1
Měření spektrálních charakteristik a stanovení koncentrace
DNA a proteinů
Spektroskopie v UV oblasti umožňuje stanovit koncentraci a čistotu biologických molekul.
Molekuly DNA mají absorpční maximum kolem 260 nm, molekuly proteinů kolem 280 nm.
Pro přímé spektrální určení koncentrace se využívá Lambert-Beerova zákona pro
monochromatické světlo, který lze zapsat ve tvaru A = c.ε za předpokladu, že měříme v 1 cm kyvetě
a známe extinkční koeficient ε, který má jednotku [M-1
cm-1
] pro molární koncentraci nebo [mL.mg-
1
cm-1
] pro koncentraci v mg/mL.
V případě, že neznáme extinkční koeficient, můžeme pro určení koncentrace DNA o vysoké
molekulární hmotnosti použít zjednodušeného předpokladu, že roztok dvouřetězcové DNA
o absorbanci 1 má koncentraci 50 µg/mL a pro převod na molární koncentraci nukleotidu DNA
pak vztah 320 µg/mL = 1 mM.
Materiál
• DNA (Salmon sperm; přibližná koncentrace = 7,2 mg/mL)
• Oligonukleotid CNF2_Bot (5´ GTTATCCTTTGAGGGTTTAG; přibližná koncentrace =
0,02 mg/mL)
• TE pufr
• Kyvety a spektrofotometr
DNA
1. Připravte roztok DNA v TE pufru ze zásobního roztoku tak, aby bylo možno přesně určit
koncentraci DNA.
2. Změřte absorpční spektrum DNA v rozsahu vlnových délek 220 až 350 nm.
3. Určete polohu absorpčního maxima.
4. Stanovte přesnou koncentraci DNA v zásobním roztoku z hodnoty absorbance naředěného
roztoku při 260 nm. Koncentraci vyjádřete v mg/mL.
5. Nařeďte roztok oligonukleotidu v TE pufru ze zásobního roztoku tak, aby bylo
spektroskopicky možno přesně stanovit jeho koncentraci.
6. Změřte absorpční spektrum v rozsahu vlnových délek 220 až 600 nm.
7. Nastavení přístroje Hach Lange DR6000:
Skenování vln.délky – Možnosti – λ - nastavit hodnoty min a max λ – OK – Nulovat -
Načítat
8. Na základě zadané sekvence oligonukleotidu stanovte extinkční koeficient 260
a spektroskopicky určete jeho koncentraci. Potřebné parametry lze získat na stránce
http://eu.idtdna.com/calc/analyzer
9. Změřte spektrum značeného oligonukleotidu ve stejném rozsahu vlnových délek
a porovnejte jej se spektrem neznačeného oligonukleotidu.
2
Komentář cvičitele Pavla:
Se spektrofotometrem jste se již všichni někdy setkali… Malé opakování: Kyvetu je dobré vkládat do
spektrofotometru stále ve stejné orientaci – z jiné strany je jinak poškrábaná, a to může ovlivňovat
měření. Pro správné měření absorbance je dobré být v rozsahu A = <0,2; 0,8>. Pokud budeme vzorek
ředit, je vhodné se pohybovat kolem hodnoty A = 0,5. Důležité jsou absorpční maxima pro jednotlivé
vlnové délky: 220 nm = anorganické kontaminace, 260 nm = DNA, 280 nm = proteiny.
-> Bude nutné ředit rozmraženou jednovláknovou DNA „CNF2_Bot“? Jaká je její skutečná koncentrace
[mg/mL]?
V zadání máme sekvenci a přibližnou koncentrace = 0,02 mg/mL.
Výstup z OligoAnalyzeru (dostupné z webu):
SEQUENCE 5'- GTT ATC CTT TGA GGG TTT AG -3'
COMPLEMENT 5'- CTA AAC CCT CAA AGG ATA AC -3'
LENGTH 20
GC CONTENT 40 %
MELT TEMP 47.9 ºC
MOLECULAR WEIGHT 6169 g/mole
EXTINCTION COEFFICIENT 191700 L/(mole·cm)
Kde nás zajímá molekulová hmotnost a extinkční koeficient.
