16.09.20218-9.30hod C02-211 Doc. Paleček Úvod – historie, význam
23.09.20218-9.30hod C02-211 Doc. Paleček Základní charakteristiky kvasinek
30.09.20218-9.30hod C02-211 Doc. Paleček Diagnostické a molekulárně biologické metody
07.10.20218-9.30hod C02-211 Dr. Spirek Mitochondrie, chromosomy
14.10.20218-9.30hod C02-211 Doc. Paleček Genetika kvasinkových organismů
21.10.20218-9.30hod C02-211 Doc. Paleček Morfologie a buněčný cyklus, párovací proces,
28.10.2021
04.11.20218-9.30hod C02-211 Doc. Paleček Regulace transkripce, 1-2-3 hybridní systémy, reporter systémy
11.11.20218-9.30hod C02-211 prof. Svoboda Protoplasty kvasinek jako modelový objekt
18.11.20218-9.30hod C02-211 prof. Svoboda Struktura kvasinkové buňky, sekreční dráhy a endocytóza
25.11.20218-9.30hod C02-211 prof. Svoboda Patogenní kvasinky, morfologická charakteristika, medicínské aspekty
02.12.20218-9.30hod C02-211 Doc. Paleček Organizace genomu a evoluce kvasinek
09.12.20218-12hod B07-2.17 Svoboda+Paleček Cvičení k přednáškám
16.12.20219-12hod A2-2.11 Doc. Paleček test + předtermín zkoušky
Osnova 4. přednášky
– Plasmidy
– Integrace do genomu
– Nadprodukce, delece
– Tetrádová analýza
– Syntetická letalita, suprese
– Teplotně-sensitivní mutanty
GENETIKA
Wang,CurrentGenetics,2016
– obecnější poznání (buněčných/molekulárních procesů)
– aplikační účely (biotechnologie)
kvasinkové modely
• Rychle se množící EUKARYOTNÍ mikroorganismy
(90 min/dělení, 25-30°C)
• Vytváří kolonie na plotnách - mikrobiologické metody (otiskování
ploten, kapkovací test => toxiny v plotnách – HU, MMS …)
• Stabilní haploidní i diploidní formy
• Haploidní buňky lze křížit na diploidní (heterozygotní mutanty)
• Diploidní buňky lze sporulovat a využít pro genetickou analýzu
(tetrádová analýza)
• Lze transformovat DNA (plasmidy i linearní)
• Centromerické a multicopy plasmidy
• Vysoká frekvence homologní rekombinace
(lineární DNA)
• Lze připravovat deleční a mutantní kmeny
• Vydrží v >15% glycerolu na -70°C „indefinitely“
• S.c. má kompaktní genom – knihovny s genomovou DNA (ne cDNA)
• Kompletně osekvenovaný genom (genomové aplikace)
• EuroFan projekt – delece všech S.c. genů (+GFP, +2-hybrid)
Saccharomyces cerevisiae
- oválné, množí se pučením – >diploidní i haploidní buňky
- většina v G1 fázi (zatímco pombe je v G2 fázi)
- Genom 12 Mbp na 16-ti chromosomech
- Krátké centromery a ARS (100bp)
- Kóduje cca 6 500 genů
- 120 kopii rRNA (chr XII), 262 tRNA
- Geny reprezentují 75% celkové sekvence (kompaktní)
- <5% genů obsahuje introny (0.5% genomu), 3% transposony (46% u člověka)
Schizosaccharomyces pombe
- podlouhlé, množí se „polcením“ - většinou haploidní buňky
- má blíž k vyšším eukaryotům (metazoa)
- pouze 3 kondenzované chromozomy (13 Mbp)
- velké repetitivní centromery (40-100kb) a 1kb počátky replikace
- tvorba spindlu až v mitóze
- asi 4800 kodujících genů (nejmeně u eukaryot)
- z nichž 43% má introny
- má geny pro heterochromatin, RNA interferenci (S.c. nemá)
Chromosom III
(nejmenší)
CEN, ARS, TEL, Ty1-5
obsahuje MAT lokus
Nomenklatura pro S.c.:
YCRXXw:
Y=yeast
C= 3. chromosom
R= pravé raménko
XX=pořadové číslo
w/c=Watson/Crick
LEU2 – gen
Leu2p - protein
leu2∆ – delece
leu2-1 – mutace
(identifikační číslo alely)
LEU2::HIS3 – inzerce
genu HIS3 v lokusu
genu LEU2
Nomenklatura pro S.p.:
SPAXXXX:
SP=S. pombe
A= 1. chromosom
…
Forsburg: NRG, 2001
