Technologické aspekty biosensorů nminiaturizace nnanotechnologie nnanobiotechnologie nnanobiosensory [USEMAP] Co to je nanobiotechnologie Nanotechnologie zkoumá a vyvíjí struktury, které alespoň v jedné z dimenzí mají velikost od desetin po stovky nanometrů (nanočástice, nanodráty, nanovrstvy) Nanobiotechnologie využívá biologické nanosystémy (biomolekuly, proteiny, nukleové kyseliny, vícemolekulární komplexy, viry, buněčné komponenty, ...) v technických systémech. Používá nanotechnologické postupy při zkoumání biologických systémů, s cílem získat informace obtížně dostupné „klasickými“ technikami. [USEMAP] Rozlišení mikroskopických metod [USEMAP] Studium biopovrchů 1 10 100nm 1 10 100 µm 1 10mm 0.1 1 10 100 10 3 10 4 TEM SIMS SPM AES SAM PIXE EPXMA NRA XRFA GD- MS ISS XPS RBS TOF- SIMS laterální rozlišení (x-y) SPM Scanning probe microscopy TEELS Transmission electron energy-loss spectroscopy TEM Transmission electron microscopy TOF-SIMS Time-of-flight secondary ion mass spectrometry XPS X-ray photoemission spectroscopy XRFA X-ray fluorescence spectroscopic analysis AES Auger electron spectroscopy EPXMA Electron probe X-ray microanalysis GDMS Glow discharge masss pectrometry ISS Ion scattering spectroscopy PIXE Proton-induced X-ray emission RBS Rutherford back-scattering spectrometry SAM Scanning Auger microscopy SIMS Secondary ion massspectrometry [USEMAP] kantilever s hrotem Principy SPM a AFM Scanning tunneling microscopy 1982 (G. Binnig, H. Roher) tunelování elektronů mezi hrotem próby a vodivým povrchem I ~ V exp(-AF1/2d) aplikace V ---> I Atomic force microscopy 1986 (G. Binnig, C. Quate, C. Gerber) Lenard-Jonesův potenciál vhodné pro nevodivé povrchy a měření přímo v kapalinách laser D [USEMAP] SPM (scanning probe microscopies) z-piezo y- x- tunelový efekt spring tip sensor meziatomové síly kapacitance metal1 insulator metal2 termočlánek SThM STM SFM SCM vodivost (ionty) SICM SNOM D optic. vlákno [USEMAP] STM scanning tunelling microscopy nzaloženo na tunelování elektronů přes potenciálovou barieru mezi ostrým kovovým hrotem a vodivým hrotem v přítomnosti el. pole [USEMAP] STM mody nzpětnovazebná operace - změna výšky (z) hrotu nad vzorkem tak, aby se udržoval požadovaný stav (konstantní proud nebo konstantní vzdálenost) [USEMAP] Atomární rozlišení natomy na povrchu hrotu a povrchové atomy vzorku spolu interagují [USEMAP] Atomární rozlišení atomy uhlíku [USEMAP] AFM, atomic force microscopy nprincipem je měření síly mezi hrotem a povrchem vzorku, hrot je umístěn na konci pružného nosníku (cantilever) nvznikající síly vedou k prohnutí nosníku (deflection) nna základě znalosti jeho tuhosti pak lze vyhodnotit velikosti působících sil [USEMAP] Interakční síly nmohou být vysvětleny na základě van der Waalsových sil – van der Waalsova potenciálová energie mezi dvěma atomy ve vzdálenosti r je aproximována exponenciální funkcí - Lennard-Jonesův potenciál –první člen v sumě popisuje vzdálené přitažlivé síly dané interakcí dipólů –druhý člen se uplatní na kratší vzdálenosti - repulze daná Pauliho vylučovacím principem –r0 je rovnovážná vzdálenost mezi atomy, hodnota energie je minimální [USEMAP] Optický „zesilovací“ systém kantilever 2-segmentová fotodioda laser LED fokusovací optika A B Schematické znázornění systému pro citlivé sledování vychylování kantilevru Rozdíl signálu A-B výstupních napětí segmentů fotodiody je úměrný velikosti výchylky kantilevru [USEMAP] Zpětná vazba [USEMAP] Vychylování nosníku [USEMAP] Cantilevers product line, SEM image of uncoated ULTRASHARP silicon cantilever AFM kantilever (proba) skenování polystyren. kuliček (průměr 90 nm) SEM image Cantilevers product line, TEM image of