1
1
Molekulová luminiscence:
Základy instrumentace I
Jan Preisler
312A14, UKB PřF MU
tel. 54949 6629
2
Molekulová luminiscence: instrumentace I
• Fluorimetr a spektrofluorimetr: základní uspořádání přístrojů
• Součásti (spektro)fluorimetru
- excitační zdroje
- monochromátory
- polarizační filtry
- cely
- detektory
3
Schema měření fluorescence
excitační
zdroj
výběr
excitační l
vzorek
výběr
emisní l
detektor
4
Schema měření fluorescence (pokr.)
• Fluorimetr vs. spektrofluorimetr
Fluorimetr - neslouží k záznamu spekter
- filtry pro výběr vlnové délky
Spektrofluorimetr - záznam spektra (emisního nebo excitačního)
- využit(y) monochromátor(y)
• Polarizační fluorescence
mezi monochromátory a vzorkem mohou být začleněny
polarizační filtry
5
Součásti (spektro)fluorometru
• Excitační zdroje
výbojky, LED, lasery
• Monochromátory
filtry, hranoly, mřížky
• Polarizační filtry
• Cely
• Detektory
fotonásobiče, lavinové fotodiody, CCD
6
Fluorimetr
J.D.Ingle,Jr.,S.R.Crouch:SpectrochemicalAnalysis,1988
2
7
Spektrofluorimetr
J.D.Ingle,Jr.,S.R.Crouch:SpectrochemicalAnalysis,1988
8
Excitační zdroje: výbojky
• Nízkotlaká rtuťová výbojka
- nejintenzivnější vlnové délky 254, 312, 365 nm
- vrstva fosforu pro posun k delším l, p ~ 102 Pa
- použití zejm. v jednoduchých fluorimetrech (v kombinaci s filtry)
• Xenonová výbojka
- ve většině komerčních přístrojů, široké rozmezí l
- 75 – 500 W i více, teplota záření ~ 6 000 K
• Vysokotlaká rtuťová výbojka
- vysoká intenzita koncentrovaná do několika l
- p > 107 Pa
• Hg-Xe výbojka a deuteriová výbojka
- vyšší intenzity v UV, resp při l < 300 nm
http://www.sciencetech-inc.com
9
Excitační zdroje: lampy
• Wolfram-halogenová lampa
- W vlákno + Ar nebo Kr + stopa X2 (nejčastěji Br2)
- SiO2 baňka
- tvorba halogenidu wolframu zabraňuje usazování wolframu na
baňce; wolfram se ukládá zpátky na vlákno
- prodloužená životnost lampy
- 10 – 250 W, teplota záření ~ 3 000 K
Pozn: teplota záření (color temperature)
- barva záření černého tělesa
- slunce ve dne: ~ 5 000 K
en.wikipedia.org/wiki/Color_temperature 10
Xe výbojka
www.pti-nj.com/obb_spectra.html
11
Hg-Xe výbojka
www.pti-nj.com/obb_spectra.html 12
Wolfram-halogenová lampa
www.pti-nj.com/obb_spectra.html
3
13
LED
• LED: light emitting diode
• polovodičová p-n součástka emitující světlo v relativně úzkém
rozmezí l, kombinované LED i v širokém rozmezí l
• nejprve LED emitující v IR a červené oblasti, nyní i UV LED (nutné
pro excitaci)
• v současnosti l = 250 nm – 7 mm
www.roithner-laser.com, en.wikipedia.org
14
Emisní spektrum „bílé“ LED
en.wikipedia.org
15
Lasery
• Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
1916 A. Einstein: teoretická předpověď
1958 C. H. Towens: teoretické výpočty nutné pro realizaci
1960 T. Maiman: rubínový laser
• Typy laserů
- pevnolátkové (rubín, Nd:YAG, Er:YAG, Yb:YAG, Ti:safír)
- plynové (HeNe, Ar+, CO2, N2, HeAg, NeCu)
- excimerové (ArF, KrCl, KrF, XeCl, XeF)
