Imunosensory [USEMAP] Struktura IgG • Fc S-S vazby COOH COOH NH2 NH2 membránový úsek Fab Fv sacharidové řetězce CH1 CH2 CH3 CL VL VH [USEMAP] IgG CDR úseky FR úseky konstantní variabilní hypervariabilní papain pepsin FR - „framework“ (konstantní) CDR - „complementary determinant region“ (hypervariabilní) papain ... 2 x Fab + Fc pepsin ... F(ab’)2 + Fc V1 Vn D1-n J1-4 C m C d C g 3 etc. n=2 .. 300 n ~ 12 1 C geny pro podtřídy V1 Vn J1-5 C n=2 .. 300 L (k) chromosom 6 H chromosom 12 Kombinace genů (myší IgG) [USEMAP] Immunoglobuliny IgG IgA IgM Vlastnosti protilátek (myší třídy) Třída IgA IgD IgE IgG IgM M (kDa) 170 180 190 160 900 H řetězec a d e g m Sacharid (%) 7-11 12-15 12 2-3 9-12 Spojení haptenu s nosnou bílkovinou V místě determinanty Mimo determinantu - nízká specifita Ab vysoká specifita Ab [USEMAP] Polyklonální protilátky 2. Získání antiséra 1. Imunizace Příprava imumizací experimentálních zvířat (koně, kozy, ovce, králíci, myši,...) antigeny lze použít přímo, hapteny se musí spojit s nosnou bílkovinou Afinita vzniklých protilátek je obvykle velmi vysoká; polyklonální antisérum obsahuje populaci různých protilátek s odlišnými afinitami [USEMAP] buňky produkující protilátky 4. Klonování (limitní ředění) v tkáňové kultuře (5-50 µg/L) 3. Selekce - kultivace v HAT mediu nezfúzované hybridomy nezfúzované myelomy slezinné buňky nepřežijí v HAT mediu nepřežijí v kultuře 1. Imunizovaná myš nebo krysa myelomové buňky + + polyethylenglykol 2. Fúze buněk slezina 5. Produkce protilátek jako ascitická tekutina (5-15 mg/mL) A B C D klony prdukující různé protilátky Monoklonální protilátky [USEMAP] převedení výroby ascitické tekutiny (produkce protilátky in vivo v myších) do in vitro podmínek (produkce v tkáňových kulturách) výroba velkých šarží (gramová množství) v kontinuálních fermentačních systémech (ověření procesu, výběr vhodných médií) Výroba monoklonálních Ab [USEMAP] Rekombinantní protilátky buňky produkující protilátky V H C H V L C L extrakce mRNA transformace na cDNA amplifikace variabilních částí spojení, další amplifikace DNA scFv fragmentu vložena do plasmidu či fága, exprese scFv v buňkách linker Příprava [USEMAP] V H V L V H V L V L V H V H V L V L V H V H A V L B V L A V H B monomer nekovalentní dimer kovalentně křížený dimer „diabody“ Formy scFv molekul [USEMAP] rAb z fágových knihoven •fágová knihovna: semisyntetická scFv VH+VL, kolekce scFv phagemidů připravenou ze syntetických V-genových segmentů exprimovaných na povrchu filamentózního fága •selekce scFv protilátek •konjugát analytu s nosným proteinem se smíchá s polyklonální populací rekombinantních fágů, po inkubaci se komplexy analyt-rekombinantní fág zachytí na povrch magn. částic (např. interakce avidin-biotin), nenavázané fágy se odstraní promytím •navázané, tedy antigen-specifické fágy se uvolní z mg. částic a použijí poté k infikování buněk E. coli •specifickými fágy infikované E. coli buňky jsou poté namnoženy a infikovány helper fágem (spustí replikaci rekombinantních fágů) •namnožené fágy jsou poté koncentrovány precipitací polyethylen glykolem a použity v dalším kole selekce uvedné výše (4 kola) •ELISA testem se vyberou monoklonálními fágy s reaktivitou výhradně proti molekule analytu • [USEMAP] Formáty imunostanovení kompetitivní sendvičové Protilátka (Ab) Analyt Značka (enzym, fluorofor, ...) [USEMAP] Imunostanovení Kompetitivní Sendvičové limitující obsah Ab afinita určuje citlivost Ka nízká vysoká [analyt] [analyt] Signál