Osnova 3. přednášky METODY • Diagnostické metody • Analytické metody • Kvasinkové modelové organismy Určení (nových) kmenů v nových lokalitách Určení kmene v klinických izolátech (odlišení patogenních kmenů Candida…) Kontrola čistoty kmene pro biotechnologické procesy (Saccharomyces cerevisiae – pivo) zpracování vzorků: z půdy: promývání v destilované vodě → homogenizace → třepačka … klinické vzorky: tělní tekutiny, stěr nebo pomocí lepivé pásky … a pak vysetí na Sabouraudův agar nebo bohaté médium → kultivace 2-7 dní při teplotách 22-42°C (37°C) identifikace/analýza: - fenotypové metody – morfologie kolonií, morfologie buněk (…spor) - biochemické vlastnosti (fermentace cukrů, asimilace uhlíkatých nebo dusíkatých substrátů … růst na chromogenních plotnách) moderní metody - PCR (nested, multiplex, RFLP), - sekvenační (NGS technologie), - hmotnostní spektrometrie Lékařská mykologie – Bi3390 V klinické praxi je důležitější rychlost než přesnost (při zachování správné léčby) http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/identifikace-kvasinek-z-klinickeho-materialu-prehled-soucasnych- moznosti-se-zamerenim-na-fenotypove-metody-a-komercni-produkty-455847 doc. P. Hamal, UP Olomouc http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/identifikace-kvasinek-z-klinickeho-materialu-prehled-soucasnych- moznosti-se-zamerenim-na-fenotypove-metody-a-komercni-produkty-455847 doc. P. Hamal, UP Olomouc Postup klinického vyšetření Campanhaetal.,2005,OralDIseases Fenotypové metody C. dubliniensis: nadbytek chlamydospor na koncích krátkých pseudohyf C. albicans: na delších hyfách či pseudohyfách jen jedna terminální chlamydospora - test klíčních hyf, C. albicans přímo z pozitivních hemokultur na kaseinový agar nebo kukuřičný agar (různý výsledek) Mikromorfologie - Kolonie Staibův agar (37°C) C. dubliniensis C.albicans - souprava Iatron Serological Candida Check Kit (Iatron Laboratories) nebo Bichro-latex Albicans (Fumouze Diagnostics) Sérologické testy Latexová aglutinace C. dubliniensis C. albicans Teplotní test Totéž platí pro kvasinky Specifické protilátky proti antigenům buněčné stěny (omezené …) Chromogenní testy  test enzymových aktivit - chromogenní substráty – např. tetrazoliové soli Cacr Cagl Caal Catr tetrazoliová sůl redukce Výše uvedené metody se používají běžně v klinických laboratořích Jsou k dispozici kompletní sady souprav Chromogenní testy http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/identifikace-kvasinek-z-klinickeho-materialu-prehled-soucasnych- moznosti-se-zamerenim-na-fenotypove-metody-a-komercni-produkty-455847 doc. P. Hamal, UP Olomouc * ** * * Candida, Saccharomyces, Rhodotorula, Cryptococcus, Trichosporon, Geotrichum, Kloeckera, Pichia Příklad analýzy: CANDIchrom – chromogenni metoda (enzymatická přeměna tetrazoliové soli) 1-2 dny *ELITex – latexové aglutinační metody (protilátky) 5 minut *ELIchrom – biochemický test (aktivita trehalasy) 20 minut ELIchromFUNGI – biochemické testy 1-2 dny Biochemické testy - Biochemické parametry – založeny na schopnosti utilizace uhlíkatých látek (cukrů), přeměnit dusíkaté látky (hydrolýza močoviny - ureasa) - Tato schopnost se odvíjí od metabolických schopností daného druhu – přítomnosti specifických enzymů (především dehydrogenas, fosfatás, βglukosidáza, β-N-acetylhexosaminidázy) (např. C. dubliniensis není schopna utilizovat D-xylózu, D-trehalózu, methyl-α-D-glukosid –chybí β-D-glukosidázová aktivita; C. albicans není schopna utilizovat glycerol) houndres Je možné