Protoplasty kvasinek jako modelový objekt 1. Historie objevu modelu protoplastů 2. Metody přípravy protoplastů 3. Metody regenerace buněčné stěny u protoplastů 4. Fuze protoplastů 5. Genetická transformace kvasinek na modelu protoplastů 6. Sexuální hybridizace u protoplastů Cell wall lysis or mechanical rupture Plant cell 1. Historie objevu • Protoplasty rostlinných buněk (Klebs 1887,Townsend 1897) • Sféroplasty, L-formy a protoplasty bakterií (Weibull 1953, Dienes 1939, Kandler, 1954) • O.Nečas a plasmatické koule kvasinek (Nečas 1954) • Autolytické protoplasty (Nečas 1955) • Protoplasty připravené lýzou b. stěny helikázou (Eddy a Wiliamson,1959) • Regenerace protoplastů v gelech (Nečas, 1962, Svoboda 1966) 2.Metody přípravy protoplastů • Mechanické rozbití kvasinkových buněk v hypertonickém roztoku • Autolýza buněčné stěny • Aplikace enzymů lyzujících buněčnou stěnu – Výběr osmotika - sorbitol, mannitol, KCl, MgSO4 a koncentrace – Aplikace látek rušících S-S vazby v buněčné stěně – merkaptoetanol,dithiothreitol aj Buňky kvasinky Saccharomyces cerevisiae a čerstvě vytvořené protoplasty Trigonopsis variabilis Protoplasty S. cerevisiae ve fázovém kontrastu (3a) a po lýze v destilované vodě – pokovený preparát v elektronovém mikroskopu (3) Tvar rostoucího protoplastu je není určován regenerující buněčnou stěnou, ta jen modifikuje morfologii rozpínající se cytoplasmy Kultivace protoplastů S. cerevisiae v tekutém mediu. Protoplasty rostou polárně nebo multipolárně, vakuolizují, probíhá karyokineze, cytokineze je však zablokována. Na povrchu rostoucích protoplastů se tvoří fibrilární síťovina tvořená ꞵ-1,3 glukanem, mannanproteiny jsou uvolňovány do media Fibrilární síťovina na povrchu protoplastu rostoucího v tekutém mediu. Ultratenký řez v ELM N N MT V GA BS Regenerace protoplastů v želatinovém gelu: protoplasty zůstávají sférické, zvětšují svůj průměr, jádra se dělí a na povrchu je zřetelná pevná stěna. Po 8 – 12 hod. kultivace se objevují pupeny a vytváří se mikrokolonie buněk. Želatina a další gely (agar, alginát) patrně „dočasně“ nahrazují buněčnou stěnu – zabraňují difuzi stěnového materiálu z povrchu protoplastu, a tak umožňují jeho organizaci do pevné buněčné stěny Tvorba kompaktní buněčné stěny na povrchu protoplastů Povrch a řez kompaktní buněčnou stěnou Morfologie regenerace protoplastů v agarovém gelu První generace revertovaných buněk mají abnormální morfologii, která se u dalších generací postupně vrací k typické elipsoidní formě Regenerace protoplastů v polyethylenglykolovém mediu: po různě dlouhé době tubulárního růstu se objevují regenerované normální buňky. Protoplasty některých kvasinek (Sch. pombe) nevyžadují pro regeneraci na buňky obklopení gelem a mohou regenerovat i na povrchu agarových filmů nebo v tekutém mediu. Před reverzí na buňky rostou určitou dobu tubulárně, pokračuje tvorba fibrilární stěny, která po dosažení určité hustoty nahradí gelové prostředí. Vývoj protoplastu Sch. pombe na povrchu agarového media. Protoplast roste polárně, nejstarší části se zakulacují a mají zřetelnou pevnou stěnu. Pak vzniká septum a v další generaci se již objevují cylindrické buňky typické pro Sch. pombe. Izolovaná buněčná stěna u revertovaného protoplastu Sch. Pombe. Hrubá stěna na povrchu protoplastu Hladký povrch buňky Aglutinace protoplastů ve 40% polyethylenglykolu a vytváření polyprotoplastů po zředění živným mediem Povrchy agregovaných protoplastů ve 40% PEG Lokální poruchy struktury plasmatické membrány po inkubaci protoplastů ve 40% PEG 30 min při 370 C. Je pravděpodobné, že v těchto místech začíná fuze cytoplasmy adherovaných protoplastů Adherující plochy aglutinovaných protoplastů v 40% PEG Aplikace protoplastů kvasinek v buněčné biologii a genetice 1. Studium funkce buněčné stěny ● mechanická bariéra ● signální funkce – recepce stresových faktorů, feromonů aj ● recepce signálů pro start cytokineze ● syntéza komponent buněčné stěny 2. Studium struktury plasmatické membrány 3. Studium nepohlavní hybridizace kvasinek cestou fůze protoplastů 4. Transformace kvasinek izolovanou DNA Mezidruhová fuze S.cerevisiae his- x S.pombe trp- :tyto druhy jsou fylogeneticky vzdálené, S. cerevisiae má 16 chromosomů, S. pombe pouze 3. Protoplasty mohou fúzovat, v minimálním agaru i rostou, na hybridní buňky však nerevertují Růst protoplastů v tekutém mediu nebo na povrchu agarových bločků: jádra se dělí, cytoplasma vytváří vakuolizované útvary, avšak cytokineze neprobíhá. Závěr: Nekompletni fibrilární stěna pouze moduluje tvar zvětšující se cytoplasmy, nevede však k obnovení normální buněčné morfogeneze Protoplasty S.c. α + a, pouze neorientovaný růst, žádná fuze α protoplasty + a buňky: párovací výběžky tvoří pouze buňky Orientovaný růst buněk směrem k rostoucímu protoplastu – žádná fuze Protoplasty S.c. α + a, pouze neorientovaný růst, žádná fuze α protoplasty + a buňky: párovací výběžky tvoří pouze buňky Orientovaný růst buněk směrem k rostoucímu protoplastu – žádná fuze Orientovaný růst buněk směrem k rostoucímu protoplastu – žádná fuze Protoplasty opačných párovacích typů fúzují teprve tehdy, zregenerují-li svoji buněčnou stěnu