uncoated tip of ULTRASHARP cantilever tetramic2 [USEMAP] Druhy kantileverů Dle tvaru Dle materiálových vlastností – vyjádřeno konstantou tuhosti Force Constant [N/m] K. tuh. [N/m] 10-130 1-10 0.1-1.0 0.005-0.1 Materiál kr. křemík pol. křemík sklo Si3N4 Res. f. [kHz] 200-500 100-200 15-100 1-20 Speciální aplikace – další materiálové vlastnosti: vodivé, magnetické, koloidní hroty [USEMAP] fig4-01 AFM: laterální rozlišení nvliv konvoluce na topografii konvoluční efekt hrotu-vzorku nejlepší zakřivení hrotu cca 5 nm, rozlišení je pak 1 až 2 nm [USEMAP] Nastavení, sken, zobrazení integrovaný videomikroskop přesné nastavení na zkoumanou oblast [USEMAP] Instrumentace nMultiMode, Digital Instruments (Veeco) nPicoPlus, Molecular Imaging nskenovací hlava n [USEMAP] celkový pohled AFM systém Ntegra Vita skenovací hlava cely pro práci v kapalinách otevřená uzavřená pro petriho misky průtočná, vč. temperace [USEMAP] … modulární systém [USEMAP] figure7b figure7a AFM: kontaktní mod nvertikální výchylka (deflekce) = topografie n n n n n n n nlaterální výchylka = frikční síly image rastrový sken [USEMAP] Contact modes [USEMAP] AFM: „tapping“ mod nkantilever vibruje blízko své resonanční frekvence a zaznamenává se tlumení oscilační amplitudy nnevadí frikční síly nkrátký kontakt hrotu s povrchem – povrch není tak poškozován (ani hrot) - pro biomolekuly [USEMAP] Semicontact modes [USEMAP] Non-contact modes [USEMAP] Porovnání obou modů nkontaktní - velká rychlost skenování - relativně snadné dosažení „atomárního“ rozlišení - účinkem laterálních sil může docházet k deformaci zobrazovaných objektů - ve vzduchu se mohou projevit výrazně kapilární síly (kolmé na směr interakce hrot-vzorek) - zhoršené rozlišení - poškození měkkých povrchů „poškrábáním“ (u bioobjektů) nnekontaktní (semikontaktní) - vyšší laterální (xy) rozlišení (1 až 5nm) - menší síly a menší poškození měkkých objektů na vzduchu - eliminace laterálních interakcí - nízká rychlost skenování + + - - [USEMAP] n1,4-diaminobenzen a resorcinol Electropolymerizované vrstvy [USEMAP] Au nanočástice nslída (mica) silanizovaná thiol-modifikovaným silanem [USEMAP] Viry a buňky (web NT-MDT) Ebola virus Escherichia coli lymfocyt [USEMAP] AFM DNA 0.2 0.6 1.2 m m 10 20 30 40 m m Z-rozsah 4 nm EcoRI v komplexu s plazmidovou DNA neuron BioScope (zvětšení až 107 x) [USEMAP] AFM bakterie celulosa napadená bakterií bacterie 8x8 µm Pseudomonas putida 5x5 µm max. výška 500 nm bičíky [USEMAP] Sperm cells nJan Přibyl (NCBR) and Igor Crha (Medical Faculty) investigate sperm cells and effects of oxidative stress (hydrogen peroxide as simulator) [USEMAP] AFM nukleových kyselin nDNA z telecího brzlíku na slídě modif. Mg2+ [USEMAP] Biomolekuly ... kolagen typu I-III, vpravo zvětšeno a přebarveno [USEMAP] IgG detaily [USEMAP] Atomární rozlišení jednotlivé vrstvy atomů uhlíku v orientovaném pyrolytickém grafitu [USEMAP] Fluorescence a AFM nRad51 protein (fluorescenčně značený Alexa555) vytváří filamenty podél dsDNA ndetailní AFM 3D sken vybrané oblasti 700 nm topografie [USEMAP] Kolagen [USEMAP] Konfokální mikroskopie a AFM [USEMAP] Oxidační stres núčinek peroxidu vodíku na fibroblasty n nkontrola (A,B,C) / 30 min (D,E,F) a 1 h (G,H,I) působení 0.1 mM H2O2 n nfázový kontrast nepifluorescence - aktinová vlákna značená FITC-faloidinem nAFM 20x20 µm [USEMAP] Mechanické vlastnosti nmultinukleární tubulární buňka, fázový kontrast nmapa distribuce Youngova modulu ukazuje individuální stresová vlákna poblíž povrchu nindentační křivka z oblasti označené křížkem [USEMAP] Difrakční limit optických tecnik §světlo má vlnovou povahu, díky difrakci je bod zobrazován ne jako bod, ale jako soubor koncentrických