u r j i SCI GENOVÉ TECHNOLOGIE Úvod: Chemická struktura nukleových kyselin, transkripce a její regulace o prokaryot (sigma factor, LAC operon, aktivátory a represory) a eukaryot (zesilovače transkripce, epigenetika), translace a její regulace u prokaryot a eukaryot. 1 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod Sylabus 1. Chemická struktura nukleových kyselin, transkripce a její regulace o prokaryot (sigma faktor, LAC operon, aktivátory a represory) a eukaryot (zesilovače transkripce, epigenetika), translace a její regulace u prokaryot a eukaryot. 2. Modelové organismy využívané v biotechnologii - bakterie (E. coli), kvasinky {Pichia, Saccharomyces) a houby {Penicillium), Caenorhabditis elegans (háďátko), Drosophila melanogaster, Danio rerio (Dánio pruhované), myš domácí, živočišné buněčné kultury, Arabidopsis thaliana (Huseníček rolní), viry (bakteriofágy, retroviry). Replikace DNA u eukaryot a prokaryot, opravné procesy, in-vitro syntéza DNA (PCR, reverzní transkripce). 3. Základní technologie rekombinantní DNA - enzymy, vektory, metody transformace, konstrukce genových knihoven. Techniky pro editaci genomu (ZFNs, TALENs, CRISPR). 4. Rekombinantní proteiny - exprese proteinů v bakteriích (klonovací strategie, použití kodónů, omezení toxických efektů v důsledku nadprodukce, zvýšení stability a sekrece, glykosylace), exprese proteinů v eukaryontních buňkách (kvasinky, hmyzí buňky, savčí buňky), výhody a nevýhody jednotlivých expresních systémů 5. Genomika a genová exprese - techniky mapování genů, nekódující části genomu, bioinformatické nástroje, farmakogenetika, DNA mikroarrays, RNA-seq techniky, metagenomika, epigenetika. 2 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod MU MI SCI Sylabus 6. Technologie založené na RNA - rozdělení RNA, význam ne-kódujících RNA, antisense RNA a umlčování genů, ribozymy 7. Technologie v imunologii - protilátky (struktura, funkce), cílený návrh protilátek, monoklonální protilátky, ELISA, vakcíny (tvorba a výroba, identifikace potenciálních nových antigén, DNA vakcíny) 8. Transgenní rostliny - tkáňové kultury, genetické úpravy rostlin (Ti plazmid), funkční genomika, biotechnologické aplikace. Transgenní zvířata - techniky tvorby, metody kontroly exprese transgenu, aplikace RNA-technologií, příklady transgenních zvířat. 9. Genová terapie - vrozené defekty u vyšších organismů, identifikace vadných genů, obecný princip genové terapie, genová terapie pomocí retrovirů a adenovirů, agresivní genová terapie, využití RNA v rámci terapie, cílená editace genů. 10. Nanotechnologie - nanočástice, kvantové tečky, DNA origami. M U NI GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod n n T o U J. Struktura nukleových kyselin - DNA a RNA - polymery skládající se z podjednotek nazývaných nukleotidy - Nukleotid - fosfátová skupina, cukr (ribóza, deoxyribóza), báze (A,G,C,T,U) - Fosfát propojuje dva cukerné zbytky pomocí fosfodiesterové vazby - Nejvíce stabilní struktura - dvou řetězcová molekula DNA v anti-paralelní orientaci vláken (dvoušroubovice) - Purinové báze se párují s pyrimidinovými (A-T, G-C, A-U) pomocí vodíkových vazeb; G-C pár stabilnější díky třem vazbám MUNI 4 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod n n T U l 1 Struktura nukleových kyselin nwcnjM c i nm RIBOSC OH 1 ^■^■^■r H Clark and Pazdernik, 2016 5 GENOVE TECHNOLOGIE - Uvod MUNI SCI Analogy bází nukleových kyselin - Lock Nucleic Acid (LNA), Bridged Nucleic Acid (BNA) - 2'-0 a 4'-C atomy kruh ribózy jsou spojeny pomocí methylenového můstku - Fixace kruhu ribózy v optimální konformaci pro Watson-Crick párování - Pár se rychleji tvoří a má vyšší stabilitu - LNA oligonukleotidy jsou ideální pro detekcí krátkých nebo velmi podobných cílů v rámci DNA/RNA - Vyšší specifita sond v rámci qPCR (detekce SNPs), jedinečné rozlišení mikroRNA rodin, vyšší stabilita (in vitro/in vivó), velmi účinná inhibice malých RNA in vivo. GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod Analogy bazi nukleových kyselin H2N - Peptide Nucleic Acids (PNAs) - Nielsen et al., Science, 1991 - DNA analogy, fosfodiesterová vazba je nahrazena N-(2-aminoetyl)glycinem - Syntetická kostra - jedinečné vlastnosti v rámci hybridizace - PNA je nenabitá = v rámci hybridizace nedochází k elektrostatické repulzi = vysoká stabilita PNA-DNA, PNA-RNA duplexů - PNA hybridizuje nezávisle na koncentraci solí v roztoku - Nedochází k degradaci PNA pomocí nukleáz nebo proteáz a nejsou rozpoznávány polymerázami - PNA se může vázat v anti-paralelním i paralelním uspořádání, tvořit triplex (Hoogsteenovo párování) MUNI 7 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod n n T o U J. Peptide Nucleic Acids (PNAs) Watson-Crick Hoogsteen 8 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod MUNI SCI Peptide Nucleic Acids (PNAs) Použití PNAs in vivo limituje nízký prostup do buněk - spojení s DNA oligomery, ligandy receptoru nebo peptidy penetrujících do buněk Využití PNA: - specifické doručování do jádra - využití v rámci PCR a Q-PNA PCR - vazba nukleových kyselin (DNA/RNA - capture) hybridizační techniky (PNA-FISH) Duplex invasion Double duplex invasion Triplex Pellestor et al. 2004 D-loop Triplex invasion GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod M U NI SCI Konformace DNA - Pravotočivá dvoušroubovice, 1 otáčka cca. 10 páru bazí, 34 Á | - Může zaujímat různé konformace: B-forma - nízká koncentrace solí (10 bp/otáčku) A-forma - vysoká koncentrace solí (11 bp/otáčku) Z-forma - levotočivá dvoušroubovice (12 bp/otáčku) 10 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod G-kvadruplexy - Tvorba v G-bohatých oblastech - Struktura stabilizovaná Hoogsteenovým párováním a monovalentním kationtem (K+ > Na+ >Li+) - Čtyř-řetězcová nekanonická struktura DNA - Klíčové funkce v transkripci, replikaci, stabilitě genomu a epigenetické regulaci - Význam v léčbě nádorů (použití molekul stabilizujících strukturu G4) - Objevena celá řada proteinů interagujících specificky s G4 Spiegel et al. 2020 11 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod MU MI SCI Sbalení nukleových kyselin Lk° dffffXXX\ f , j + gyrase (+) coil wrapped by gyrase K ■ CROSS _ INVERSION by gyrase jf S Vy7 Lk°-2 \ I Ik" Vi RELEASE i if f / i V/ CI L compensatory free (-) coil ATP ADP + P - Molekula DNA je příliš dlouhá - nutná kondenzace - U bakterií dochází k nadšroubovicovému vinutí (supercoiling) pomocí enzymu DNA gyrázy (levotočivé zkroucení) - Rozvolnění kondenzované struktury pomocí topoizomerázy I - U eukaryot je DNA navinuta na histony nesoucí kladný náboj - chromatin Nukleozom se skládá z cca. 200 bp a