Baudat a Nicolas, PNAS, 1997
S. cerevisiae kompaktní genom
Laboratorní kvasinkové kmeny
S. pombe – „501“
Genotype: h- ura4-∆18 leu1-32 ade6-704
S. cerevisiae – „S288C“ – 1. osekvenovaný kmen
Genotype: MATα SUC2 gal2 mal mel flo1 flo8-1 hap1
Notes: Strain used in the systematic sequencing project, the sequence stored in SGD. S288C does not form
pseudohyphae. In addition, since it has a mutated copy of HAP1, it is not a good strain for mitochondrial studies. S288C
strains are gal2- and they do not use galactose anaerobically.
References: Mortimer and Johnston (1986) Genetics 113:35-43.
Sources: ATCC:204508
„W303“ – nejčastěji používaný laboratorní kmen
Genotype: MATa/MATα leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15
Notes: W303 also contains a bud4 mutation that causes haploids to bud with a mixture of axial and bipolar budding patterns.
In addition, the original W303 strain contains the rad5-535 allele.
References: W303 constructed by Rodney Rothstein
Sources: Biosystems:YSC1058
Dvojhybridní
systém:
auxotrofie – využívána pro selekci
Allele Reverts? Notes Molecular descriptiona Reference
ade2-101 yes
ochre mutation, red
colonies
G to T transversion at nucleotide
190, changing amino acid 64 from
a Glu to a STOP
Gai and Voytas, 2005
his3-200 no
Cold sensitive; high
frequency of petite
formation, especially
during transformation.
1 kb deletion, (-205 to 835)
Struhl 1985; Fasullo and Davis
1988
leu2-3,112 no double mutant
GTT-to-GCT missense change at
codon 69,
G insertion at nucleotide 249,
G insertion at nucleotide 792,
GAC-to-AAC missense change at
codon 300.
Hinnen et al. 1978;
Gaber and Culbertson 1982;
trp1-1 yes amber mutation
GAG-to-TAG amber (STOP)
nonsense change at codon 83
McDonald, et al. 1997
ura3-52 no - Ty1 insertion Rose and Winston 1984
Selekce
Forsburg: NRG, 2001
- geneticin (G418) – podobný kanamycinu (mistranslace)
- nourseothricin (NAT) – inhibitor ribosomalní proteosyntézy = miskodování
(Streptomyces noursei), rezistence pomocí nat1 genu (N-acetyltransferasa –
monoacetyluje NAT)
- hygromycin B – inhibuje translokaci v průběhu translace (aminoglykosid z
Streptomyces hygroscopicus), rezistence kódována hph genem z Klebsiella
pneumoniae
- phleomycin – interkaluje se do DNA a způsobuje DSB (zlomy, glycopeptid z
Streptomyces verticulus), rezistence kódována ble genem z S. hindustanus
Shuttle vektory
MET1
CUP1
MFA1
Methionin repressed
Cu induced
MATa specific (haploid specific)
• vychází z 2µm plasmidů nebo centromer (S.c.; 2µm přítomné také v
Zygosaccharomyces bailii, Z. rouxii a Kluyveromyces drosophilarum)
• Kvasinková část – marker (URA3, NAT …), CEN-ARS (1 kopie) nebo 2µm (~50 kopii
na haploidní buňku) segregace (uchycení chromosomu) a začátek replikace
• Bakteriální část – Kan resistence, replikace
• Promotor, tag, MCS
– Kondicionální mutanty (fenotyp-funkce)
– Nadprodukce (suprese mutací, toxicita, biotechnologie)
Sheng, Front in Microb, 2015FFA- free fatty acids, FAEE - fatty acid ethyl esters
Nadprodukce - integrativní plasmidy
- integrativní plasmid pro P. pastoris
(GS1115, genotype: his4 )
- exprese z AOX1 promotoru v
P.pastoris
- nemají CEN/2µm části
Integrace I
- integrativní plasmid pro P. pastoris
(GS1115, genotype: his4 )
- exprese z AOX1 promotoru
- integrace do AOX1 lokusu
- mechanismus homologní rekombinace
Integrace II.