kruhů s vyšší a nižší intenzitou §minimální vzdálenost R pro rozlišení dvou blízkých bodů je asi polovina vlnové délky světla §reálně to je kolem 150-200 nm pro viditelné světlo R [USEMAP] Efekty blízkého pole předchozí neplatí, pokud se zobrazovaný objekt nachází v blízkosti štěrbiny mnohem menší než je vlnová délka světla - vzniká tzv. blízké pole - SNOM technika (scanning near field optical microscopy, nebo taky NSOM) [USEMAP] Základy SNOM dopadající světlo štěrbina vzorek detekované fotony "sub-wavelength" štěrbina se přiblíží na několik nm k povrchu vzorku generované fotony jsou zachyceny detektorem bod po bodu se skenuje 2D obraz povrchu s rozlišením kolem 1 nm. [USEMAP] Optické vlákno jako štěrbina Laser Coupling unit Optical fiber Core Cladding Metal coating high intensity light is being transported for long distance within an optical fiber due to total internal reflection between the core and the cladding. Tip etching followed by metal coating forms aperture-like structure with a width of tens nm. Aperture Optical fiber tip [USEMAP] Shear-force feed-back control Optical fiber Quartz tuning-fork Glue Piezodriver probe vibrates at resonance frequency of quartz tuning-fork. Amplitude and phase of such vibration significantly change when the probe tip arrives the closest proximity of the object surface. Feed-back control mechanism fixes parameters of new state providing precise height positioning of the tip. Thus sear-force topography image of the surface can be obtained simultaneously with near-field optical one. [USEMAP] shablon opt. vlákno s otvorem (přilepené k ladicí vidlici křemíkové raménko s otvorem Laser 100x, 0.7 NA SNOM mody: kolekce, transmise, reflekce Realizace SNOM [USEMAP] hot_point laser. spotem je skenováno v rovině x,y měří se procházející světlo - otvor v kantilevru se nalezne automaticky s přesností <10 nm, následně se laserový spot (cca 400 nm velký) zaostří přesně na otvor - dosažení co nejvyšší prostupnosti nalezení otvoru C:\Documents and Settings\Igor\Desktop\!! DIPLOMA !!\#new_4.bmp Nasměrování laser. spotu na otvor v kantilevru ___ 10µm _____ 100µm [USEMAP] SNOM [USEMAP] SNOM nvýškový (vlevo, AFM mod) a optický (vpravo, SNOM mod) obraz elektropolymerizovaného filmu [USEMAP] Mitochondrie [USEMAP] SNOM litografie l1 l2 l3 pozitivní fotorezist FP 380 na Si l4 fotoresist NFO próba [USEMAP] Sledování biointerakcí ntapping mod, image 500x500 nm nhistogram pro Z, x osa 0 až 5 nm [USEMAP] Nanobiosensor ncharakterizace povrchů biosensorů nhrot je možné modifikovat imobilizací vhodných biorekogničních molekul, čímž dostáváme biosensor teoreticky schopný detekovat jednotlivé molekuly analytu ntento postup byl použit pro přímé měření síly potřebné k přerušení některých bioafinitních interakcí „roztržením“ existující vazby; některé výsledky jsou shrnuty v tabulce. SPM biosensor raménko hrot biorekogniční prvek analyt [USEMAP] nhrot se pohybuje pouze vertikálně v ose Z bez skenování v X-Y ploše nvýchylka je zaznamenávána jako funkce posunu Z nměří se přibližovací a odda- lovací fáze: A kantilever se nedotýká povrchu, pohybuje se volně a necítí žádnou sílu bez deflekce B přibližuje se k povrchu a dochází ke „kontaktnímu saltu“ při nástupu přitažlivých sil C došlo ke kontaktu s povrchem, zvětšuje se výchylka D po dosažení konečné stabilní síly je proces obrácen. V průběhu oddalování je nutné překonat adhezi a hysterezní síly E v tomto bodě jsou překonány adhezivní síly a kantilever je volně nad povrchem. – Tato vzdálenost je důležitým parametrem křivky. „Force-distance“ křivky E D A B C [USEMAP] Ligand-receptor vazebné děje nv přítomnosti specifické interakce je pro "přetržení" vazby