Stanovení koncentrace proteinů
Spektroskopie v UV oblasti umožňuje stanovit koncentraci a čistotu biologických molekul.
Molekuly DNA mají absorpční maximum kolem 260 nm, molekuly proteinů kolem 280 nm.
Pro přímé spektrální určení koncentrace se využívá Lambert-Beerova zákona pro
monochromatické světlo, který lze zapsat ve tvaru A = c.ε za předpokladu, že měříme v 1 cm
kyvetě a známe extinkční koeficient ε, který má jednotku [M-1
cm-1
] pro molární koncentraci
nebo [mL.mg-1
cm-1
] pro koncentraci v mg/mL.
Pro určení koncentrace proteinů spektroskopicky lze využít absorbance proteinů při 280 nm.
Jestliže známe primární sekvenci aminokyselin proteinu, lze extinkční koeficient vypočítat
http://www.expasy.org/tools/protparam.html. Ze změřené absorbance pak určíme koncentraci
proteinu.
Znalost extinkčního koeficientu není nutná v případě univerzální Bradfordovy metody.
Bradfordova metoda je v současnosti nejrozšířenější způsob určování koncentrace proteinu.
Bradfordova metoda využívá posunu absorpčního maxima „Coomasie Blue“ po vazbě na
protein. Na rozdíl od přímého spektroskopického stanovení se zde používá vlnová délka
595nm. Za použití kalibrační křivky se známou koncentrací proteinu lze určit skutečnou
koncentraci neznámého proteinu nebo směsi proteinů.
V obou případech stanovení dbejte na to, aby výsledná hodnota absorbance byla v oblasti
lineárního růstu absorbance – tato oblast odpovídá A = 0,3 – 0,7.
Materiál
• BSA (hovězí sérový albumin;  = 0.677 ml mg-1
cm-1
, MW = 66430; přibližná
koncentrace 5 mg/mL)
• TE pufr
• Bradford reagent (BioRad)
• Kyvety a spektrofotometr
Protein
UV spektroskopie
1. Připravte roztok BSA v TE pufru ze zásobního roztoku tak, aby bylo možno přesně
určit koncentraci BSA.
2. Změřte absorpční spektrum BSA v rozsahu vlnových délek 240 až 350 nm:
Nastavení přístroje Beckman DU®730:
Wavelength Scan – Options – λ – nastavit hodnoty min a max λ – OK – blank -
vzorek
3. Určete polohu absorpčního maxima.
4. Stanovte přesnou molární koncentraci proteinu BSA v zásobním roztoku z hodnoty
absorbance naředěného roztoku.
Bradfordova metoda
1. Odvážením BSA a vyředěním do TE pufru si připravte standardní kalibrační roztoky o
koncentracích 0.125 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.75 mg/mL, 1 mg/mL a 1.5
mg/mL.
2. Vezměte roztok reakčního Bradfordova činidla z lednice a nechte jej zahřát na
pokojovou teplotu a promíchejte.
3. Připravte roztoky blanku a standardů BSA o celkovém objemu 1mL do
mikrozkumavek tak, že do 980 µL reakčního Bradfordova činidla přidejte vždy 20 µL
TE pufru nebo 20 µL standardů.
4. Současně připravte stejným způsobem roztoky BSA o neznámé koncentraci pro jejich
stanovení.
5. Všechny roztoky dobře promíchejte a nechte inkubovat 5 min při pokojové teplotě.
Inkubace by neměla přesáhnout 1h.
6. Nastavení spektrofotometru Beckman DU®730: Protein Assay Analysis – Bradford
– Start – Standard Curve – Standards Setup - vypište hodnoty koncentrací standardů
od nejmenší přes Edit concentration – Done – změřte absorbanci blanku (ten si nechte
pro následný krok), poté standardů.
Změňte rovnici na Non-linear - Done
Výstupní hodnoty pro tvorbu kalibrační křivky:
c [mg/mL] 0 0,125 0,25 0,5 0,75 1 1,5
A 0 0,171 0,32 0,557 0,739 0,92 1,156
7. Změřte absorbanci blanku, jednoho standardu (pro kontrolu) a poté neznámých vzorků
a pomocí kalibrační křivky určete jeho koncentraci.