Vycházíme ze základních vzorů:
𝐴 𝑜𝑝𝑡𝑖𝑚𝑎𝑙𝑛𝑖 ≈ 0,5 𝑛 =
𝑚
𝑉
𝑐 𝑚 =
𝑚
𝑉
𝑐 =
𝑛
𝑉
𝐴 = 𝜀 × 𝑐
Po dosazení získáváme:
𝑐 =
𝑐 𝑚
𝑀
=
0,02[𝑚𝑔/𝑚𝑙]
6169[𝑔/𝑚𝑜𝑙]
= 3,2𝜇𝑀 𝐴 = 𝑐 × 𝜀 = 3,2 × 10−6
× 191700 = 0,61
Z čehož je patrné, že naše vypočítaná teoretická hodnota absorbance leží v lineární oblasti absorbance
<0,2; 0,8>. Ze spektrofotometru následně odečítáme hodnotu A260 = 0,565. Zpětným výpočtem
získáváme:
𝑐 =
𝐴
𝜀
=
0,565
191700
= 2,95−6
𝑀 = 2,95𝜇𝑀 𝑐 𝑚 = 𝑐 × 𝑀 = 2,95−6
× 6169 = 0,018𝑔/𝑙 = 0,018 𝑚𝑔/𝑚𝑙
Když porovnáme přibližnou koncentraci 0,02 mg/mL se získanou hodnotou 0,018 mg/mL, vidíme, že je
vzorek méně koncentrovaný než před zamražením.
3
-> Druhá praktická část se týká měření dvouvláknové genomové DNA „Salmon sperm“; přibližná
koncentrace = 7,2 mg/mL.
U dvouvláknové DNA se využívá aproximace: A = 1 je dosažena u koncentrace DNA c = 50 µg/mL –
z tohoto budeme vycházet. Bude potřeba vzorek ředit? Pokud ano, kolikrát (abychom byli kolem
hodnoty A=0,5) + zaokrouhleme ředění na stovky. Jaká je skutečná koncentrace vzorku?
Ze zadání: c=7,2 mg/mL = 7200 µg/mL (abychom měli hodnoty koncentace ve stejných jednotkách)
𝑥
1
=
7200
50
𝑥 = 144 . . . . 𝑝𝑟𝑜 𝐴 = 1,0
pro A=0,5:
144
0,5
= 288x ředit -> budeme 300x ředit.
Kolik dáme čeho, když chceme 300x ředit do celkového objemu 1,0 mL?
1000𝜇𝐿
300𝑥 ř𝑒𝑑𝑖𝑡
= 3,33𝜇𝐿 Smícháme 966,6 µL TE pufru a 3,33 µL zásobní DNA.
Spektrofotometr nám ukázal hodnotu A260 = 0,504.
Jaká je skutečná koncentrace vzorku [µg/mL]?
Musíme zohlednit ředění, které jsme použili: Askutečná = 300 x 0,504 = 151,2.
Opět použijeme trojčlenku a nezapomene převést na správné jednotky:
151,2
1
=
𝑥
50
𝑥 = 7560 𝜇𝑔 /𝑚𝐿 = 7,56 𝑚𝑔/𝑚𝐿
Dle výsledku c = 7,56 mg/mL usuzujeme, že vzorek byl o něco málo koncentrovanější, než jsme očekávali.
A=1……………..c=50 µg/mL
x ……………..7200 µg/mL
A=1……………..c=50 µg/mL
151,2 ……………... x µg/mL
4
-> Třetí a poslední praktická úloha se týká změření neznámého vzorku DNA, lehce narůžovělé barvy, který
byl skladován ve zkumavce obalené alobalem.
Otázka: Co je na tomto vzorku zvláštní?
Změříme absorpční spektrum v závislosti na vlnové délce:
Vidíme maximum kolem 260 nm – což je bezpochyby naše DNA. Také vidíme druhé významné maximum
v 574 nm – co by to mohlo být?
Je to nějaký neznámý fluorofor – a podle tvaru křivky jsme dokonce schopni dokonce určit, jaký…
(je to Rhodamin Red).
Otázka: Záznam spektra absorbance v oblasti pro fluorofor odpovídá jaké křivce (excitační/emisní)?
A proč?
Nejdříve se zamysleme nad tím, co spektrofotometr měří – měří absorbanci. A co to vlastně ta
absorbance je, myslím z pohledu energie? Energie se nám ztrácí v kyvetě, když ji vzorek pohlcuje – což je
vyhodnoceno skrze úbytek intenzity záření a následně absorbance. Fluorofor nám pohlcuje energii, takže
pozorujeme excitační spektrum. Emisní spektrum by se měřilo v „L“ uspořádání kyvetového prostoru.