INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVANÍ Fluorescenční mikroskopie při analýze organelové struktury buněk (Vitální barvení savčích buněk HEK293T fluorescenčním barvivem - FM 4-64 pro sledování endocytózy a SYTO 16 pro lokalizace DNA) Cíl praktické úlohy: Jednoduchá manipulace se savčí buněčnou linií HEK293T a její vitální barvení fluorescenčními barvivy, pozorování buněčných struktur fluorescenčním mikroskopem. Teorie: Název FM flurescenčnch markerů biologických membrán je odvozen od zkratky jména chemika, Fei Mao, který tyto sloučeniny vyvinul modifikací příbuzných sond (dimethylaminostyrylmethylpyridiniumiodine - DASPMI). FM tak patří mezi styrylová barviva (styryl dye), což je velká skupina sloučenin s barevnými vlastnostmi závislými na napětí. FM4-64 je amfifilní molekula, tzn. že má hydrofilní a hydrofóbní oblast (známá vlastnost stavebních prvků biologických membrán). Lipofilní část (konec, tail) je tvořena dvěma uhlovodíkovými řetězci na alkyl ováné styryl ové skupině. Pozitivně nabitá část je označována jako hlava sloučeniny (head). Jádrem molekuly je fluorofor se dvěma aromatickými kruhy spojenými dvojnými vazbami. Hydrofóbní oblast umožňuje zabudování barviva do membrány, pozitivně nabitá část brání dalšímu pronikání do lipidické dvojvrstvy a takovéto ukotvení a interakce vede ke změně jasu barviva (rozsvítí se). FM1-43 (MW612) N (3 tricthylammoriumpropy!)-4-(4-(dibutyl3mino)styryl)pyridinium dibromde (CH,CH2)3N*(CHj) iN.^A_CB.CH_/jA_ N[(CH2)3CH3]2, 2Br- FM4-64(MW608) N-{3-ülelhylammoniumpfopyl)-4-(6-(4-(dibutylamino)phenyl)hexatr»nyl)pyrKlinium dibromide (CH3CH2)3I N*(CH2)3N*-^ \-(CH=CH)3-^ ^— NICHjCHjJj, 2Br- Heslovitě o FM: - membránové markery využívané pro sledování endocytózy a exocytózy. - Rozpustné ve vodě - Netoxické pro buňku (pro vitální barvení) - Vmezeřují se do vnější vrstvy cytoplazmatické membrány - Teprve po začlenění do membrány intenzivně fluoreskuj i - Nespecifická fluorecence může být odstraněna oplachem před detekcí - Analogy (FM2-10, FM5-95...) se liší ex/em spektry, stupněm polarity, stupněm signálu pozadí, doporučenou pracovní koncentrací, rychlostí zabudování do membrány atd. 350 400 450 500 550 600 650 700 750 Wavelength |nm) i j l I j i 3» 400 450 500 SSO 600 650 700 '50 800 850 Wtwkngth |ntn) Compound Properties Cati Dye Unit Size MW Ex Em T3163 FM= 1-4? t 1 mg 61- 55 510 526 T35356 FMS 1-431 10x100 vQ 6r 55 510 626 • 35355 •Vi: I-43FX 10» 10: jg 565 09 510 526 T7508 FM»M0 5 mg 555.44 506 620 T3166 FMS 4-64 1 mg 607.51 555 754 '13320 FM* 4-64 10* 100 pg 607.51 555 734 F34653 FM2 4-64FX 10* 100 )jg 788.75 565 744 T23360 FMS 5-95 1 mg 565.43 560 734 life I tec technologies- | éinvítrogeiT INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVANÍ Pro vitální fluorescenční barvení DNA bude použito cyaninové barvivo SYTO 16 (detaily jako chemický vzorec a strukturu výrobce neuvádí). Heslovitě o SYTO 16 - Chemické složení výrobce neuvádí - Selektivní barvivo nukleových kyselin (DNA i RNA) - Pasivně proniká biologickými membránami - Jsou využívány pro in vivo barvení i fixované preparáty - Nízký kvantový výtěžek pokud nejsou navázány na nukleové kyseliny - Naopak velký kvantový výtěžek, pokud jsou navázány na NK - Dostupné analogy s velkým výběrem em spekter (od modré až do červené) - Analogy se liší permeabilitou, DNA/RNA selektivitou, vazebnou afinitou atd. - Eukaryotické buňky vykazují silné jaderné barvení a slabší cytoplasmatický difúzni signál, mohou obarvit mitochondrie - Využívají se při detekci apoptózy, multidrug-resistant buněk Linie buněk HEK293T Jedná se o lidské buňky jejichž zkratka znamená Human Embryonic Kidney Cells. Je to tedy specifická buněčná linie originálně odvozená z lidských embryonických buněk ledvin rostoucí v tkáňové kultuře. HEK293T buňky jsou v biologickém výzkumu velmi rozšířené po mnoho let, a to především díky jejich stabilnímu a spolehlivému růstu a jednoduchosti pro transfekci. Jedná se o adherentní buňky což je předurčuje k jednoduché kultivaci na krycím sklíčku pro následnou mikroskopickou analýzu. Fluorescenční mikroskopie: Princip každého fluorescenčního mikroskopuje schopnost excitace preparátu pomocí světla o určité vlnové délce a snímání světla jiné vlnové délky díky vzniklé fluorescenci. Základními a nutnými komponenty j sou především excitační filtr, který dokáže filtrovat (vybrat) vhodnou část spektra ze světelného zdroje. Poté srdcem je dichroické zrcadlo, které excitační světlo odrazí na preparát, kde vznikne fluorescence a toto záření už dichroickým zrcadlem projde, následně je ještě filtrováno pomocí emisního filtru, který přesně vybere oblast spektra vzniklé fluorescencí, a to finálně dopadne na detektor. Schéma fluorescenčního mikroskopu znázorňuje Obrázek 1. 400 450 500 550 600 650 700 Wavelength (nm) INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVANÍ detector t objective specimen Obrázek 1: Schéma fluorescenčního mikroskopu. Postup: SÝTO 16 - lmM zásobní roztok v DMSO (ředit 1250x) FM 4 - 64 10 mM zásobní roztok v DMSO (ředit 500x) 1. Odeberte DMEM medium z buněčné kultury. 2. Promyjte buňky 2x s PBS pufrem, vždy inkubujte cca 2min. 3. Nechte buňky v PBS pufru. 4. Připravte si Petriho misku s vlhkým filtračním papírem a parafilmem. 5. Přidejte 8ul vyředěného barviva SYTO 16 na parafilm. 6. Přidejte 8ul vyředěného barviva FM 4-64 do stejné kapky na parafilm. 7. Opatrně přiložte krycí sklíčko na kapku barviv (buňky směrem dolů). 8. Inkubujte cca lOmin v temném prostředí. 9. Přidejte 7ul montovacího média (Mowiol) na podložní sklíčko. 10. Opatrně přiložte krycí sklíčko na kapku montovacího média (buňky směrem dolů). 11. Pozorujte preparát pomocí fluorescenčního mikroskopu.