Osnova 2. přednášky • Základní charakteristiky kvasinek -Taxonomie, evoluce - Podmínky růstu, růstové formy, sporulace ... • Morfologie buněk, kolonií... -Amoniak - Aglutininy, flokulace -Adhesiny, invasiny - Killer toxiny Taxonomie kvasinek - Kvasinky se řadí do domény (nadříše) Eukarvota, říše hub (ačkoliv jsou to mikroskopické jednobuněčné organizmy) Bakterie Kvasinka Četnost v lidském 99% <1% mikrobiomu Velikost buňky 1um 10um Buněčná stěna peptidoglykan, LPS, LTA chitin, mannan (PPM, PLM), glukan pH 6,5-7,5 4,5-6,5 Teplota 10-80 20-30 Rezistence na antibiotika Ne Ano Přenos genetického Ano Ne materiálu Jádro Ne Ano LPS - lipopolysacharid, LTA - lipoteichoová kyselina PPM - fosfopeptidomannan, PLM - fosfolipomannan Taxonomie kvasinek - Kvasinky se řadí do domény (nadříše) Eukarvota, říše hub (ačkoliv jsou to mikroskopické jednobuněčné organizmy) - netvoří žádnou přirozenou taxonomickou skupinu (nemožné je jednotně definovat) - roztroušeny ve dvou odděleních hub: houby vřeckovvtrusné nebo stopkovvtrusné (asko-, basidio- a deuteromycetes + kvasinkové mikroorganismy) - 1500 identifikovaných (odhad o několik řádů vyssi) Saccharomyces cerevisiae: nadříše > Eukaryota říše_> Funai (houbv)_ ■ir.iV.t-: i. II norwnotile sexual muHiMíluiar ingest multicsílular aňsůrí) ntnrnot>le sexual oddělení pododdělení třída řád čeleď rod druh („laboratorní kmen") Ascomycota (vřeckovýtrusé) Ascomycotina (hemi) Ascomycetes > Saccharomycetales (kvas i n kotva > Saccharomycetaceae > Saccharomyces > Saccharomyces cerevisiae 4 wikipedie Hedges, Nat Rev Genet, 2002 Kvasinky netvoří žádnou přirozenou taxonomickou skupinu - jsou roztroušeny ve dvou odděleních hub, buď jako houby vřeckovvtrusné nebo stopkovvtrusné pododdělení/třída: oddělení i—Pezizomycotina (47,000 5pp.) —T*— Saccharomycotina (300 spp.) '— Taphrinomycotina (120 spp.) _ i—Urediniomycetes (8,000 spp.) |_p Ustilaginomycetes (1,500 spp.) Hymenomycetes (20,000 spp)_ -Glomales (160 spp.) Zygomycetes/Mucofales {700 spp.) -Chitridiomycota (900 spp.) říše hub: Ascomycota (47,420 spp.) Basidtomycota (29,500 spp) 670 3 70 1.09D± SO Většina využívaných kvasinek je z třídy (hemi)ascomycetes 1.140± l.?10± na I—| PsnicSSum cnrysogenum [penicillin fungusf Coccidtoides imm'nis [coccidioidomycosis fungusf I—| Fusarium graminearvm Sordariomycetes (head scab fungus} 1—| Nmrospora crassa (orange bread mould) Magnaponhe grisea [rice blast fungus) (pyrenomycetes) Yarrowia iipoiyiica (yarrowia yeast) Sacch arómy c oli na íHemiíiicomycetes) i—I Saccharomyces cerevisiae s L™1 (bater's yeast) ^__ Candida albicans (patriogenic yeast) .Q70± 90 l_ Schizosaccharomyces Tapftrinomycottna pombe (fission yea si) (Anchiascomycetes) Pneumocystis carinii (pneumonia fungus) CO H—' O ü >^ E o N N 30% buněk v populaci) LP = low penetrance (<30% buněk v populaci) Kvasinková forma - morfologie visualní analýza kvasinek deleční knihovny -3500 kmenů (1. genome-wide) - např. delece genů regulujících buněčnou polaritu S. pombe způsobovaly oválný tvar buněk rounded buněčná stěna (a> miss E miss V miss weak V long HP long LP long Br rounded stubby curved small skittle ZU o - • ^ stubby buněčná stěna a aktin krátké/tlusté mikrotubuly 400 morfologii kvasinek určují různé procesy: cytoskelet ... (více v