devíti proteinů (H2A (2x), H2B (2x), H3 (2x), H4 (2x) a H1) - Chromatin je dále stočen do helikální struktury (30-nm vlákna, 6 nukleozomů/otáčku) - Vlákna jsou přichycena na chromozomální ose pomocí tzv. "matrix attachment regions" (MAR) - MAR mají cca. 200-1000 bp a jsou bohaté na A/T 12 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod Lk < Lk° o free (-) coils MUNI SCI Sbalení nukleových kyselin Bakterie Eukaryota 13 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod MUNI SCI Centrální dogma molekulární biologie Klíčové vlastnosti živých tvorů - schopnost reprodukovat vlastní genom - tvořit vlastní energii - Nutnost organismů vyrobit proteiny kódované v rámci své DNA - Proteiny - tvorba energie, kontrola replikace, vnitro- a mezibuněčná komunikace - Centrální dogma molekulární biologie: DNA je přepisována do RNA, která je následně překládaná do proteinů DNA (double-stranded) TRANSCRIPTION RNA (single-stranded) TRANSLATION Protein (linked amino acids) REPLICATION OF DNA V-/ Clark and Pazdernik, 2016 14 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod MUNI SCI Transkripce - Tvorba kopií RNA na základě DNA kódu - Zahrnuje: - rozvinutí DNA - rozpletení vláken na počátku transkripce - odstranění histonů - tvorba RNA pomocí enzymu RNA polymerázy (5'—>3'procesivita) - "Housekeeping" geny přepisovány kontinuálně - Indukovatelné geny přepisovány jen za specifických podmínek (lac operon) - Výsledný kódovaný produkt - protein (mRNA), RNA (tRNA, rRNA, snRNA, ribozym) - Cistron (strukturní gen) - kódující oblasti genů pro proteiny nebo ne-translatované RNA - Otevřený čtecí rámec (ORF) - úsek DNA kódující protein nepřerušený STOP kodónem 15 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod MU MI SCI Transkripce Každý gen má před kódující sekvencí promotor Bakteriální promotory - oblast -10(TATAA) a -35(TTGACA) Konstitutivní geny - velká shoda DNA Řízené geny - aktivační proteiny/transkripční faktory Transkripce: - Místo začátku transkripce - 5'netranslatovaná oblast (5'UTR) - vazba ribozómu - otevřený čtecí rámec (ORF) - vlastní protein - 3'netranslatovaná oblast (3'UTR) - regulace míry translace Transcription start w Promoter 5' UTR mRNA 5' UTR ORF TRANSCRIPTION ORF TRANSLATION Transcription stop 3' UTR' 3' UTR Clark and Pazdernik, 2016 16 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod IDIUMI SCI RNA polymeráza - Složená s několika podjednotek - sigma podjednotka - rozpoznání oblasti -10 a -35 - vlastní enzym katalyzující syntézu (5'—>3') 5' 5' ■ Growing mRNA chain Transcri| bubble - Enzym má pět podjednotek (2 x a, (3 a P', co) - (3 a p' - vlastní katalytické místo - a podjednotky napomáhají rozpoznat promotor - Po vazbě RNA polymerázy - tvorba transkripční bubliny - RNA polymeráza používá nekódující řetězec (antisense) - Sekvence RNA shodná s kódujícím řetězcem - RNA syntéza začíná od purinu obklopeného pyrimidiny (CAT, CGT) - Rychlost syntézy 40 bazí/sekundu Direction of synthesis Clark and Pazdernik, 2016 17 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod M U NI SCI Au pstream Nontemplate strand downstream -54 5' (>•• 3' B -35 element 18 GENOVE TECHNOLOGIE - Uvod -10 element Template strand Jie Chen et al. PNAS 2010;107:28:12523-12528 MUNI SCI Ukončení transkripce - Transkripce je ukončena terminačním signálem - Rho-nezávislý terminátor - typicky GC-bohatá vlásenka následovaná poly-T místem - RNA polymeráza většinou odpoutá v polovině poly-T sekvence - Rho-závislý terminátor - obsahují dvě obrácené vlásenky - Rho je homohexamerní RNA závislá ATPáza - váže se na C-bohatou oblast před místem terminace - pohybuje se po RNA dokud nedostihne RNA polymerázu u vlásenky 20 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod p recognition site (rut) Htv Ufert Terminator p recognition site In RNA p protein binds to the rut site In RNA and moves toward the 3' end. p protein antiterminator stem loop MUNI SCI Organizace chromozómů Prokaryota - vzdálenost mezi geny malá - geny jedné metabolické dráhy vedle sebe (operon) - polycistronní mRNA Eukaryota - monocistronní mRNA - u polycistronní se přepisuje pouze první cistron EUKARYOTES PROKARYOTES 21 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod Promoter°"m'lu'a' DNA Promoter Structural genes gene m^^^^mm -^^^^m- |_Operon_| Monocistronic mRNA TRANSCRIPTION cistronic mfl TRANSLATION + + + or or £A Single protein Several proteins Clark and Pazdernik, 2016 MUNI SCI Transkripce u Eukaryot - Účast tří RNA polymeráz: - RNA polymeráza I (transkripce velkých ribozomálních RNA) - RNA polymeráza II (transkripce genů kódujících proteiny) - RNA polymeráza III (transkripce tRNA, 5S rRNA, malé RNA) - RNA pol. II potřebuje pro transkripci: - iniciační box, TATA box, elementy vázající transkripční faktory - základní transkripční faktory - specifické transkripční faktory RNA polymerase III GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod - TATA box protein (TBP) iRNAs SS rRNA. snRNAs. scRNAs Aktivace RNA polymerázy II - TFIID—>TFIIB —>RNA pol. II/TFIIA —>TFIIF -VrFIlEJFIIJJFIIH - TFIIH fosforyluje RNA pol. II - TFIIH zůstává asociovaný s RNA polymerázou II Upstream control element Table 2.1 General Transcription Factors for RNA Polymerase II TB F binds to TATA box, part of TFIID TFIID includes TBP, recognizes Pol II specific promoter TFIIA binds upstream of TATA box; required for binding of RNA Pol II to promoter TFIIB binds downstream of TATA box; required for binding of RNA Pol II to promoter TFIIF accompanies RNA Pol II as it binds to promoter TFIIE required for promoter clearance and elongation TFIIH phosphorylates the tail of RNA Pol II, retained by polymerase during elongation TFIIJ required for promoter clearance and elongation 23 GENOVE TECHNOLOGIE - Uvod TATA box Initiator box —►Transcription +1 start site DNA binding domain Upstream control element Clark and Pazdernik, 2016 MUNI SCI Regulace transkripce u prokaryot - Zapojení aktivátorů a represorů transkripce - aktivátory - pozitivní regulace - represory - negativní regulace - Vazba na promotorovou oblast DNA Blokace vazby RNA polymerázy nebo počátku transkripce - Většina genů je kontrolována kombinací faktorů - Regulační proteiny mohou zpomalovat elongaci nebo ji předčasně ukončit - Anti-terminátorové proteiny obchází místo ukončení transkripce - Klíčová role různých sigma (a) podjednotek - s70 (RpoD) - rozpoznává většinu house-keeping genů - s32 (RpoH) - aktivace genů souvisejících s teplotním šokem (chaperoniny a proteázy) MUNI 24 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod U l 1 transcription i in Teplotní šok 140 —u V House-Keeping