- integrace do his4 lokusu
mechanismus
homologní
rekombinace
YAC (yeast artificial chromosome)
• Bakteriální část – Amp resistence,
počátek replikace
• Kvasinková část – markery
(TRP1, URA3), CEN4+ARS1,
TEL
• 50-500kbp insert např. lidská
genová banka pro HuGO 80000
klonů YAC (270kbp)
• Klonování, množení, uchování
dlouhých fragmentů DNA
• Výzkum savčích telomer a
centromer
• Pomocí transfekce, lipofekce
nebo elektroporace lze dostat
YAC i do savčích buněk –
náhodně se integrují do genomu výzkum
nesestřihnutých genů
(dlouhé regulační úseky)
Transformační protokol
• Exponenciální kvasinková kultura
• Opláchnout vodou a TE/LiAc roztokem
• Rozsuspendovat v TE/LiAc roztoku a přidat DNA
(plasmidová/cirkulární i lineární DNA)
• Přidat TE/LiAc/PEG4000 roztok
• 30 minut na 30°C a poté teplotní šok při 42°C (15min)
• Stočit a pelet rozsuspendovat v TE roztoku
• Rozetřít na selektivní plotnu
Integrace: disrupce/delece genu
- studium funkce genu – fenotyp (delece/mutace)
- biotechnologie (přesměrování metabolických drah)
- životaschopné – mutace lze přímo integrovat do genomu
- esenciální gen => buňky potřebují gen např. na plasmidu
(plasmid shuffling)
1. krok 2. krok
neesenciální gen
specifická mutace
Využití inhibitoru FOA pro „odléčení“ URA3 markeru (FOA je přeměňována Ura3p
dekarboxylázou na toxický 5-fluorouracil => URA3+ buňky nerostou, zatímco ura3buňky
jsou „rezistentní“) - opět ura-, takže URA3 marker lze znovu využít
homologní rekombinace
Delece genu - PCR
- studium funkce genu – fenotyp
- esenciální gen vs životaschopné
- systematicky provedeno na všech ~6500 genech v rámci projektu EuroFan
- kmeny lze získat z archivu EUROSCARF
http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html
Giaeveretal,Nature,2002
kanMX
kanMX
kanMX
1.PCR (barcode)
2.PCR (homologie)
Kvasinkový ORF
pro rekombinaci stačí pouze krátká
homologie (50-100nt pro S.c.)
specifické sekvence pro pozdější
identifikaci a manipulace …
EuroFan projekt - testy fenotypu
Buněčná stěna
(stabilizující)
Oprava DNA
Mikrotubuly
(stabilizující)
ts
cs
- Systematicky provedeno na >6000 genech v rámci projektu EuroFan
- Funkční kategorie genů – anotace v databázích (genová ontologie)
Mikrotubuly
(destabilizující)
Bun. stěna
(destabilizující)
Winzeler et al, Science, 1999; Giaever et al, Nature, 2002
~ 6000 heterozygotních delečních kmenů
~ 5000 homozygotních delečních kmenů (+ ~ 1000 esenciálních genů)
(neesenciální – pro růst za specifických podmínek nebo redundantní procesy)
- Testováno ~400 malých molekul
a stresových podmínek (-aa ...)