dalších přednáškách) co o CM O CD i Ca_th8ti Ca_m1g1&t Ca_m(gib . . i > "l • • ■ □ » f\ t, 1 Iv* •» ' l'i'> , « / » f f í • > . '"V • " A V ■ 'i i B Pseudohyp hal Grow • ni • Bio H film a □ • • • • n O □ • • o s o: :o Phenotypic Score 3S2 SfeS Phenotypic Score -7 0 10 -26 0 26 - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (invasivní růst, pseudohyfy, biofilm, flokulace) - FL011 = adhesin (glykoprotein - faktor důležitý pro uchycení - Flo8, Mfg1 jsou TF aktivující transkripci Flo11 - Flo11, FI08, Mfg1 faktory jsou konzervovány . a podílí se na invasivních vlastnostech (virulenci) patogenních kvasinek C. albicans Ryan et al, Science (2012) Invasion 190 FL011 RIM101 RPD3 FLOS SIN3 TEC1 RXT2 MSS11 MIT1 MFG1 SPE1 SPE2 "* SPE3 SPE4 Biofilm Pseudohyphal F ✓ wt • • • • • • • * □ • • • • digit i • • • • • • ♦HE • • • • Score 10 I. -7 adhesin Relative FZ.OÍ ipr-GFP expression o ca o.e o.* 1.2 1.5 i.a - Flo8, Mfg1 jsou TF aktivující transkripci Flo11 - Dig1 je represor transkripce Flo11 - FL011 = adhesin (glykoprotein - faktor důležitý pro uchycení - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (... biofilm, flokulace) Ryan et al, Science (2012) 1 "i'',-<;,", i i ■.■Tijfiri ^^^B ■ .■cřťíů ^2^1 H p tutu 1 1—1 Flokulace reverzibilní schopnost kvasinek shlukovat se, tvořit větší celky (vločky, f loky); odpověď na stres flokulace je významná vlastnost využívaná např. při produkci piva (snižuje náklady na filtraci Diva) flo1 FLOl -ovlivněno složením média, genetickou výbavou kmene (skupina FLO genů), teplotou, stavbou a morfologií buňky ... - Flolp váže manany na povrchu buněk stejného druhu (S.c.) => agregace - NewFlo váže manosu i glukosu => glukosa v mediu inhibuje agregaci -teprve po přeměně cukrů na etanol se važe na buněčnou stěnu ostatních buněk a dochází k vločkování Smukallaa kol., 2008, Cell Verstrepen, 2006, Mol. Microbiol Yeast surface display - His-His-His-His-His-His (chelatuje Ni, Cu, Co kovy) -GTS1 transkripční faktor spouštějící aglutinaci pod CUP1 promotorem (další přednášky) - biosorbce & sedimentace (100 uM CuS04) (without C11SO4) - hybrid Aga2 (aglutininy nebo Flo1 ...) s testovaným proteinem - exprese eukaryotních proteinů v kvasince (podobné mechanismy ... posttranslační modifikace) - knihovny lidských cDNA (i protilátek z pacientů) - využití i pro biotechnologie - vychytávání těžkých kovů (dekontaminace) Kuroda et al, Appl Microbiol Biotechnol (2002) Pepper et al, CCHTS (2008) YSD - testy antigen/protilátka - v kvasince je exprimována knihovna (např. IgG klonů) - na kuličkách je navázán antigen (fluorescenčně značený) - opakováním vychytávání dojde k nabohacení (i slabších interakcí) Boder et a!j Arch Bioch Bipnys (2012) Pseudohyfy, adhesiny ... a candidalysin Kvasinky C. albicans jsou schopny se přichytit k epiteliálním buňkám hostitele (pomocí adhesinů - Hwp1) - invasiny (Als3 a Ssa3 mohou interagovat s receptory) se podílí na vnoření pseudohyfy do buněčné membrány hostitele - Ece1 je rozštěpen Kex2/Kex1 proteasami na peptidy (Golgi), které jsou sekretovány a vytváří (peptid III) póry v cytoplasmatické membráně (jako bakteriální toxiny) Mitchell, Nature, 2016; Moyes et al., Nature, 2016; Los et al, MMBR, 2013 Killer toxiny Některé kmeny S.cerevisiae produkují tzv. killer