potřeba přídavná síla ntakto změřená síla charakterizuje danou biointerakci n Tip-sample distance approach retraction binding force probe tip spacer e.g. PEG ligand receptor Specific binding Non-specific binding [USEMAP] Modifikované hroty [USEMAP] Biointerakce avidin - biotin F d přiblížení oddálení nligand na hrot vázán přes flexibilní můstek (PEG) nexistuje několik způsobů interakce se vzorkem – pouze ligand (specificky), pouze hrot (nespecificky), kombinace obou noba děje se charakteristicky projeví na Fd křivce ve fázi oddalování (retrakce) nreálné záznamy obsahují různé kombinace obou průběhů [USEMAP] Experimentální Fd křivky nmožné průběhy zahrnují: 43±15 pN bez interakce specifická vazba interakce hrotu interakce hrotu a spec. vazba příliš daleko (PEG ~ 20 nm) oscilující raménko [USEMAP] index Automatizace Fd měření n n n n n JPK Instruments nForceRobot - automatický systém na záznam křivek silové spektroskopie nautomatické nastavení laseru a detektoru nkompenzace driftu raménka s hrotem n80 tis. Fd křivek za den n [USEMAP] Spectroskopické techniky [USEMAP] AFM – biotinylovaný hrot nMAC Mode AFM and TREC images with biotin modified tip of n(a) topography and (b) recognition of avidin on mica. n(c) topography and (d) recognition images of the same sample taken after streptavidin was added to the solution. The avidin molecules are not recognized because the biotin tip is blocked n1µm x 1µm a b c d [USEMAP] Interakční síly změřené AFM Interakce Síla DG DH (pN) (kJ/mol) (kJ/mol) avidin - biotin 160 ± 20 60 90 streptavidin - biotin 260 ± 120 77 134 anti biotin IgG - biotin 240 ± 20 variabilní variabilní (ACTG)5 - (CAGT)5 1500 ± 200 117 430 Intermolekulové adhesní síly změřené pomocí AFM porovnané s volnou energií a reakční entalpií pro typické afinitní interakce [USEMAP] Mikrokantilevry jako biosensory • 40 mm 100 mm 0.5 mm Si mechanický převodník – ohýbá se v důsledku rozdílného povrchového napětí na protilehlých stranách [USEMAP] Experimentální uspořádání pumpa odpad A/D PC .... AFM hlava 1 2 6 ventil A-B signal průtočná cela laser GPIB FFT [USEMAP] DX Diferenciální uspořádání • korekce nespecifické vazby X HSA KONTROLA Ab anti-HSA 7937psacantilevera [USEMAP] 2.5 V 20 min IgG AA01 Ascity AA01 50 Protein A Albumin kantilevry modifikované albuminem a Proteinem A Diferenciální měření [USEMAP] Integrovaný mikrobiosensor 400 nm npiezorezistivní kantilevry – bez optického systému nprůtočná cela s několika integrovanými kantilevry nmultikanálové měření nminiaturizace nmasová produkce n npohled dovnitř cely před zakrytím horním těsnícím dílem zboku a shora [USEMAP] Scanning Probe Lithography Self assembled monolayer of PTCDA (3,4,9,10-perylenetetracarboxylic dianhydride) [USEMAP] AFM dip pen lithography hex1 http://www.chem.nwu.edu/~mkngrp/dippen.html figure3a figure5 [USEMAP] SPM Lithography [USEMAP] AFM atomy nD.M. Eigler, E.K. Schweizer. Positioning single atoms with a scanning tunneling microscope. Nature 344, 524-526 (1990) stm10 atomy xenon na Ni (110) substrátu [USEMAP] SPM - Interdisciplinární aplikace nmolekulární a buněčná biologie, virologie nstudium polymerů nmikro- a nanoelektronika nzákladní výzkum ve fyzice a chemii povrchů nnanotechnologie nnanobiosensory n nnavštivte nás: –A4 laboratoř O.60 (suterén) –http://biosensor.chemi.muni.cz/nanobio n [USEMAP] SECM Scanning electrochemical microscopy Proba = mikroelectroda měřící elektroaktivní látky, pohybuje se přes skenovaný povrch (X -Y) v konstantní vertikální vzdálenosti (Z ~ 15 µm) Způsoby činnosti: indikátory - Ru[(NH3)6]2+ generující substrát (např. oxidasa --> H2O2) blokovaný přenos --> pokles proudu I zpětná difúze --> nárůst I Red Ox [USEMAP]