nadbytek Ab afinita méně důležitá pro citlivost [USEMAP] Parametry imunostanovení Limit detekce střed křivky Ka vysoká nízká [analyt] 1 0.8 Brel 0.5 0 měřený signál ... Y Brel = (Y - Yblank) / (Ymax - Yblank) křížová reaktivita = xA50/xB50 • 100% kalibrační závislost = (A - D) / (1 + (x/x50)b ) + D osa x - logaritmická škála 0.1 1 10 100 1000 [USEMAP] Optické imunostanovení změna tloušťky vrstvy vede ke změně barvy odražené světlo Přímé vizuální hodnocení analyt biovrstva optická vrstva Si „wafer“ [USEMAP] •imunostripy – samovolný pohyb roztoků v membránovém systému prostřednictvím kapilárních sil •záchytné zóny, zviditelnění pomocí barvotvorné enzymové reakce, případně zlaté nanočástice (červené) •vizuální vyhodnocování ELISA-on a strip [USEMAP] ELISA-on a chip •plastový přípravek („čip“) pro vložení úzkého imunostripu – zlepšená reprodukovatelnost transportu látek •pohyb vzorku jedním směrem, pohyb substrátové směsi v kolmém směru pro inspiraci: www.microfluidic-chipshop.com [USEMAP] • ELISA-on a chip •vyhodnocovací systém na bázi CCD kamery (dnes smartphone) •zlepšená reprodukovatelnost díky srovnání odezvy kontrolní a měřící zóny [USEMAP] Enzym Enzym Enzym P S e- 1.Inkubace se vzorkem a s „tracerem“ – konjugát Ab (nebo Ag) se značkou 2. Separace, promytí 3. Přídavek substrátu pro enzym (inkubace) 4. Změření signálu Elektrochemická imunostanovení [USEMAP] Pseudohomogenní stanovení - bez separace a promývacích kroků Zvýšená reakční odezva vzniká na povrchu důsledkem těsného kontaktu dvou kooperujících enzymů Enzymové „tunelové“ imunostanovení Enzym 1 Enzym 2 konjugovaný s analytem S1 P1 = S2 P2 Protilátka [USEMAP] FCFD fluorescence capillary fill device •je optický afinitní imuno/biosensor, využívá k detekci fluorescentní značku (fluorofor) •značka emituje světlo do planárního světlovodu, nesoucího imobilizovaný bioligand •základem jsou dvě paralelní skleněné destičky vytvářející pracovní prostor o tloušťce pouze 0.1 mm ("kapilární" rozměr), což umožňuje samovolné naplnění definovaným objemem vzorku. •po afinitní interakci je část fluoroforu volně v roztoku a část je vázána v komplexu s bioligandem na povrchu světlovodu •emitované světlo (fluorescence) z roztoku vstupuje do světlovodu jen pod omezenými úhly (větší než kritické), světlo z vázaných fluoroforů může vstupovat i pod menšími úhly (fluorofor je vázán v penetrační oblasti exponenciální vlny). [USEMAP] FCFD •po výstupu světla z konce světlovodu pak lze podle výstupního úhlu odlišit fluorescenci z volného roztoku a z povrchové oblasti, tím lze kvantitativně určit podíl vázaného fluoroforu bez separačního kroku - homogenní stanovení •Výstupní úhly světla emitovaného vázaným a volným fluoroforem (např. fluorescein), se liší, což umožňuje jednoduše rozlišit vázanou a volnou formu fluoroforu, a tak vyhodnotit průběh homogenního imunochemického stanovení. [USEMAP] FCFD •zdroj světla - výbojka fotoblesku, omezení výstupních úhlů se provede pomocí štěrbiny, další součásti filtry, čočky a detektor •zařízení je jednoduché, levné, snadná masová výroba, na jedno použití •malé vzdálenosti v systému sensoru zkracují dobu odezvy, kterou pak primárně určuje kinetika vazebné interakce, ne transportní pochody (5 min kompetitivní, 15 sendvičové stanovení •není třeba odměřovat vzorek (přímo krev, sérum, moč), nejsou nároky na manipulaci. filtr štěrbina čočka zdroj sv ětla (výbojka) pro excitaci fluoroforu světlovod D FCFD sensor [USEMAP] Excitace