určit až 267 druhů kvasinek z 53 rodů (ale pouze 50% spolehlivost) nárust kvasinek Molekulární taxonomie -konvenční taxonomie je problematická : - morfologie kvasinek není stabilní→ roztěr a nárůst trvá několik dní (prodlužuje se včasná diagnóza …) – - molekulární taxonomie (komerční účely - odlišit kmeny S.c.) - pulsní gelová elektroforéza (PFGE), FISH (karyotyp) - PCR, restrikční polymorfismus (odlišení druhů) - nejnověji MALDI-TOF (taxonomie) - většinu morfologických nebo enzymatických … charakteristik lze zvrátit mutací (v jediném genu) - obtížná izolace DNA, proteinů … z kvasinek - je třeba nejdříve narušit silnou buněčnou stěnu … pomocí enzymů nebo mechanicky - poté PFGE nebo dále extrahovat DNA (např. fenol-chloroform, poté srážení etanolem) - specifické sekvence lze identifikovat pomocí Southern blotu nebo PCR - izolace DNA a štěpení restrikční endonukleázou -> agarozový gel -> přesátí na membránu -> sonda značená digoxigeninem (většinou se využívá sekvencí rDNA) Identifikace založená na odlišnosti typických sekvencí DNA • 1. sada primerů je universální kvasinková (pozitivní kontrola, vyšší proužky) a 2. sada primerů je druhově specifická (méně konzervovaný úsek DNA) - separace gelovou elektroforézou (barvení ethidium bromidem, UV transiluminátor) • po PCR může následovat štěpení restrikční endonukleasou a odlišení druhů na základě odlišné délky štěpných produktů (tzv. RFLP – restriction fragment length polymorfism) x xx PCR Nested („zahnízděná“) PCR • amplifikace probíhá dvoufázově • v 1. fázi je pomocí jedné sady primerů (kvasinkové) namnožena delší sekvence nukleové kyseliny • takto získané amplikony jsou pak přeneseny do jiné amplifikační zkumavky obsahující druhou dvojici primerů (druhová), specifických k vnitřní oblasti úseku amplikonů • konzervovaná intergenová oblast rDNA • detekce gelovou elektroforézou • eventuálně sekvenace Romeo et al., J. Microbiol Met 79 (2009) univerzální primer (konzervativní oblast 5.8S rDNA) Candida glabrata 397bp Candida nivariensis 293bp Candida bracarensis 223bp Multiplex PCR • amplifikace se směsí primerů (jeden univerzální, druhý specifický) Klasická elektroforéza dokáže rozlišit fragmenty pouze do velikosti 40-50kb (větší molekuly se pohybují stejnou rychlostí nezávisle na velikosti) PFGE = pulse field gel electrophoresis (elektroforéza s měnícím se elektrickým polem, při změně směru elektrického pole trvá větším molekulám DNA déle, než se přeorientují - umožňuje separovat molekuly velké několik Mbp) • contoured clamped homogeneous electric field (CHEF) • gel obsahuje vzorky DNA uvnitř agarózových bločků (minimalizace náhodných zlomů velkých molekul DNA) PFGE Karyotypizace • S.c. kmeny mají podobný karyotyp – většinou se liší délkou chromosomu XII (podle počtu rDNA genů) • Průmyslové (pivní) kvasinky jsou většinou polyploidní – homologní chromosomy mají odlišné velikosti • Srovnání kmenů pro fylogenetické účely (intaktní nebo RE naštěpené chromosomy) • Určení příbuznosti izolátů jednoho druhu pro epidemiologické účely např. kmeny z různých míst od jednoho pacienta, kmeny od 2 různých pacientů, kmeny od zdravotního personálu a pacientů 20 (A) Nekompletní naštěpení RE (B) Degradace nukleázou (C) Oprava přidáním 75 mM thiomočoviny do pufru Studie populací S. cerevisiae a S. paradoxus • Sekvenace (+ hybridizace na čipech) > 100 kmenů z různých koutů světa (především vinné kmeny) • S. paradoxus – linie izolované podle lokalit • S.cerevisiae - 3-4 původní linie, které se díky člověku křížily … • ukazují na geografickou závislost Nature 458, (2009), p337 Studie populací S. cerevisiae • NGS sekvenace > 100 kmenů z různých koutů světa a různých biotechnologií • (SNPs) ukazují na geografickou závislost Gallone et al, Cell, 2016 pivní linie ve VB, US, Belgii … a další linie č.2 sake v Asii (i bioetanol v Číně) mixed - specifické silné belgické ales (refermentace v lahvích) - chleba Gallone et al, Cell, 2016 spirits – netvoří jednu linii (nepoužívají se opakovaně – není selektivní tlak – moderní technologie) S. paradoxus outgroup americké pivo má kořeny v Británii •pivo 1 a 2 - nové pivní linie (evolučně izolované –– 2 domestikační události - linie 2 domestikace s vinnými kmeny) - (geny podílející se na C a N metabolismu, flokulaci … mají nejvíce (CNV – copy number) variací) Mosaikové kmeny analýza genomu a fenomu: průmyslově-specifická selekce na toleranci ke stresu (vyšší obsah etanolu 7-15%), využití cukru, specifické aroma, nižší schopnost reprodukce „očkováním“ předchozích pivních kultur do nových kvasných procesů (ztráta kontaktu s přirodním prostředím - ~75 000 generací) – např. ztráta schopnosti sporulovat (stále bohaté médium), rychlejší evoluce … nebo naopak zvýšení resistence vůči sulfátům (přidávaným kvůli konzervaci) mutace a duplikace v MAL genech – zlepšení schopnosti utilizace maltosy - nonsense mutace PAD1 a FDC1 (snížení produkce 4-vinyl guaiacolu odpovídajícího za nepříjemné aroma piva) … Gallone et al, Cell, 2016 vznik klášterních pivovarů nejvíce amplifikací v MAL genech (IMA2, IMA3, MAL31, MAL33, MAL32) u pivních kvasinek (rostou na maltose), zatímco ve vinných kmenech došlo k mnoha delecím těchto genů (ve vinném moštu maltosa není) – obecně více delecí než amplifikací (v genomech analyzovaných kvasinek) Gallone et al, Cell, 2016 analýza genomu hierarchické členění výsledků analýzy fenotypu (fenomu) – určitá korelace s genomem … - pivní linie (beer1) nejsou příliš odolné vůči stresu (nejsou mu vystaveny v pivovarech), zatímco vinné kvasinky jsou velice odolné (kvasné prostředí je bohaté na cukry a vyšší koncentrace alkoholu – hladina cukrů se v různých sezónách liší … mimo sezonu přežívají v „přírodním“ prostředí – musí být adaptabilnější než pivní) Gallone et al, Cell, 2016 analýza fenomu víno pivo hierarchické členění výsledků analýzy fenotypu (fenomu) – určitá korelace s genomem … - pivní linie (beer1) nejsou příliš odolné vůči stresu (nejsou mu vystaveny v pivovarech), zatímco vinné kvasinky jsou velice odolné … zvýšení resistence vůči sulfátům (přidávaným kvůli konzervaci) analýza fenomu víno pivo Gallone et al, Cell, 2016 Gallone et al, Cell, 2016 - divoké typy chrání před rostlinnými toxiny - při pečení chleba jsou tyto látky zničeny - pivní kmeny - nonsense mutace PAD1 a FDC1 (snížení produkce 4-vinyl guaiacolu odpovídajícího za nežádoucí aroma piva) - křížily pivní kmen schopný produkce 4-vinyl guaiacolu s kmenem pro výrobu saké (vysoká produkce alkoholu) - pivní produkt se specifickým aroma a vysokým obsahem alkoholu - + • hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry– MALDI-TOF) • Umožňuje odpaření a ionizaci netěkavých biologických vzorků z pevné fáze přímo do plynné • Vzorek je smíchán s tzv. matricí, směs se nanese na speciální kovovou destičku a nechá zaschnout • Destička se vloží do iontového zdroje a ve vakuu je ozářena pulsním laserem (UV) • Energii laserového pulsu absorbuje matrice a předá ji molekulám analytu – odpaří se • ion vstupuje do vakua v trubici detektoru - z jeho