- polovodičové
- barvivové
- chemické (HF, DF)
- elektronový laser
16
Některé emisní vlnové délky běžných laserů
ArF excimer: 193 nm
KrCl excimer: 222 nm
KrF excimer: 248 nm
XeCl excimer: 308 nm
N2: 337 nm
XeF excimer: 351 nm
HeCd: 442 nm
Ar+: 364, 457.9, 476.5, 488.0, 496.5, 501.7, 514.5, 1090 nm
HeNe: 543, 594, 612, 633, 1152 nm
Kr+: 530.9 nm
rubín: 628, 694 nm
InGaAlP polovodič: 635-660 nm
GaAs/GaAlAs polovodič: 780-905 nm
InGaAs polovodič: 980 nm
Ti:safír: 700-1000 nm
Nd:YAG: 1064 nm
17
Některé emisní vlnové délky běžných laserů
• Vývoj laserových diod, l = 370 nm – 1,9 mm
- CD: l = 780 nm
- DVD: l = 650 nm
- blue ray/ HD DVD: l = 405 nm
• Navíc možnost násobení frekvence
- běžně 2x, 3x, 4x
- např. diodou pumpovaný ND:YAG: 532, 355 a 266 nm
Další info např. na www.lexellaser.com/techinfo_wavelengths.htm
www.lasermate.com/diodes.htm
18
Barvivové lasery
• Excitační záření: laser, výbojka
• Médium: roztok barviva nejlépe v průtokové cele či trysce
• Laditelný v omezeném rozsahu vlnových délek
• Typický příklad
- excitační záření: 532 nm (Nd:YAG, 2x), N2
- roztok rhodaminu 6G
- výstup: 540-600 nm
mřížka
zoom
paprsku
cela
nebo tryska
(barvivo)
excitační zdroj
výstup
polopropustné zrcadlo
4
19
Monochromátory
• Monochromátor
- filtr
- hranol
- mřížka
- laditelný filtr (optoakustický, kapalné krystaly)
- monochromatický zdroj (laser)
- kvazimonochromatick zdroj (LED)
20
• Zpravidla v levných přístrojích, ve fluorimetrech
• Běžné typy filtrů
- interferenční
- barvivové
- band pass
- long pass
- short pass
- neutrální
- speciální
(edge, notch, laser line aj.)
Filtry
wikipedia.org
21
Typy filtrů
neutrální
long-passshort-pass
band-pass
barvivový
interferenční
long pass
„edge“
l (nm)
transmitance(%)
0
100
22
Příklad: „Raman edge long-pass“ filtr
23
• nejběžnější trojhranný, 3 x 600
• materiál: sklo, křemen aj.
• úhlová disperze: dq/dl
• disperze hranolu: dn/dl
• dq/dl ~ ndn/dl
• R = adn/dl
n ... index lomu
q ... úhel mezi prošlým
a přicházejícím paprskem
a ... základna hranolu
R ... rozlišovací schopnost
Hranol
24
Uspořádání hranolových monochromátorů
Littrow
Bunsen Cornu
J.D.Ingle,Jr.,S.R.Crouch:SpectrochemicalAnalysis,1988
5
25
Mřížka
• skleněná deska s napařenou vrstvou Al a paralelními vrypy
vzájemně vzdálenými stovky nm
• tvarované (ešeletové) nebo holografické
• rovné nebo konkávně zakřivené
• reflexní nebo transmisní
• R = l/dl = mN
m ... řád spektra
N ... počet vrypů mřížky
26
Uspořádání mřížkových monochromátorů
Littrow
Fastie-Ebert
Czerny-Turner
J.D.Ingle,Jr.,S.R.Crouch:SpectrochemicalAnalysis,1988
27
Parametry monochromátoru
• Šířka štěrbiny (slit width)
- šířka štěrbiny vs. transmise
• Šířka pásma (bandpass)
- šířka pásu v polovině maxima (full width at half maximum,
FWHM)
- dána šířkou štěrbiny a disperzí
28
Laditelné filtry
• Akustooptické filtry
- index lomu n je funkcí tlaku
- při průchodu akustického
signálu krystalem dochází k