fluoroforů evanescentní vlnou •imunoreakce probíhá na povrchu světlovodné vrstvy •evanescentní vlna se šíří mimo světlovod, kde excituje tam přítomné fluorescentní značky, navázané v průběhu imunostanovení •světlovod pak dále slouží jako „sběrač“ záření emitovaného při fluorescenci [USEMAP] Imunosensory - enzymové značky •peroxidasa (HRP) –substráty - vždy peroxid vodíku plus další oxidovatelné látky: –3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) měření fotometricky při 450 nm –2,2'-azino-di(3-ethyl)benzthiazolin sulfonová kys. (ABTS) při 650 nm –5-aminosalicylová kyselina (ASA) při 450 nm –elchem: jodid, hydrochinon, ferrocen, ASA, ... •lakasa –obdobná HRP, ale stačí jí kyslík místo peroxidu vodíku •alkalická fosfatasa (ALP) –p-nitrofenylfosfát (PNPP), hydrolysou vznikající p-nitrofenol se stanovuje fotometricky v alkalické prostředí kolem 405 nm –p-aminofenylfosfát (PAPP), vzniklý aminofenol se oxiduje na elektrodě •β-galaktosidasa –o-nitrofenyl-β-D-galaktosid (ONPG), hydrolysou vzniklý o-nitrofenol se měří při 420 nm •ureasa –močovina, změna pH vyvolaná hydrolysou se měří pomocí indikátoru bromkresolová modř při 588 nm, nebo potenciometricky (LAPS) •glukosa oxidasa –velmi stabilní, měří se generovaný peroxid vodíku •acetylcholinesterasa –vysoké číslo přeměny • • [USEMAP] Imunosensory - fluorescenční značky •fluorescein, tetramethylrhodamin –klasické, dostupné v aktivované formě (NHS, biotin, ...) •Cy5, Cy3 - cyaniny, NIR 650/667 nm –levná instrumentace •QD „quantum dots“ –anorganické nanočástice obsahující volné elektrony, s velikostí narůstá vlnová délka emise, stabilita a vysoké výtěžky, velké Stokesovy posuny [USEMAP] Imunosensory - fluorescenční značky •cheláty lanthanidů (Eu, Sm, Dy) –dlouhá životnost excitovaného stavu –Time Resolved Fluorescence Unique fluorescence properties of lanthanides, large Stokes’ shift [USEMAP] Kvantové tečky (QD) •unikátní fluorescenční vlastnosti - stabilita vůči fotorozkladu, velké Stokesovy posuny •CdTe jádro obalené CdS, rozpustnost díky vazbě thioglykolové kys. (TGA) •prekurzory - Te, CdCl2, TGA a NaBH4 –NaHTe připraven redukcí Te pomocí NaHB4 –nástřik roztoku NaHTe do směsi CdCl2 a TGA v inertní atmosféře –refluxace na vzduchu (minuty až hodiny) •při zahřívání roste průměr QD, emisní maximum se posouvá k delším vln. délkám •větší QD mají lepší stabilitu [USEMAP] Připravené QD [USEMAP] Kvantové tečky (QD) •QD s teluridovým jádrem, obal CdS, povrch modifikován - glutathion, thioly s funkční skupinou, křemičitanová slupka, … [USEMAP] Elektrochemiluminiscence BioVeris™ technologie: rychlý “mix and measure” homogenní formát značka biotin analyt ve vzorku mg. kuličky potažené streptavidinem značka analyt kulička (zvětšeno) [USEMAP] Purpose of this slide: Explain ease of formatting assays (keep it general) and solution phase kinetics Points to cover: This format is familiar to you. Each assay has a solid support (point to the bead), a capture moiety (point to bioitnylated ab) and a detection ab (label). The power of ORIGEN Technology is how it uniquely uses the bead-based format with the label chemistry to generate signal. •Combine assay reagents with label, sample •Add magnetic beads (our solid phase) •Solution phase kinetics, speeds up assays •Generates assay complex on magnetic bead •This one example of a sandwich immunoassay. Many Different assay formats possible: through the binding of biomolecules, the ORI-TAG label is bound to the surface of