o factor Sigma-7i Native protein region B G—C* ZO A—u u • G ,aGc „cau<; "ug UUGUc, ^GCuGft A C_^CGc := 4'/ GGG"e."" XCGUA region A translation Inactive, unstable.degraded FtsH.HslU V, Clp AP,Protease 25 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod stability activity G-C C-G U-G C-G AllAUUG-CUAy t*1 \gc« I A I 5' I a32 protein I rj 32 + RNA polymerase DnaK DnaJ GrpE HfIB MUNI SCI Laktózový operon - Regulační proteiny transkripce existují v aktivní (vázající se) a inaktivní (nevázající se) formě - Přechod mezi jednotlivými formami vazbou signálních molekul nebo induktorů - lac operon = polycistronní - lacZ (p-galaktozidáza), lacY (laktóza permeáza), lacA (laktóza acetyláza) - lad = represor lac operonu, kódován v opačném směru - Promotor obsahuje lacO vazné místo (operátor) a Crp místo pro vazbu CRP proteinu (cAMP receptorový protein - V případě nedostatku glukózy a přítomnosti laktózy: - zvýšená hladin cAMP - tvorba alolaktózy (analog isopropyl-thiogalaktozid, IPTG) pomocí (3-galaktozidázy 26 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod Structural gene Terminator Regulatory regionStructural genes lad Promoter-Cřp- \acP /acO lacZ lacY lac A for lad site Lad +1 TRANSCRIPTION TRANSLATION PROTEINS Clark and Pazdernik, 2016 lacY lacA mRNA ▼ TT s/i LacZ LacY LacA MUNI SCI Laktózový Operon LACTOSE (galactose & glucose) OH H >HOH H OH /U/.0-LACTOSE A. transgal- actosylis . LACTOSE hydr0|ysjf ▼ (gal-4glc) ALLOLACTOSE (gal-6glc) hydrolysis GALACTOSE & GLUCOSE B. gal-4glc fr2 E ^ľ=±E«gal-4glc- g\c^f H20 —^E-gal»glc{ E-gal y > E-gal«H20 E >^aMolactose E»gal-6glc ISOPROPYL-ß-D-THIOGALACTOSIDE (IPTG) 27 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod Wheatley et al., 2016 MUNI SCI Laktözovy Operon LACTOSE OPERON Promo»« Im ♦1 lacY lacA ♦ 1 YES GLUCOSE. YES LACTOSE -> OfF DNA lad gene ^^^^ £g lacP ta^ YES GLUCOSE. NO LACTOSE -► OFF NO GLUCOSE. YES LACTOSE AMP. CrpCrp ON I Lactose • RNA polymerase .J + 1 NO GLUCOSE. NO LACTOSE OFF RNA polymerase /iWnann Promo»* «0» "3p ♦1 28 GENOVE TECHNOLOGIE - Uvod Clark and Pazdernik, 2016 MUNI SCI Dvou komponentní regulační systém Často dochází ke kovalentní modifikaci aktivátoru/represoru pomocí různých skupin (methyl, acetyl, AMP-/ADP-ribóza. V případě dvou komponentního regulačního systému dochází k přenosu k přenosu fosfátu ze senzorové kinázy na aktivátor/represor (tzv. "phosphorelay systém") 29 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod P DNA binding form of response regulator MUNI Clark and Pazdernik, 2016 ^ Q J Regulace transkripce u eukaryot - Daleko více komplexní ve srovnání s prokaryoty - DNA je navinuta na histonech - jaderná membrána nepropouští většinu proteinů do jádra - velká role epigenetických modifikací (DNA, histony) - Všechny transkripční faktory mají dvě vazné domény - DNA a transkripční aparát MUNI 30 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod n n T o U J. Transkripční faktor GAL4 Regulace transkripce u eukaryot - Daleko více komplexní ve srovnání s prokaryoty - DNA je navinuta na histonech - jaderná membrána nepropouští většinu proteinů do jádra - velká role epigenetických modififikací (DNA, histony) - Všechny transkripční faktory mají dvě vazné domény - DNA a transkripční aparát - Transkripční faktory pracují skrze tzv. mediátorový