pohybu vakuovaným prostorem lze vypočítat poměr jeho hmotnosti a náboje (z doby letu částice) MALDI-TOF • Charakter spektra závisí na krystalizaci a ionizačních vlastnostech vzorku  výška píku je rovna relativní koncentraci proteinu v místě ionizace • Při srovnávání spekter druhů uvnitř rodu se hledají rodově charakteristické signály píků • Identifikace na úroveň kmenů možná díky detekci charakteristických proteinů a peptidů Qian a spol, Anal Bioanal Chem, 2008 MALDI-TOF Konecna a spol, JAFC, 2012 Proteiny v pivu Stříbrem barvený 2D gel Opathy, C., Gabaldón, T. (2019). Recent trends in molecular diagnostics of yeast infections: from PCR to NGS, FEMS Microbiology Reviews, 43 (5), 517–547. doi: 10.1093/femsre/fuz015 kvasinkové modely • Rychle se množící EUKARYOTNÍ mikroorganismy (90 min/dělení, 25-30°C) • Vytváří kolonie na plotnách - mikrobiologické metody (otiskování ploten, kapkovací test => toxiny v plotnách – HU, MMS …) • Stabilní haploidní i diploidní formy • Haploidní buňky lze křížit na diploidní (heterozygotní mutanty) • Diploidní buňky lze sporulovat a využít pro genetickou analýzu (tetrádová analýza) • Lze transformovat DNA (plasmidy i linearní) • Centromerické a multicopy plasmidy • Vysoká frekvence homologní rekombinace (lineární DNA) • Lze připravovat deleční a mutantní kmeny • Vydrží v >15% glycerolu na -70°C „indefinitely“ - Více v dalších přednáškách kvasinkové modely • S.c. má kompaktní genom – knihovny s genomovou DNA (ne cDNA) • Kompletně osekvenovaný genom (genomové aplikace) • EuroFan projekt – delece všech S.c. genů (+GFP, +2-hybrid) • Mikročipy, NGS - expresní profily za různých podmínek • 6. FP – „3D Repertoire“ konsorcium (http://www.3drepertoire.org) strukturu všech (cca800) komplexů S. cerevisiae • Techniky synchronizace buněk • Techniky barvení (např. aktinový cytoskelet = phaloidin, buněčná stěna = calcofluor) • Řada životních dějů má analogii v procesech v savčích buňkách (lidské geny testovány v kvasinkách - nemoci, metabolismus, regulační mechanismy) Bellen a spol, Devel., 2021 • Techniky barvení – FISH – lokalizace spec. sondy – DNA/jádro – DAPI (4',6-diamidin-2-fenylindol) – aktin – phaloidin – buněčná stěna – calcofluor – Endocytóza ->vakuoly – FM4-64 – Mitochondrie, ER - DiOC6 (3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide) – proteiny tagované GFP (in vivo) … metody studia – fluorescenční … Matsuyama et al.: Nature Biotech, 2006 Určení lokalizace Chong et al., Cell, 2015 Koh et al., G3, 2015 http://cyclops.ccbr.utoronto.ca/ Picotti et al., Nature, 2013 Vygenerování referenční „mass-spectrometric“ mapy pro kvasinkový proteom Tak jako se sekvenoval kvasinkový genom (první eukar.), tak se „sekvenuje“ proteom – slouží ke sledování exprese/přítomnosti proteinů v kvasinkové buňce za různých podmínek/situací (např. změny proteomu v průběhu buněčného cyklu, změny metabolismu na různých substrátech) MALDI-TOF Elektronová mikroskopie - studium buněčné stěny … organel (sekrece …) více prof. Svoboda - šipky ukazují na jaderné póry - vzorek „prosáknut“ epoxypryskyřicí a osmiem - „focused-ion beam scanning“ 3nm/pixel TEM FIB - SEM Wei, et al., BioTechniques, 2012 cryoEM tomografie http://www.biotechniques.com/multimedia/archive/00182/Cyzmmek_Supplementa_182027a.mpg Wei,etal.,BioTechniques,2012 ER mitochondrie jádro cytoplasmatická membrána s invaginacemi http://www.biotechniques.com/multimedia/archive/00182/Cyzmmek_Supplementa_182027a.mpg Wei, et al., BioTechniques, 2012 Wang, Current Genetics, 2016