Vliv pH a teploty na spektrální vlastnosti fluoroforů
V tomto experimentu je ukázán vliv pH na fluorescenci a absorpci fluorescenční značky
fluoresceinu rozpuštěné ve stejné koncentraci v roztocích o různém pH. Je rovněž
demonstrován vliv teploty na intenzitu fluorescence.
Materiál
• Fluorescein - NIST-traceable standard - 50 µM (Molecular Probes, Invitrogen)
• Pufr 7 (50 mM fosfát sodný, pH 7.0)
• Pufr 9 (50 mM glycin, pH 9.0)
• Spektrofluorometr vybavený kryostatem (chlazenou vodní lázní)
• Kyveta
Postup
1. Připravte vzorky fluoresceinu 10000x naředěním roztoku NIST standardu jeho
přidáním 1,5 µL do 1499 µL roztoku pufru 7 a pufru 9 a následným naředěním
(150 µL 1000x zřeď. roztoku do 1350 µL příslušného pufru).
2. Změřte excitační spektra vzorků (nejdříve pH 9) při λ(em) = 515 nm
3. Změřte emisní spektra vzorků (nejdříve pH 9) při λ(ex) = 488 nm
4. Změřte spektra při 25 a 40°C (zahřátím vodní lázní).
Obr. 1: Vliv pH na excitační a emisní spektrum fluoresceinu.
Výsledky
Při změně pufru z pH 9 na pH 7 a při zvýšení teploty dochází ke snížení intenzity
fluorescence fluoresceinu.
pH9
pH7
Praktické poznámky
• Při měření zcela neznámého zředěného vzorku využíváme toho, že všechny
fluorofory můžeme excitovat v UV oblasti. Díky tomu můžeme pozorovat
fluorescenci různých fluoroforů na UV transiluminátoru.
U neznámého vzorku nejdříve změříme fluorescenční emisní spektrum s nastavením
excitační vlnové délky kolem 300-350 nm.
• Intenzita fluorescence fluoresceinu se mění se změnou pH, protože dochází ke změně
náboje fluoresceinu, tím se mění elektronový obal a potažmo absorpční a emisní
vlastnosti tohoto fluroroforu. Viz obrázky v dokumentaci Fluorescein NISTTraceable
Standard
• S rostoucí teplotou dochází ke snížení pravděpodobnosti přechodu elektronu
z excitovaného stavu do základního stavu vyzářením elektronu a naopak roste
pravděpodobnost uvolnění energie excitovaného stavu elektronu prostřednictvím
disipační energie = tepla.