komplex - Mediátorový komplex: - přenáší signál z aktivačních proteinů na RNA polymerázu II - obsahuje 26 rozdílných podjednotek tvořících jádro - je přímo asociovaný s RNA polymerázou II, kde čeká na informaci - Transkripční faktory se mohou vázat také na tzv. zesilovače transkripce 32 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod MU MI SCI Regulace transkripce u eukaryot Transcription proceeds Clark and Pazdernik, 2016 33 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod r,i u n i SCI Izolátory (Insulators) - DNA sekvence zabraňující zesilovačům transkripce chybně aktivovat geny - Jsou umístěny mezi zesilovač a geny, které nesmí regulovat - Insulator binding protein (IBP) se váže na tyto sekvence a blokuje zesilovače transkripce - IBP se nemůže vázat na methylovanou DNA GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod AP-1 (aktivátor protein-1) - Aktivuje široké spektrum genů - Nej lepší stimulátory AP-1 zahrnují růstové faktory a U V záření - Dimer dvou proteinů z Fos a Jun rodiny - Patří do rodiny bZIP DNA vazných proteinů - Stimulace AP - zvýšená exprese Fos a Jun proteinů - zvýšená stabilita Fos a Jun proteinů - fosforylace aktivační domény pomocí JNK (Jun aminoterminální kináza) Fos Jun Basic region Leucine zipper Basic region / t \ litino _ » ?! dna Leucine zipper Basic region Jun at;"tc a actct^g" a c t g a g t t g a g t c t < -^-> Promoter rna polymerase Promoter RNA polymerase -i, 5' 35 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod Clark and Pazdernik, 2016 M U NI SCI Zpracování eukaryotické mRNA Gcno DNA Primary transcript (RNA) Promoter Exon Iniron Exon Intron E; Transcription start TRANSCRIPTION Tail signal Exon Intron Exon Intron Exorifl Cap 1 r 5' ond Start codon AUG I MET Exons TRANSLATION Protein Tail i r Tail signal 3' end AAAAAAAAAAAA 3' untranslated ng mi Messenger (RNA) Protein A 36 Zápatí prezentace PROCESSING (ADD CAP. ADD TAIL. REMOVE INTRONS) Cap Po*"*1311 i_ I 4 Exon Exon Exor« AAAAAAAAAAAA TRANSLATION OH OH ß a H.N ,Nv^,N I—O-P-O-P-O Y1 % 0 II -p-o 1 N I O CH5 B1 and Bř = nucleobases 0 o. , 1 R o-p=o I 0 mRNA chain MUNI SCI Zpracování eukaryotické mRNA dochází k přidání čepičky na 5'konec mRNA (m7GTP) dochází k přidání polyA konce na 3'konec pomocí poly-adenylačního komplexu G CFIm Yadong Sun et al. PNAS 2018 37 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod AAAAAAAAAAAAAA - Poly(A) Binding Proteins (PABPs) 3' UTR O 40S 5' UTR MU NI SCI Zpracování eukaryotické mRNA - Dochází k odstranění intronů z primárního transkriptu pomocí faktorů sestřihu v rámci spliceosomu 38 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod Intron lariat Pre-mRNA 5'SS BPS 3'SS lzziGU-A—AG a 5 exon IL5 complex (intron lariat spliceosome) EE! mRNA E complex Prp5-ATP P complex sfNTC) (post-splicing NTR] complex) UAP56-ATP A complex ^kU1^7j2^= (pre-spliceosome) Prp28-ATP B complex (pre-catalyic spliceosome) Shi. Nature 2017 C* complex p£[CJ (step 2 ^NTR| catalytically activated) Wg^j C complex •fgy^r (catalytic step 1 spliceosome) Bacl complex (activated spliceosome) (catalytically activated spliceosome) https://www.youtube.com/watch?v=JnBf3tq_aXY MU NI SCI Epigenetika - Jakákoliv jiná změna v rámci DNA, než v nukleotidové sekvenci A) post-translační modifikace histonů B) metylace DNA C) remodelace