- Celkem provedeno ~ 6milionů
testů
- multidrug resistance (MDR)
pokud byl gen potřebný pro
resistenci vůči >20% z
testovaných látek
- Podobné profily svědčí o funkční podobnosti
Hillenmeyer et al, Science, 2008
Geny/Proteiny peroxisomu
Deleční knihovna – S. pombe
- S. pombe potřebuje delší homologii (serial PCR = 40-80bp; block PCR = 80-350bp)
- deleční knihovna od Bioneer (Korea, 25 000$)
Kim et al, Nat Biotech (2010)
- individuální vědecké studie …
Delece genu pomocí transposonů
Defekt buněčné stěny
MacDonald et al.: Nature, 1999
esenciální
Citlivé …
- knihovna konstruktů s náhodnými integracemi
Micheletal,eLife,2017
SAturated Transposon Analysis in Yeast (SATAY)
- generováno 1.000.000 klonů – 300.000 inzercí (vysoké pokrytí na 6.000 genů)
- cirkulární DNA použita pro NGS sekvenování (MiniDs transposon-specifické primery)
- inzerce každých 40bp (preferenčně v nucleosom-free oblastech)
- každý transposon sekvenován 20x …
Michel et al, eLife, 2017
- inzerce chyběly v
esenciálních genech
(zelené šipky)
- charakterizace GO,
drug screening,
syntetická letalita, …
- rozlišení na úrovni
domén (GAL10 – dvě
domény z nichž
esenciální je pouze
první …)
- C-koncové, ale i Nkoncové
delece
Mulleder et al, Cell, 2016
- deleční knihovna
testována na
metabolismus
AMK (změna
koncentrace AMK)
- analýza vztahu
genom-metabolom
Mulleder et al, Cell, 2016
- transport proteinů a váčků (Golgi/ER … degradace proteinů a recyklace AMK) má
zřejmý vztah k hladině AMK – překvapivě velký vliv má struktura chromatinu
vztah genom-metabolom
Horwitz et al, Cell Syst, 2015
Cas9 zaintegrován
sgRNA kazeta definuje
místo štěpení
donorová DNA nese
integrační insert
Integrace: inzerce genu (CRISPR/Cas9)
- CRISPR zvyšuje účinnost integrace a
nezanechává „stopy“
Horwitz et al, Cell Syst, 2015
Phosphoenol pyruvate (glykolýza)
6 integrací do 3 lokusů (po dvou)
syntéza kyseliny mukonové - bioplasty
AroY v pěti kopiích – zvýšilo výtěžek
delece ARO1 blokuje tvorbu aromatických AMK (dráha vede na kys. mukonovou) a nutí
buňky do této dráhy – v biotechnologickém procesu nejdříve na bohatém médiu roste
biomasa – poté se na minimálním médiu (bez aromatických AMK) spouští tato dráha
- sgRNA kazeta
definuje místo štěpení
- donorová DNA nese
homologní integrační
insert
nová metabolická dráha
lokusy: GAL80, HO, ARO1
AroB, D, F, Y a Z = E. coli
CATA = C. albicans
Životní cyklus S. cerevisiae
- Deleci či mutaci lze provést v
haploidní či diploidní buňce
- v haploidní buňce hrozí suprese
defektu proto je lépe používat
diploidní buňky (druhá kopie zůstává
nezměněná)
- lze připravit dvojitého mutanta
křížením haploidních mutant a poté
sporulací diploida
- delece esenciálního genu lze provést pouze
v diploidní buňce (haploidní nepřežije)
- po iniciaci sporulace dojde k meiotickému
dělení (2n -> 4n -> 4x 1n) a vzniknou 4
haploidní buňky (lze rozdělit
mikromanipulátorem – tetrádová analýza)