tvorbě periodické variace n
(transparentní mřížka)
- laditelné změnou frekvence
akustického signálu
• Filtry z kapalných krystalů
- laditelné změnou
elektrického napětí
- propouští specifické
vlnové délky
www.meadowlark.com
www.olympusfluoview.com
29
Polarizační filtry
• Běžné typy
- Glan-Taylorův
- Glan-Thompsonův
- polarizační fólie
Glan-Taylorův polarizační filtr je složen ze dvou kalcitových
hranolů, mezi kterými je vzduchová mezera
www.laser2000.co.uk
30
• Pravoúhlé kyvety nejběžnější
- 1 x 1 x 4,5 cm, nejlépe křemenné se všemi stěnami leštěnými
• Uspořádání
- klasické (900)
- in-line
- pro koncentrované a opalescentní vzorky
Cely pro vzorek
lexc
lem
lexc
lem
lexc lem
www.wpiinc.com
6
31
• Další typy kyvet
- trojúhelníkové pro koncentrované a opalescentní vzorky
- s kruhovým průřezem
- zúžené pro koncentrované vzorky
- mikrocely
- cely pro současné měření absorbance a fluorescence
Cely pro vzorek (pokr.)
lexc
lem
lexc
lem
absorbce!
www.spectrocell.com
32
Cely pro vzorek (pokr.)
• Uzávěrka, clona
- pro vzorky podléhající fotodekompozici
• Absorbér prošlého světla za kyvetou
• Chlazení
- např. N2(l) pro fosforescenci
• Absorbující povrch prostoru pro vzorek
- např. elox
- pozor, černá barva může fluoreskovat!
33
Detektory
• Oko
• Fotonásobič
• Lavinová fotodioda
• CCD
• Vlastnosti
• spektrální citlivost
• kvantový výtěžek
• zisk
• rychlost
34
Fotonásobič
• Evakuovaná trubice se sérií 10 – 16 elektrod
• Fotokatoda: oxidy alk. kovů, Ag, sloučeniny Ga, Sb, As, P, Te aj.
• Dynody: MgO, GaP
• Zisk: 106 – 107, rychlost: ~ ns a více
• Režimy: proporcionální a čítač fotonů
• Spínání fotonásobiče (PMT gating)
hn e-
+
~1000 V
fotokatoda anodasérie dynod
35
Příklady fotonásobičů
www.hamamatsu.com
Fotonásobič
... photomultiplier tube, PMT
36
Příklady fotonásobičů
www.hamamatsu.com
7
37
Kvantový výtěžek fotokatody PMT
www.hamamatsu.com 38
Charakteristika vstupního okénka PMT
www.hamamatsu.com
39
Mikrokanálková destička
• MCP (microchannel plate)
- tloušťka ~1 mm, průměr 1 - 10 cm.
• Mikrokanálky
- orientovány šikmo
- průměr ~ 3 - 20 mm
- chevronová struktura ( 2 MCP)
- pokryté polovodivou vrstvou PbO
(gradient napětí podél mikrokanálku,
kanálek = kontinuální dynoda, násobení e-)
• Zisk: 1xMCP ~103, 2x MCP ~106
• Použití
- plošný detektor v TOFMS
- rychlý fotodetektor (s předřazenou transparentní fotokatodou)
-2.2 kV
-1.2 kV
-200 V
kolektor
0 V
2 MCP s mikrokanálky
iontyneboe-
40
Fotonásobič s MCP
www.hamamatsu.com
• vysoká rychlost, i < 1 ns, možnost rychlého zapnutí/vypnutí
• plošný fotodetektor se ziskem (image imntensifier)
41
Polovodičové detektory
• Lavinová fotodioda, (avalanche photodiode, APD)
- p-n přechod s reverzibilním průrazem
- vysoká rychlost: 50 – 80 GHz
- vysoká citlivost: zisk ~103, oblast l > 400 nm
- možnost měření v režimu single-photon counting
• Fototranzistor
- zisk ~100 a více
- omezený dynamický rozsah
• Array detektory
- CCD, CID aj.