nukleozomu D) umlčení zprostředkované RNA - Většina epigenetických změn ovlivňuje přístup regulačních proteinů k DNA - rozvolněný chromatin (euchromatin) - snadný přístup regulačních proteinů - kondenzovaný chromatin (heterochromatin) - znemožněn přístup regulačních proteinů 39 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod Euchromatin m jMcthylation GD Acetylation DNA hypermethylation Histone methylation DNA Hypomethylation Histone acetylation Heterochromatin Frontiers In Bioscience, Landmark, 23, 2018 MUNI SCI Epigenetika A POST-TRANSLATIONAL MODIFICATIONS OF HISTONES B ONA METHYLATION AGGREGATED DISAGGREGATED PRODUCTION OF Xist RNA Xtst X-i ,1 r lf\ a D X-INACTIVATION BY NONCOOING RNA COATING OF ONE X CHROMOSOME BY XA(A NH, Me' i, H n +N Ň Me' rMe lysine monomethyl lysine dimethyl lysine trimethyl lysine - Lysin-demetylázy (KDMs) - odstranění methylové skupiny z Lys zbytků H 0 oxidation H 0 dimethyl lysine 42 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod OH2 imine intermediate H ° H 0 .f<7 OH hemiaminal intermediate O H^H ,NH monomethyl lysine formaldehyde H,02 H NH FAD H 2 MUNI SCI Metylace DNA - U prokaryot metylace odlišuje nově syntetizované vlákno od templátu. - U eukaryot metylace umlčuje různé geny a brání jejich expresi. - Metylace se objevuje v motivech CpG nebo CpNpG - udržovací metylázy - metylace nově syntetizovaného vlákna DNA - de novo metylázy - nově přidávané metylace do DNA - demetylázy - odstranění nechtěných metylací z DNA - Celá řada genů v blízkosti tzv. CpG ostrůvků - Při metylacích rozsáhlých úseků na DNA CpG ostrůvky váží metylcytosin vázající proteiny, které zároveň aktivují histondeacetylázy = tvorba heterochromatinu 43 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod MU MI SCI Metylace cytosinu NH2 n ^0 NH2 sugar cytosine (C) I sugar 5-methylcylosine (mC) HO HO h N HAI lir nh2 ho. OH O A.NH2 T OH m^N ^O \*N S-ade n osy I-l- h omocystei ne (Ado Hey) NHj Hr, H Me Cys S-adenosyl-L-meth ion i n e n^M-^s (Ad0Met) O N R S Cys N .h O^N-^S O^N^H NH, N examination rAo \0 cytosine NH;. n 5-methylcytosine Cys SH Cys GENOVE TECHNOLOGIE - Uvod DNA repair UDG n deamination not repaired NH uracil NH \0 thymine MUNI SCI Proces translace - Přenos informace v mRNA do konkrétního proteinu - Každá aminokyselina je v mRNA kódována v rámci tří bazí nazývaných triplety/kodony - Jednotlivé kodony v rámci mRNA rozpoznávají molekuly transferové RNA (tRNA) - Aminokyseliny jsou připojovány k příslušným tRNA pomocí enzymů aminoacyl-tRNA syntetáz 2nd (middle) base 45 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod 1st base U C A G 3rd base U UUU Phe UUC Phe UUA Leu JUG Leu UCU Ser UCC Ser UCA Ser UCG Ser UAU Tyr UAC Tyr UAA stop UAG stop UGU Cys UGC Cys UGA stop GG Trp U C A G C CUU Leu CUC Leu CUA Leu CUG Leu CCU Pro CCC Pro CCA Pro CCG Pro CAU His CAC His CAA Gin CAG Gin CGU Arg CGC Arg CGA Arg CGG Arg U C A G A UU lie UC lie UA Ne UG Met CU Thr CC Thr CA Thr CG Thr AUAsn AC Asn AA Lys AG Lys GU Ser GC Ser GA Arg GG Arg U C A G G GUU Val GUC Val GUA Val GUG Val GCU Ala GCC Ala GCA Ala GCG Ala AU Asp GAC Asp GAAGIu GAG Glu GGU Gly GGC Gly GGA Gly GGG Gly U C A G R group H3C ^,CH3 CH I HoN+—C — C—O I II H O VALINE 3' end Codon I-i 1 2 3 CAU Anticodon ^ loop 5' end N. \ - T loop Clark and Pazdernik, 2016 