oligo •Komentujte prosím výstupy z programu Oligo •Na snímcích 2, 3, 4 a 5 porovnejte, který ze dvou uvedených výpisů charakterizuje kvalitnější primer/y •Uveďte proč a komentář zapište přímo do snímku •Na pozitivním vlákně sekvence Arabidopsis thaliana na snímku 7 vyberte manuálně forward a reverse primer předepsané délky v označené pozici, vypište sekvenci obou primerů 1 Sekundární struktury 2 Falešné nasedání 3 Score / Priming Efficiency 4 PCR parametry 5 6 Terminologie primerů červené + vlákno modré - vlákno Nasedání primerů Příklad manuálního výběru dvojice primerů z + vlákna. Aplikujte tento příklad v úloze zadané na snímku 7. na + vlákně čteme zprava doleva a komplementárně 7 Vyznačte na části + vlákna sekvence Arabidopsis thaliana forward a reverse primer dle označení: yyyyFxx forward primer (yyyy = pozice 5´- konce primeru) zzzzRxx reverse primer (zzzz = pozice 3´- konce primeru) (xx = počet bazí primeru) Každá skupina bude označovat přímo v přiložené sekvenci jiné primery. Skupina 1: 49682F21 49845R18 Skupina 4: 49629F20 50071R19 Skupina 2: 49754F19 49920R20 Skupina 5: 49765F21 50075R22 Skupina 3: 49828F22 50072R19 Skupina 6: 49830F19 50080R21 Zde prosím vypište sekvenci vybraného forward a reverse primeru od jeho 5´- konce. Forward: 5´.…………………………………………….................... 3´ Reverse: 5´.……………………………………………..................... 3´ 8 Syntéza a purifikace PCR primeru •Komentujte prosím následující snímky •Komentář zapište přímo do snímku New Campus_07 EXPEDITE 8909 Syntéza začíná od 5´ / 3´- konce primeru Syntézy se účastní / neúčastní polymeráza Syntéza probíhá ve vodném / nevodném prostředí Označte správnou odpověď: 9 Průběh syntézy (histogram) Vysvětlete, proč první histogram zaznamenává úspěšnou syntézu a druhý nikoliv. 10 Zde vyjádřete zadaný výtěžek ve všech uvedených jednotkách: ………………………………OD ……………………………… mmol ………………………………mmol/L Každá skupina bude počítat s jiným výtěžkem syntézy. Skupina 1: 10 OD Skupina 4: 9 OD Skupina 2: 12 OD Skupina 5: 14 OD Skupina 3: 15 OD Skupina 6: 11 OD Extinkční koeficient vybraného oligonukleotidu: e = 270.2 Molekulová hmotnost vybraného oligonukleotidu: MW = 8741.795 Vypočtěte, v jakém objemu je třeba rozpustit výtěžek, abyste dostali zásobní roztok o koncentraci 500 mM: ………… mL rozpustíme-li výtěžek v 1 mL oligonukleotid je po syntéze vysušen, ale pokud by byl následně rozpuštěn v 1 mL: 11 Purifikace syntetického primeru Odsolení gelovou chromatografií na Sephadexu nebo afinitní chromatografie na cartridge: New Campus_28 nízkomolekulární látky n-1 primer Sephadexová spin kolonka afinitní cartridge Spojte čárou, které nečistoty jsou po syntéze z primeru odstraněny na Sephadexu a které vazbou na afinitní cartridge. 12 Chromatografická kontrola kvality nasyntetizovaného primeru Chromatogram surového primeru je označen černě, chromatogram odsoleného primeru je označen červeně (DE, desalted). Definujte u prvního obrázku, co bylo ze surového primeru odstraněno gelovou chromatografií, a odhadněte, jak se změnila koncentrace purifikovaného primeru ve srovnání se surovým. Syntéza primeru je OK Syntéza primeru není OK 13 Nevyplněný vzorový protokol C7301 Základy genomiky - cvičení DESIGN, SYNTÉZA A PURIFIKACE OLIGONUKLEOTIDŮ je vložen do ISu (Manipulace se studijními materiály) pod názvem Protokol a SYNTEZA-TEAMS_12-2021.pptx. Vyplňte. Kompletně vyplněné protokoly (jeden protokol za každou dvojici) prosím odešlete ve formátu pdf do středy 15.12.2021 na adresu hanak@sci.muni.cz. Děkuji. Ohledně připomínek k odevzdanému protokolu vás budu jednotlivě kontaktovat mailem. Teprve po vyřešení všech dotazů a výslovném odsouhlasení správnosti protokolu budu považovat tuto část cvičení pro konkrétní dvojici za ukončenou. Děkuji vám za účast v C7301: DESIGN, SYNTÉZA A PURIFIKACE OLIGONUKLEOTIDŮ. Hana Konečná