- podrobně později
www.hamamatsu.com
APD
42
Molekulová luminiscence:
Základy instrumentace II
8
43
Molekulová luminiscence: instrumentace II
• Měření, zpracování a prezentace dat
- převodníky
- 3D spektra, synchronní sken
• Srovnání absorpční a luminiscenční spektroskopie v oblasti
UV-Vis
• Časově rozlišená luminiscence
• Fosforescence
• Chemiluminiscence
• Polarizace a anizotropie fluorescence
44
Záznamová zařízení
Foton  elektron  proud
Digitální převodníky
• ADC, A/D převodník (analog to digital converter)
• čítač (counter)
• TDC, T/D převodník (time to digital converter),
TAC (time to amplitude converter)
45
A/D převodník
Měřění (digitalizace) napětí
Základní parametry
- počet bitů (rozlišení převodníku)
- vzorkovací frekvence ... počet vzorků za sekundu (vz/s,
sample/s)
- „interleaved sampling“ (opakované vzorkování period. signálů)
- max. frekvence (cut-off frequency)
- polarita: unipolární (negativní), bipolární
- rozsah vstupního napětí
- max. vstupní napětí
- počet bodů (délka paměti, velikost pufru)
- stabilita aj.
46
A/D převodník (analog/digital)
Příklad:
2-bitový převodník s rozsahem 0-3V a vz. frekvencí 10 vz/s
počet úrovní = 22:
perioda, T = 1/10 = 0.1 s
SA (V)
3
0
0 0.2 0.4 0.6 t (s) 0 0.2 0.4 0.6 t (s)
SD (#)
2
1
úroveň high-bit low-bit
0 0 0
1 0 1
2 1 0
3 1 1
47
Přesnost záznamu
• Přesnost (a správnost) měření dána počtem bitů AD převodníku
• Např. pro 8-bitový převodník 28 = 256 úrovní:
• nepřesnost odpovídá 1/2 úrovně
• min. rel. chyba > (2x(počet úrovní - 1))-1 = (1/2x255)-1 ~ 0.2 %
počet bitů 1 8 12 16 24
počet úrovní 2 256 4 096 65 536 16 777 216
min. rel. chyba (%) 50 0.2 0.01 8x10-4 3x10-6
dyn. rozsah
(pro rel. chybu <10%)
- 50 800 13 000 3 000 000
48
Čítač
Čítač: počítání pulsů
Foton  puls  (zesilovač)  diskriminátor  čítač
Analogový signál
(např. 2 fotony z PMT)
0 .5 1 t(ms)
SA (V)
100 %
0
0 .5 1 t(ms)
SD (#)
0
1
prahová úroveň signálu (diskriminátor)
Digitalizovaný signál
Výstup čítače: 2 fotony/ms
9
49
Využití čítače
• Počítání fotonů (photon counting)
- počet fotonů/čas
• Mrtvá doba čítače
- po zaregistrování fotonu čítač nemůže jistý čas detekovat další
foton
- nedetekuje všechny fotony a vede k negativní chybě
50
Photon counting
W.BeckerThebhTCSPCHandbook
51
T/D převodník
• T/D převodník (time to digital, T/D converter, TDC)
- měření doby od spouštěcího signálu, např. od excitačního pulsu
- 1-bitový A/D převodník se dvěma úrovněmi: 0 a 1
• Parametry TDC:
- časové rozlišení, např. 10 ps
- single/multi stop: registrace jednoho/více pulsů
- počet kanálů aj.
• Použití TDC:
měření doby pulsu od spouštěcího signálu pro opakované dějě
např. měření doby fotonu od excitačního pulsu při TCSPC (timecorrelated
single photon counting)
52
Měření a prezentace dat
• Jednoduchý sken
- emisní spektrum (lexc = konst., sken lem)
- excitační spektrum (lem = konst., sken lexc)
• Synchronní sken
- současný sken lem a lexc, lem-lexc = konst.