M U III SCI H CH3SCH2CH2 - C - NH2 H CH3SCH2CH2 - C-NH-C-H Syntéza proteinů u prokaryot c=o c=o o - Probíhá v ribozomech N-formyl-Met-tRNA - 30S (16S rRNA + 21 proteinů) - 50S (5S, 23S rRNA + 34 proteinů) - Velká podjednotka = tři vazná místa - A (akceptor), P (peptide) a E (exit) - Translace začíná na AUG kodónu po Shine-Dalgarno sekvenci (UAAGGAGG) - Translace je iniciována derivátem Met (N-formyl-methionin) navázaný na 30S podjednotku - Iniciační faktory - složení 30S iniciačního komplexu - tRNA,fmetse váže do P-místa ribozomu, A-místo obsazuje daná tRNA, peptidyl-transferázová aktivita 23S rRNA katalyzuje tvorbu peptidové vazby - Přidávání dalších AK v rámci elongace vyžaduje elongační faktory, stop kodón váže RFs - Několik ribozomů se většinou váže na mRNA za tvorby polyzomu M 46 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod Ä A INITIATION 47 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod Clark and Pazdern pET28 vektor T7 promotér přiměř #69348-3 pET upstreom přiměř #66214-3 T7 nrnmntsr *" __L Ba/ii _i / promotér_ _lac operátor_ Xba\ rbs B.q/ll AGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA Wco i His-Tag_ Wrfe I M e I T7-Tag_ tataccatgggcagcag::at:at:at:atcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggctagcatgactggtggacagcaa MetGIySerSerH i sH i sH i sH i sH i sH i sSerSerGIyLeuVaIFroArgGIySerHi sMetAIaSerMetThrGIyGIyGInGI n £ag j 'thromb i n _ BamH i EcoR i Sad Sa/I HJnd III Afoŕl Xho I__His-Tag AľGGGľCGCGGATCCGAA TTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC pET-28a(+] Het g IyArgGIySerGIuPheGIuLeuArgArgGI nA IaCysGIyArgThrArgAIaProProProProProLeuArgSerGIyCysEnd GGTCGGGATCCGAAT TCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC pET-28b[+I G IyArgAspProAsnSerSerSerVaIAspLysLeuAI aA IaAIaLeuGIuH i sH i sH i sH i sH i sH isEnd GGTCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC pET-28c(+l ílyArgl leArglI eArgA IaProSe rThrSerLeuA rgProHi sSerSerThrThrTh rThrThrThrGI u IIeArgLeuLeuThrLysPro. . . 3pu1102l _T7 terminátor GAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGGAATAACTAGCA TAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG ■4- T7 terminátor přimer #69337-3 pET-28a-c(+) cloning/expression region 48 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod MU MI SCI Syntéza proteinů u e u ka ryot 3' UTR AAAAAAAAAAAAAA - Translace probíhá v cytoplasmě (drsné ER) - Nedochází ke spojení procesu transkripce a translace - Probíhá v ribozomech Poly(A) Binding Proteins (PABPs) - 40S (18S rRNA + 32 proteinů) 40S 5' UTR - 60S (5S, 5.8S a 28S rRNA + 47 proteinů) - mRNA neobsahuje Shine-Dalgarno sekvenci, rozpoznání čepičky a Kozák sekvence - První aminokyselina je Met bez modifikace - Celá řada eukaryotických proteinů je následně ještě post-translančně modifikována 49 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod Syntéza proteinů u eukaryot CAP BINDING COMPLEX PABP v y t r* 4E 43S PREINITIATION COMPLEX elFI elFla elF3 40S elFS 4A 4E m'G 5 1 1A --aos) GJPéSt-;i' AUG 50 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Uvod m7G- 4E GTP' eIFSB —GTP 4G 4A m 1AUG PABP Ťar-AAAAA - 'J^-40S nbosomo elF2 + GDP + P. 80S nbosome 4E m7G- Aj/ PABP K JJi-AAAAA - .4 58^ 4G 4E m'G- elF5 elFiA 80S nbosomo PABP -AAAAA B Translation begins Clark and Pazdernik, 2016 M U N I SCI