toxiny (proteiny a glykoproteiny sekretované do prostředí), které jsou letální pro citlivé kvasinky i bakterie; ekologická výhoda (výhoda pro vinaře - nepřerostou je cizorodé kmeny) - Poprvé analyzováno v roce 1963 (Makower a Bevan) kvasinky zabíjí podkladový kmen (K1=laboratorní, K2 a K3=vinařské kvasinky) - Kvasinky ze stejné skupiny se navzájem nezabíjí (preprotoxin ...) - Geny jsou kódovány na dsRNA obalené ve „virus-like particles (VLP, připomínají savčí dsRNA viry) - kódují obalové, replikační proteiny (ale potřebují buňku k replikaci ...), transkripční sekvence a toxin - Samotné VLP nejsou infekční (nejsou uvolňovány z buněk - lze je přenést konjugací buněk nebo fůzí protoplastů) ani toxické (preprotoxin v původní buňce interaguje/inaktivuje maturovane/sekretované toxiny) - Toxin je sekretován a váže se na buněčné stěny (p-1,6-glukany) -způsobuje perforace/póry v cytoplasmatické membráně - ztráta iontů, potenciálu ... buňka hyne - Kluyveromyces lactis, Píchla membranifaciens - lineární dsDNA (v cytoplasmě, pGK11), bez kapsidy, toxin se váže na chitin (chitinásová aktivita) - Hansenula mrakii... - geny na chromosomech, toxin inhibuje syntézu p-1,3-glukanu (v místě růstu pupenu) Table 2. Killer activity of P. membranifaciens CYC 1 086 and CYC 1106 against yeasts and fungi of biotechnological interest Sensitive strain K i Ik i ii\ Sensitive strain Killer activity Sensitive strain Killer activity 1086 1106 1086 1 106 1086 1106 S. cerevisiae SGV — — B. bnixeilensis 1D007 3 + — Pidiia anomala 11141 — — S. cerevisiae CEG - - B. bnixeilensis D013 1 + - Pichia membranifaciens CYC 1070 2 + S. cerevisiae VRB - 3 + B. bnixeilensis DO 14 1 + - Aspergillus spp. 27 - - 5. cerevisiae NEM - - B. bnixeilensis D015 1 + - A, carbonarhis B MUM - .S". cerevisiae 2056 - 2 + B. bnixeilensis DO 17 2 + - A. orchraceus - S. cerevisUie BM45 - 3 + B. bnixeilensis DO 18 1 + - A. oryzae - S. cerevisiae 2323 - - B. bnixeilensis DO 19 1-f - A. tubingensis - S. cereviswe ALB — 3 + B. bnixeilensis D027 1 + - Fusarium culmorum — - S. cerevisiae SLO - 4 + B. bnixeilensis D028 1 + - F. gramineantm NRRL 28525 - - S. cerevisiae VN - - ß. bnixeilensis D029 2 + - F. graminearum NRRL 29020 - S. cerevisiae 71B - 4 + B. bnixeilensis D031 1 + - F. pone - S. cerevisiae CS2 - 1 + B. bnixeilensis D032 1 + - F. proliferatum MM 1-2 2 + S. cerevisiae CM - - B. bnixeilensis D033 1 + - F. proliferatum MM 3-1 2 + S. cerevisiae HAY - - B. bnixeilensis D035 2 + - F. proliferatum MM 6-2 - - S. cerevisiae FS - 3 + B. bnixeilensis D036 1 • - F. retiatlloides MM 6-3 - - S. cerevisiae 16 - - B. bnixeilensis D038 1 + - F. retiatlloides MM 7-3 - S. cerevisiae 17 - 3 + Debaryomyces hansenii 1021 - - F. sporotrichohles ITEM 550 - S. cerevisiae 18 - 3 + D. hansenii 1244 - - Botrytis cinerea 20003 3 + S. cerewsiae 19 - - D. hansenii 10388 - - ß. cinerea 20004 1 + S. cerewwc SCI — 4 + D. hansenii 10386 — — ß. cinerea 20005 24- ■ f ff ' O v 1 f . - Kontaminace vinných kultur kmenem Brettanomyces bruxellensis může být potlačena Pichií membranifaciens - Význam při ochraně průmyslových kmenů (proti kontaminaci - odolné vůči toxinu a zabijí kontaminanty) - v léčbě (některé S.c. killer kmeny zabíjí kmeny Ca., C. podzolicus zabíjí Santos et al., 2009, Microbiology