• 3D spektra
- množina excitačních/emisních spekter
- ze 3D spektra lze získat emisní, excitační spektrum nebo
rozdílové spektrum odpovídající synchronnímu skenu
53
Příklad 3D spektra:
Luminiscence lanthanoidů
Tb3+, Eu3+, Dy3+, Sm3+ a Gd3+
54
Srovnání absorpční a luminiscenční spektroskopie
v oblasti UV-Vis
Spektroskopie v oblasti UV-Vis A = c x ε = log(Io /I)
Absorpční spektroskopie: měření poměru dvou světelných toků
+ přesnost (odolnost vůči změnám abs. hodnoty světelného toku
Φo)
- citlivost (nepatrný rozdíl mezi Io/I při nízké koncentraci analytu)
Luminiscenční spektroskopie F ~ k φ Io 2.3 c x ε
Luminiscenční spektroskopie: měření vyzářené energie
+ vysoká citlivost při použití citlivého detektoru (i jednotlivé fotony)
- přesnost (fluorescence je přímo úměrná ecitačnímu světelnému
toku (Io); projevuje se u ní negativně kolísání excitačního zdroje aj.
10
55
Časově rozlišená luminiscence
I = I0 exp -(t/)
t
I0 -
1
e
excitační puls
fluorescence
IF
•
Doba života (luminescence lifetime):  = 1/ kF
- kvalitativní a strukturní analýza, studium polohy fluoroforu
56
• Logaritmický diagram
Časově rozlišená luminiscence
log I0 excitační
puls
fluorescence
log IF
t
logIF = logI0 - t

57
Časově rozlišená luminiscence
• Porovnatelná šířka excitačního pulsu a 
- nutnost dekonvoluce
- změna zdroje: ultrakrátký laserový excitační puls
excitační puls
fluorescence
IF
t
58
Měření časově rozlišené fluorescence
• Měření v časové doméně
- klasický způsob měření IF vs. t
- pro opakované děje možnost použití interleaved sampling
• Měření ve frekvenční doméně
- modulace excitačního záření
• Time-correlated single photon counting
59
Měření ve frekvenční doméně
• stanovení doby života z fázového posuvu DF a míry modulace
• míra modulace je dána poměrem amplitudy střídavé složky
ku stejnoměrné složce excitačního záření
• možnost studia multiexponenciálních poklesů
I
t
fluorescence
excitace
DF
DC
AC
60
TCSPC
• Time-correlated single photon counting
• Instrumentace
- excitační zdroj: laser, délka pulsu fs – ns
LED, délka pulsu < ns
speciální lampy, délka pulsu ~ ns
vysoká opakovací frekvence pulsů, až ~ 100 MHz
- detektor: PMT (fotonásobič), MCP-PMT
SPAPD (single photon avalanche photodiode)
- záznamové zařízení: TDC
- FLIM: fluorescence lifetime imaging (mikroskop + sken)
11
61
Pockelova cela
• elektro-optické zařízení s krystalem vápence; vložením napětí na
krystalu mění index lomu
• Pockelovou celou vloženou do laserového rezonátoru lze
modulovat intenzitu laseru
• Užití: generování velmi krátkých pulsů, např. „mode-locked“
Nd:YAG
62
Schema klasického měření TCSPC
W.BeckerThebhTCSPCHandbook
63
TCSPC
Fluorescence rhodaminu 110 v H2O, excitace: 405nm
W.BeckerThebhTCSPCHandbook
64
FLIM
W.BeckerThebhTCSPCHandbook
65
Fosforescence
• Základní experimentální sestava stejná jako u fluorescence
• Modulace excitačního záření a měření fosforescence s fázovým
posunem v době, kdy je exc. záření nulové
- vede k eliminaci rozptýleného záření
• Modulace
- mechanická („chopper“)
- zábleskové výbojky
- pulsní lasery atd.