the bead and light is produced and detected. •This is a complete system where all reagents can be mixed together at once, it is homogeneous to the user Transition: It is the label which confers the unique properties to electrochemiluminescence. That is, the voltage dependent production of light. The structure of the label and it’s unique properties are shown on the next slide. •Stabilní neizotopická značka, různé formy pro různé biomolekuly: • •BV-Tag-NHS-ester aminy (bílkoviny) •BV-Tag-fosforamid fosfoskupiny (nukleové kyseliny) •BV-Tag-maleimid thioly •BV-Tag-hydrazid sacharidy •BV-Tag-amin karboxyly ruthenium(II) tris(bipyridin) NHS ester ECL značka BV-TAGTM [USEMAP] ECL reakce Luminiscence emise světla Chemi- předání chemické energie Elektro- elektrochemická iniciace •ruthenium a TPA jsou oxidovány po aplikaci napětí na elektrodu •TPA+ ztrácí proton, redukuje Ru3+ na Ru2+, které z excitovaného stavu přechází do základního za vyzáření fotonu •Ru se nespotřebovává – recykluje – zesilovací mechanismus – zvýšení citlivosti stanovení [USEMAP] Různé formáty stanovení imuno DNA enzym vazebné [USEMAP] Homogenní formát stanovení •Shorter Incubation Times •Reduced Assay Steps KEY: Coat Plate Wash Block Plate Primary Ab Secondary Ab HRP Anti-rat Ab Substrate Development Read 0 2 4 6 8 10 12 14 16 ELISA BioVerisTM Hours [USEMAP] M-SERIES® 384 Analyzer BioVeris Detection System M-SERIES M1R Analyzer M-SERIES M1M Analyzer Moving BioVeris™ Technology Forward [USEMAP] The slide shows the “gold standard” ORIGEN/BioVeris Detection System thru to the M1M. M1M System in Transport Cases [USEMAP] Enzymatic Assays for Toxins [USEMAP] The format of the assay is very simple – bound to a bead is the substrate upon which the specific toxin will act. This substrate contains both a biotin and a BV-TAG label. When placed in the presence of the toxin, the substrate will be cleaved, resulting in no signal. If signal is present after the appropriate incubation period, no functional toxin was present in the sample. These are negative assays so the result is a reduction of signal. A) Protease binds to substrate B)Compound in drug library recognizes substrate and binds, preventing toxin from binding Enzymatic Assays for Screening Drug Targets Protease or toxin A) Substrate is cleaved, no signal B)Compound inhibits protease activity of toxin, signal is generated and viable drug candidate identified! [USEMAP] The cleavage or functional assays are ideal tools for scientists developing drug targets or inhibitors of the activity of the toxins. This slide describes how the assay would work. Imunosensory - co lze měřit •teoreticky každý analyt, pro který ... –jsou k dispozici příslušné protilátky –případně již existuje ELISA stanovení –lze připravit protilátky klasickými postupy –lze připravit rekombinantní protilátky pomocí genetické knihovny • [USEMAP] Imunosensory - příklady stanovení •klinická oblast –markery: albumin, apolipoprotein, hCG, hLH, thyroxin, fetoprotein, hIgE, troponin, FABP, PSA, HBsA, ... –léčiva: amfetamin, digoxin, fenytoin, theophylin, ... –drogy: kokain, heroin, ... •životní prostředí –pesticidy: triaziny (atrazin), fenoxyalkanové k. (2,4-D), organochlorové (acetochlor, DDT) –toxické látky: mikrocystiny, polychlorované bifenyly (PCB) •potravinářství –bakterie: Listeria, Cryptosporidium, Salmonella, E. coli O157H7 –kontaminanty: antibiotika (penicilin), aflatoxiny •vojenství –bakterie, viry, toxiny • • [USEMAP]