FRET–FLIM praktická ukázka na hybridizaci DNA Cíl: Demonstrace FRET (Försterův rezonanční přenos energie) fenoménu pomocí hybridizace DNA. Jednořetězcová DNA (single-strand) o velikosti 40bp je modifikována fluorescenční značkou Cy5 (akceptor) na svém 5‘ konci a fluorescenční značkou Alexa Fluor 488 (donor) na svém 3‘ konci. Samotné jednořetězcové vlákno je značně flexibilní, díky čemuž se jednotlivé fluorescenční značky přiblíží k sobě natolik, aby nastal jev FRET. Po přidání neznačeného komplementárního vlákna dochází k hybridizaci a vzniklá dvořetězcová DNA ztratí míru flexibility a nabyde prostorového uspořádání, kde se dva fluorofory od sebe vzdálí natolik, že pozorujeme vymizení FRET signálu. Demonstraci budeme měřit pomocí fluorescenčních spekter daných fluoroforů a také komplementárně pomocí FLIM (Fluorescence Lifetime), kde budeme pozorovat zvýšení času dohasínání donoru. Obrázek 1: Excitační a emisní spektrum fluoroforů Alexa Fluor 488 a Cy5. Vzorky a materiál: Značená jednořetězcová DNA o zásobní koncentraci 10 µM. Komplementární řetězec DNA o zásobní koncentraci 10 µM. Fosfátový pufr (50 mM NaPi, 50mM NaCl, pH=7). 100x ředěný roztok Ludox (koloidní silice). Přístrojové vybavení: Fluorimetr Fluoromax 4 s TCSPC měřící kartou, pulsním zdrojem a FLIM detektorem. Měřící kyvety. Postup měření:  Zapnout přístroj Fluoromax 4.  Zapnout měřící přístroj DeltaHUB a NanoLED (nechat klíček v poloze StandBy).  Zapnout PC.  Spustit program FluorEssence a inicializovat přístroj (ikona M).  Spustit program FluoroMax4USBLamp a vypnout lampu přístroje.  Naředit fluorescenčně značené DNA vlákno na finální koncentraci 100 nM o objemu 1,5 ml.  Napipetovat 1,4 ml zředěného roztoku Ludox do optické kyvety a umístit do měřící cely přístroje.  Spustit program DataStation, vybrat konfiguraci Fluoromax_PLUS_C, vybrat Emission 1 jako emisní monochromátor a S jako detektor. Zakliknout Use NanoLED Sample Chamber…  Vybrat měřící metodu Lifetime.  Otočit klíčkem na NanoLED přístroji do pozice ON.  Nastavit S detector na 950 V, Cout rate na 5000, emisní vlnovou délku na 456 nm a šířku štěrbiny 8 nm.  Zkontrolovat, že je krycí destička před detektorem přístroje, a ne detektorem lifetime.  Označit Prompt signál a spustit měření pro získání IRC signálu.  Napipetovat 1,4 ml zředěné fluorescenčně značené DNA do kyvety a vložit do přístroje.  Změnit emisní vlnovou délku na 515 nm (maximální emise donorového fluoroforu), ponechat šířku štěrbiny na 8 nm.  Přejmenovat signál Decay na DNA-ss a spustit měření. Zde sběr dat bude trvat podstatně déle než v případě měření IRC signálu. Dáno koncentrací a svítivosti fluoroforu.  Přejít do programu FluorEsscence, opět zapnout lampu přístroje a vyndat krycí destičku před detektorem přístroje. Vybrat měření emisního spektra s nastavením: excitace při 490 nm (maximální excitace donorového fluoroforu), měření rozsah emise 495-750 nm. Štěrbiny ponecháme na hodnotě 5 nm. Detektor nastavíme na měření S1/R1 signálu. Změřit dané spektrum.  Přidat 20 µl komplementárního řetězce DNA do kyvety a řádně promíchat. Inkubace 5min při RT.  Vypnout lampu přístroje, vložit krycí destičku před detektor přístroje, zkontrolovat předchozí identické nastavení pro měření lifetime. Přidat nový signál Decay a přejmenovat jej na DNA-ds a spustit měření. Uložit data.  Opět přejít do programu FluorEssence a dle identického nastavení v předchozím kroku změřit emisní spektrum.  Pomocí softwaru DAS6 analysis vyhodnotit lifetime data a porovnat změnu.  Porovnat změnu emisních spekter před a po hybridizaci DNA.  Diskuze výsledků. Užitečné informace: 𝑬 = 𝟏 − 𝝉 𝑫𝑨 𝝉 𝑫 , kde E je efektivita FRET přenosu, 𝜏 𝐷𝐴 značí dobu života fluoroforu donoru v přítomnosti akceptoru a 𝜏 𝐷 značí dobu života fluoroforu donoru bez přítomnosti akceptoru. 𝑬 = 𝑹 𝟎 𝟔 𝑹 𝟎 𝟔 +𝑹 𝟔 , kde R0 je Försterova vzdálenost při E rovno 50 %. R je reálná vzdálenost fluoroforů. V našem případě sledovaný fluorescenční FRET pár má hodnotu R0 = 60 Å. Jedna nukleotidová báze v DNA řetězci odpovídá přibližně 3,4 Å vzdálenosti.