Fluorescenční značení proteinu Fluorescenční značení proteinu bude provedeno za použití soupravy Alexa Fluor 594 Protein Labeling Kit. Proteiny značené tímto fluoroforem vykazují excitační maximum 594 nm a emisní maximum 617 nm. Alexa Fluor 594 je ve formě NHS (sukcinimidyl) esteru viz Obr. 1. Za použití následujícího postupu lze fluorescenčně naznačit 0.1 až 1 mg proteinu. Obr. 1 Alexa Fluor 594 Příprava proteinu Pro optimální efektivitu značení by měl být protein ve fosfátovém pufru bez amonných inontů a primárních aminů. V případě, že protein je v jiném pufru (Trisový, glycinový), je možno dialýzou pufr změnit. Materiál  Alexa Fluor 594 (ε alexa = 92 000 M-1 cm-1 )  Tmavá zkumavka s magnetickým míchadlem  Roztok proteinu ve fosfátovém pufru (TRF2, MW = 55 634, extinkční koeficient ε = 47 565 M-1 cm-1 , zásobní koncentrace 2 mg/ml)  1M roztok hydrogenuhličitanu sodného (NaHCO3, MW = 84), 1 ml  Fosfátový pufr (50 mM NaCl, 50 mM fosfát sodný, pH 7,0)  Kolonka s náplní Sephadex G-25  Kyvety  Spektrofotometr (Hach Lange DR6000) Značení proteinu 1. Do tmavé zkumavky napipetujte 500 ul proteinu o zásobní koncentraci 2 mg/mL. 2. Zkumavku s fluorescenční značkou nechte zahřát na laboratorní teplotu. Přidejte 50 µl 1M NaHCO3 do zkumavky s vysušenou značkou a promíchejte pipetováním nahoru a dolů. Odpipetujte do mikrozkumavky s proteinem a promíchejte pipetováním nahoru a dolů. 3. Vše nechte míchat v tmavé zkumavce s magnetickým míchadlem po dobu 30 minut při laboratorní teplotě zakryté alobalem. 4. 5-10 minut před koncem inkubace připravte kolonu pro separaci proteinu a nenavázané fluorescenční značky. Purifikace proteinu Náplň kolony Sephadex G-25 umožňuje gelovou filtrací oddělit nenavázanou fluorescenční značku od proteinu podle rozdílné velikosti a molekulové hmotnosti. 1. Kolonu umístěte do stojánku, odstraňte víčko a zátku a nechte obsah kolony vykapat. 2. Promyjte kolonu 5 ml fofátového pufru. 3. Opatrně naneste reakční směs proteinu a značky pipetou do středu kolony. Použijte 100 µl fosfátového pufru k vypláchnutí tmavé zkumavky s reakční směsí a opět naneste na kolonu. Roztok nechte zaputovat do kolony. 4. Po 1 ml přidávejte fosfátový pufr. Postupně jímejte frakce vytékající z kolony do mikrozkumavek po 1 ml. Po cca 2-3 ml začíná vytékat značený protein. Zachyťte značený protein do jedné frakce. A poté nenavázanou barvičku do jiné frakce. 5. Vzorek (frakci se zachyceným značeným proteinem) proměřte na spektrofotometru. Na základě absorpčního spektra určete, jaké množství proteinu bylo naznačeno a jaký je stupeň značení. Nastavení spektrofotometru: Skenování vln.délky – Možnosti – λ - nastavit hodnoty min a max λ (260-600 nm) – OK – vložte kyvetu s blankem – Nulovat – měřte jednotlivé vzorky– Načítat Případně: Možnosti – Stupnice a jednotky – manuál. – upravit rozsah osy Abs, aby byla maxima spektra dobře viditelná Určení koncentrace proteinu CF[𝑀] = A280 volné značky A594 volné značky ; CF je korekční faktor udávající příspěvek značky k absorpčnímu spektru Aprotein = A280 protein – (A594 protein ∙ CF) Cprotein [M] = 𝐴 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝜀 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 Výpočet stupně značení proteinu stupeň značení = A594 protein εAlexa 594 =92 000 Cprotein [M] 𝑉ý𝑡ěž𝑒𝑘[𝑚𝑔] = 𝑐[𝑀] ∙ 𝑀 𝑤 ∙ 𝑉[𝑚𝑙] obecně stupeň značení = molární množství značky molární množství proteinu = koncentrace značky koncentrace proteinu = A594 [protein] ε594 [alexa] Cprotein [𝑀] kde ε = 92 000 je molární extinkční koeficient značky Alexa Fluor 594 při 594 nm, C koncentrace proteinu v M a MW je molekulová hmotnost proteinu. Výsledky Zajímá nás: výtěžek (získané množství proteinu po značení) a stupeň značení.