66
Fosforescence
• Ochrana vzorku v tripletovém stavu
• LTP (low temperature phosphorescence)
- vzorek rozpuštěn v organickém rozpouštědle a chlazen: 77 K,
N2, Dewarova nádoba
- výběr rozpouštědel kritický (běžně EPA: ethanol + izopentan)
• RTP (room temperature phosphorescence)
- fosforescence při pokojové teplotě
- na pevném substrátu (filtrační papír, silikagel, octan sodný) s
modifikátory (NaI, AgNO3) pro podpoření intersystem crossing
- v roztoku v přítomnosti micel (nad kritickou micelární
koncentrací, CMC)
- transfer tripletového stavu analytu do tripletového stavu
fosforeskujícího akceptoru (např. bromonaftalen)
12
67
Chemiluminiscence
• Možnost měření s velmi jednoduchou instrumentací
- není nutný žádný monochromátor
- nutné součásti:
cela
zařízení pro vstup reagentu, např. septum pro injektáž
fotonásobič
- v případě nutnosti záznamu spektra exc. monochromátor
68
Polarizace a anizotropie fluorescence
• Excitace polarizovaným zářením vede k částečně polarizované
fluorescenci
• Fotoselekce
Excitační záření absorbují molekuly s absorpčním přechodovým
dipólem paralelním k elektrickému vektoru excitačního záření
• Rovina polarizace vyzářené fluorescence závisí na úhlu mezi
absorpčním a emisním přechodovým dipólem
• Depolarizace
- rotační difúze ... hlavní příčina
- neradiační transfery energie mezi fluorofory
69
Polarizace a anizotropie fluorescence
• Stupeň polarizace, p
p = (III - I)/(III + I)
III a I ... složky světelné intenzity rovnoběžné, resp. kolmé ke
směru polarizace budícího záření
• Anizotropie fluorescence, r
r = (III - I)/(III + 2 I)
• Depolarizační faktor, d
d = I/III
Vzájemné převody:
r = 2 p/(3 – p) = (1 - d)/(1 + 2 d)
p = 3 r/(2 + r) = (1 - d)/(1 + d)
70
Anizotropie fluorescence
Anizotropie sferické molekuly:
r = roe-t/’
rotační relaxační doba, ’:
’ = hVm/(RT)
h ... viskozita
Vm ... parc. objem molekuly
• Dva způsoby měření anizotropie
- měření anizotropie v časové doméně: vyhasínání anizotropie
- měření anizotropie ve frekvenční doméně: dynamická polarizace
71
Vyhasínání anizotropie
III
ln I
t
I
Přímé měření III a Ipo excitaci vert.polarizovaným zářením, IF,II
72
Dynamická polarizace
Určení anizotropie z fázového posuvu mezi III a I
Vysoká frekvence exc. záření IF,II, f:
populace horizontální komponenty nízká
Střední f:
populace horizontální komponenty významná
Vysoká f:
stejné populace
horizontální a vertikální
komponenty
I
III
13
73
Výsledná polarizace fluorescence
• Rotační relaxační doba >> doba života fluorescence
... fluorescence bude polarizována
• Rotační relaxační doba << doba života fluorescence
... anizotropie systému bude zanedbatelná
př.: malá molekula (M = 333,  = 10 ns ): ’ = 0.1 ns
• Rotační relaxační doba ~ doba života fluorescence
př.: velká molekula (M = 33 300, = 10 ns): ’ = 10 ns,
... lze využít pro studium biologických membrán, interakce ligandu
s receptory, proteinu s DNA aj.
74
Polarizace a anizotropie fluorescence
Intenzita fluorescence polarizovaná ve směru otočeném o úhel  od
směru rovnoběžné polarizace:
I(t) = cos2 III (t) + sin2 I(t)
Pro „magický úhel“  = 54,74° (54°44´8´´): I54,7(t) = III (t) + 2 I(t)
... při měření celkové intenzity fluorescence pomocí analyzátoru
otočeného o magický úhel se v roztocích, ve kterých rotační
relaxační doba ~ doba života fluorescence, získají hodnoty
dohasínání fluorescence neovlivněné molekulárními rotacemi
Časová závislost anizotropie: r(t) = (3 cos2(t) – 1)/5
 ... úhel dipólové reorientace za dobu t