p miR-31-5p miR-138-1-3p miR-139-5p Interpace Diagnostics/Asuragen ThyraMIR/ThyGENX miR-146b-5p miR-155 Nádory slinivky a štítné žlázy Dostupné miR-204-5p miR-222-3p miR-375 miR-551b-3p Rosetta Genomics/Precision Therapeutics miRview mets Panel (neznámé) Identifikuje původ nádoru Dostupné Genoptix Reveal Panel (neznámé) Nádor štítné žlázy Dostupné TAmiRNA OsteomiR Panel s 19 miRNA Osteoporóza Dostupné TAmiRNA ThrombomiR Panel s 11 miRNA Kardiovaskulární onemocnění Dostupné Hummingbird Diagnostics - Panely (neznámé) Nádory, srdce, mozek Fáze I DiamiR CogniMIR Panel (neznámé) Alzheimer Fáze I DiamiR - Panel (neznámé) Onemocnění mozku Fáze I Mirnext - Panel s miR423-5p Srdeční selhání Preklinická fáze Quanterix/DestiNA Genomics Simoa miR-122 Jaterní toxicita Preklinická fáze Strategie v terapii pomocí mikroRNA '0-1^=0 o 4o O C H Suplementace nádorověsupresorových mikroRNA pre-mlkroRNA 3' o5' 3' miRNA mimic 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' O 3' 5' onkogennf mRNA •5' Inhibice onkogenních mikroRNA mikroRNA 5' 3' 5' 3 3' 5', mikroRNA "sponge" mikroRNA maska »' v 3' 3' 6 o base i. 0 • o t>-p=o ř-Cmetyl RNA LNA 3 5 ' 3' anti-mikroRNA kroRNA jako terapeutické cíle Výrobce Název léčiva Účinná látka Cílové onemocnění Klinická fáze Status Santa ris P h a r m a / R o c h e Miravirsen AntimiR-122 Hepatitída C Fáze II d o k o n č e n o RG-101 A n t i m i R - 1 2 2 C h r o n i c k á hepatitída C Fáze II d o k o n č e n o R e g u l u s RG-125 AntimiR-103/107 N e a l k o h o l i c k á steatohepatitida Fáze I probíhá R e g u l u s RG-012 L a d e m i r s e n T h e r a p e u t i c s RG-012 L a d e m i r s e n A n t i m i R - 2 1 D ě d i č n á nefritida Fáze II p r o b í h á A u t o z o m á l n ě d o m i n a n t n í RGLS4326 AntimiR-17 p o l y c y s t i c k é o n e m o c n ě n í ledvin Fáze I probíhá MRG-106 A n t i m i R - 1 5 5 Kožní T - b u n ě č n ý l y m f o m , m y k ó z a f u n g o i d e s Fáze II p r o b í h á m i R a g e n T h e r a p e u t i c s MRG-110 AntimiR-92 Poranění Fáze I d o k o n č e n o MRG-201 miR-29 m i m i c Keloidní jizvy / S c l e r o d e r m a Fáze II p r o b í h á Maligní m e z o t e l i o m EnGenelC T a r g o m i R s miR-16 m i m i c pleury; n e m a l o b u n ě č n ý k a r c i n o m plic Fáze I d o k o n č e n o Mirna T h e r a p e u t i c s MRX-34 miR-34 m i m i c Různé s o l i d n í n á d o r y Fáze I u k o n č e n o Inc. EnGen TargomiF - EGFR -u MPr -miR-1 Notjust a chemotherapeutic payload but delivering functional nucleic acids too • A Phase I trial in patients with end-stage mesothelioma and who had failed standard therapies was conducted with EGFR-EDVs loaded with a microRNA 16a. The mirl5/16 family is associated with unsuppressed cell growth when it is lost in malignant mesothelioma • Despite this trial being a safety trial, those patients who completed at least one cycle of EGFR-EDV-mir16a (16 out of 22 patients) showed a clinical response and median survival was much longer than expected in this group of patients at 41 weeks post commencement of EDV treatment (Kao et at., American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 191 (12): 1467-1469 (2015); Van Zandwijk et at, Lancet Oncology (2017) tana na EGFR adorove buriky 6 avazanymi mi protilatkami Hypotéza kompetujících endogenních RNA Conventional RNA logic 5 UTR CDS 3' u T n ceRNA logic \ T Ti4 * Ifk é microRNA ^ ľ ^ B MRE "The letters of the code" MRE string "The words" A B Competing RNAs Conventional UTR function cis coRNA function trans P e r t u r b a t i o n of R N A Y RNA Y (Downregulated) RNA Y (Steady state) AAA AAA C o n s e q u e n c e o n R N A X RNA X (Hyperrexpressed) RNA X {Steady state) ja®©.AAA RNA Y (Overexpressed) RNA X (De-repressed) AAA AAA V * AAA Nrf"*« AAA AAA AAA Expression levels RNA Y Sal mena etal., 2011 Úvod do molekulární medicíny 4/12 SNP čipy Za geneticky polymorfní je považován znak s nejméně dvěma geneticky podmíněnými