PAGE sekundárních struktur DNA
Sekundárních struktury DNA jsou separovány při elektroforéze na základě celkové velikosti fragmentu, celkového záporného náboje a na tvaru. V této úloze bude separace ukázána na fragmentech telomerové D-loop (displacement) smyčky. Polyakrylamidová elektroforéza sekundárních struktur DNA bude provedena v předpřipraveném 8% nativním gelu, který obsahuje fluorescenční sondu Gel Red (Obr. 1). Po 30 minutové elektroforetické separaci bude gel se vzorky vyhodnocen na dokumentačním systému.
Materiál:
■ Čtyři zkumavky s různými DNA strukturami: A, B, C, D ®
■ 1x Hybridizační LiCI pufr (25 mM TRIS-HCI, 50 mM LiCI, 10 mM MgCI2, pH 7,5) (f)
■ 6x Nanášecí barvička s glycerolem (3)
■ Předpřipravený 8% polyakrylamidový gel s příslušnou aparaturou a laboratorním zdrojem
■ 0,5x TBE pufr (44,5 mM TRIS-HCI, 44,5 mM H3B03, 1 mM EDTA)
■ Transiluminátor
Postup:
■ V každé zkumavce ® (A - D) jsou 3 pikomoly DNA s různou sekundární strukturou v objemu 1,5 uL
■ Přidejte do každé zkumavky ® s předpřipravenou DNA 6 uL hybridizačního pufru (f) kvůli naředění vzorku za účelem lepšího nanášení na gel.
■ Přidejte do každé zkumavky ® potřebné množství barvičky (3), tak aby její konečná koncentace byla 1x (zásobní je 6x).
■ Do sestavené aparatury s 8% polyakrylamidovým gelem naneste jednotlivé vzorky
do příslušných jamek podle následujícího schéma:----— — — — — — —----
Ostatní jamky nechejte prázdné.
■ Zavřete aparaturu a spusťte běh gelu s nastavením elektroforetického zdroje na program: 50 V 10 minut, poté 10 mA 20 minut.
■ Po doběhnutí programu rozložte aparaturu, opatrně oddělte gel z prostoru mezi skly a pozorujte výsledek (na trasiluminátoru nebo na jiném elektroforetickém dokumentovacím systému).
DNA materiál:
Předchystané hybridizované DNA vzorky:
Zkumavka A: H vlákno	Zkumavka B: Hybridizovaná vlákna S+l 1 \
	
Zkumavka C: Hybridizovaná vlákna H+S	Zkumavka D: Hybridizovaná vlákna H+S+l X \
s	3 kompletní D-loop struktura
1
Sekvence jednotlivých vláken: ^^^^^^^^^^^
h : 5'-gtgaacctgcaggtgggcggctgctcatcgtaggttagtatcgacctattggtagaattcggcagc-3'
S: 3'-cacttggacgtccacccgS
1:5'- ctccagtcaggtacgtc
tcccaatcccaatcccaatcccaatt
ttagggttagggttagggttagggttac
ícgaccatcttaagccgtcg-5'
5c -3'
O,
X
5' GTGAACCTGCAGGTGGGC 3: CACTTGGACGTCCACCCG.
5
CGTAGGTTAG
\
^TGGTAGAATTCGGCAGC 3' ^.ACCATCTTAAGCCGTCG 5'
GGTTAGGGTTA£>
CCAATCCCAAT
Kompletní D-loop struktura po hybridizaci
8% polyakrylamidový gel:
■ Tloušťka gelu je 0,75 mm, s 15 jamkami. K přípravě byl použit (bis-)akrylamid (1:19).
■ Gel obsahuje barvičku „Gel Red Nucleic Acid Stain" (Biotium) - barví veškerou DNA v gelu.
■ Katodový i anodový pufr je 0,5x TBE pufr.
o
H2N
Obr. 1 Gel Red Nucleic Acid Stain
+
NH2 Acrylamide
O O N
H H N,N'-methylenebisacrylamide
Sj08     Persulfate ion
r
2SO/   Sulphate radicals
CONH2 CONH2 . CONH2 CONH2
/
H2C
\
CONH2 CONHTT        CONH2 CONH2
Obr. 2 Polymerizační reakce akrylamidu a bisakrylamidu.
2
Komentář cvičitele Pavla:
Důležité je si uvědomit, že se v případě sekundárních struktur DNA neřeší pouze migrace na základě celkové velikosti fragmentu a celkového záporného náboje, ale i na tvaru. Ten je zachován díky nativnímu akrylamidovému gelu.
Otázka: Proč byl použit zrovna (bis-)akrylamid (1:19), když tu máme i jiné poměry (1:37,5 či 1:29)? Respektive co nám tento poměr udává?
Tento poměr nám definuje hustotu pórů gelu - jak budou polymerizovat „řádky" a „sloupce". 1:19 je vhodný na separaci DNA, 1:37,5 je vhodný na separaci proteinů, a 1:29 pro směs DNA/protein, případně pro krátký peptid/protein.
-> Prvním vašim praktickým úkolem by bylo přidat ke vzorkům DNA pufr a nanášecí barvičku.
Otázka: Kolik bude potřeba přidat barvičky ke směsi, aby byla její výsledná koncentrace lx?
Máme 1,5 + 6 = 7,5 u.L a k tomu budeme přidávat 6x zásobní barvičku. 7,5/5 = 1,5 u.L barvičky přidáme.
Získáváte 9 ui vzorku, který byste nanášeli do jamek předpřipraveného gelu - smyslem bylo, abyste si vyzkoušeli nanášení vzorku do 0,75mm tlustého gelu - což není tak jednoduché, jak to vypadá. Mezery mezi vzorky jsou tam z důvodu přetékání vzorku, když to náhodou někdo nezvládl správně.
Proč se používají dvě různé kombinace nastavení elektroforetického zdroje (50 V 10 minut, poté 10 mA 20 minut)?
Naše vzorky nejdříve pomalu (= rovnoměrně) zaputovávají do struktury gelu a poté to zrychlíme.
Gely by se fotily na elektroforetickém dokumentovacím systému s UV transiluminátorem. 3 pikomoly DNA na jamku jsou hraniční množství, které jsme schopni na přístroji Fusion detekovat - někdy si musíme vypomoci s úpravou histogramu za účelem potlačení signálu pozadí.
-> Separace vzorků dopadla dle očekávání:
Nejjednodušší sekundární struktura putuje nejrychleji, naopak nejsložitější struktura má nejvíce potíží „protáhnout" se póry gelu a je tím pádem nejvíce zpoždóvána.
Doplňující otázka: Proč zkumavka B a D mají vyšší intenzitu bandu na gelu, než A a C?
„I" neboli „INV" vlákno je navíc značeno fluoroforem. UV záření z transiluminátoru ho částečně excituje a my ho tím pádem vidíme více intenzitní.
3