variantami v jedné populaci, které se nachází v takových frekvencích, že i zřídkavá má frekvenci alespoň 1%. SNP = single nucleotide polymorphism, jsou jednonukleotidové polymorfní znaky Celogenomové mapy SNPs jsou dostupné ve webových databázích (~6 milionů) Mezi lidmi je přibližně 99,9% shoda v sekvenci DNA Zbývajících 0,1% nás činí jedinečnými (jak vypadáme, nemoci, kterými budeme trpět,...) Přibližně 1 SNP per 1.000 bp 90% genů obsahuje alespoň 1 SNP TGT TGT TGT TGT TGT TGT TGT TGT TGT TGT T G T G G T i T i T TGTGGTATATAl TGTGGTATATA TGTGTTATATA TGTGGTATATA TGTGTTATATA TGTGTTATATA TGTGGTATATA TGTGGTATATA TGTGT-ATATA Úvod do molekulární medicíny 4/12 Affymterix SNP čipy Mapping 10K array => Mapping 100K array => Genome-wide Human SNP array 5.0 (500K) => Genome-wide Human SNP array 6.0 (1.8 million) Figure 1: Overview of the Genome-Wide Human SNP Assay 5.W6.0. t rjspi t f Nip Nsi: I t t Sty I Sty I t Sty I RE digestion RE digestion Nsp adaptor ligation PCR: One primer amplification Sty adaptor ligation PCR: One prlm-ar amplification Umožňuje: Detekci SNP Počet kopií daného genu (amplifikace, delece, aneupoildie) Ztráta heterozygotnosti Complexity reduction cleanup Fragmentation and end-labeling I••. I;"'. hybridization and wash EIAA BB AB Úvod do molekulární medicíny 4/12 A f f y m t e r i x SNP čipy How the GeneChip" HuSNP™ Array Calls Genotypes -4 - 1 0 + 1 + 4 U M A U M A U U A U U A U U A p m A p w A p m A p m A ™a p m B p u B p « B p w B p u B M M B M M B u u B u u B U M B B Reference S e q u e n c e . Q t i T ü A T T A T í j g A C C TA C T A T Probe Sequence C C A C TA ATA C A T Q 0 A T G A T A Allele A c c A C T A A T A C T T G G A T G A T A C C A C TA ATA C C T G G AT G A T A M M A P M A P M B M M B AA É d i i : A • B • 1 BE • • IN; • • • Alely: AA, AB, BB • Intenzita signálu: počet kopií SNP Genomic DNA reference sequence A c Tiling QLianet PMA TTGCAGTGCAAG T ACAGTAAGCTCA MMA TTGCAGTGCAAG A ACAGTAAGCTCA PMB TTGCAGTGCAAG G ACAGTAAGCTCA MMB TTGCAGTGCAAG C ACAGTAAGCTCA I P M A M M A PMB MMB Strana 37 Affymterix SNP čipy AA É d i i : ISnier perfect match probes 3 ' T A T C G A T C C G C G A T C O F L J T C G A T C C T T A A C G A T C 5 ' 5 ' A T A G C T A G G C G C T A G T A O C T A O O C O C T A G C A G C T A G G C G C T A G C I G C T A G G C G C T A G C W A CTAGGCGCTAi TAGGCGCTA AOGCGCTA GGCGCTAGC TAGCTA GCGCTAGC EAGCTAG CGCTAGC TAGCTACG GCTAOCX AGCTAGGA CTAGCIAGCTAGGAA TAGCIAGCTAGGAAT AGC X AGCTAGGAATT OCIAGCTAGGAATTG CIAGCTAGGAATTGC IJAGCTAGGAATTGCT A G C T A G G A A T T G C T A G C T A G G A A T T G C T A G • 1 11 probes binding to the boxed target nucleotide • Alely: AA, AB, BB • Intenzita signálu: počet kopií SNP Genomic DNA reference sequence A CTiling Quartet PMA TTGCAGTGCAAG T ACAGTAAGCTCA MHA TTGCAGTGCAAG A ACAGTAAGCTCA PMB TTGCAGTGCAAG G ACAGTAAGCTCA MMB TTGCAGTGCAAG C ACAGTAAGCTCA IPMA MMA PMB MMB Úvod do molekulární medicíny 4/12 Take home Analýza čipových dat-pozadí, normalizace Analýza čipových dat - identifikace biologicky významných genů Analýza čipových dat -ukázky multidemenzionálních metod analýzy čipových dat - Shlukovacíanalýzy Analýza čipových dat - klasifikační metody Molekulární klasifikace nádorových onemocnění - ukázky Aplikace čipových technologií do klinické praxe - studie MINDACX Agendia, Roche AmpliChip CYP450 mikroRNA: nová úroveň regulace genové exprese mikroRNA čipy SNP čipy Naplň pristi prednášky Moderní metodické přístupy v molekulární medicíně II - proteomika (dvojrozměrná elektroforéza, hmotnostní spektrometrie, proteinové čipy), využití proteomiky v diagnostice nádorových onemocnění Molekulární epidemiologie - definice a vymezení oboru, identifikace molekulárních rizikových faktorů vzniku a rozvoje onemocnění, analýza vztahu molekulárních faktorů a vlivů prostředí na rozvoj nádorového onemocnění, význam molekulární epidemiologie u karcinomu plic a kolorektálního karcinomu Strana 38 Úvod do molekulární medicíny 4/12