A picture containing colorful Description automatically generated SEKVENOVÁNÍ DNA A PROTEINŮ Norbert Gašparik 22/10/2021 C9531 Strukturní Biochemie – seminář Transcription Translation Source: Tech Networks Diagram Description automatically generated Synthesis of mRNA Diagram Description automatically generated 5’- U U A G C U U U C A U A C G coding strand non-coding strand Protein biosynthesis Diagram Description automatically generated Source: Nature, ScienceABC A picture containing shape Description automatically generated Codon Table Genetic code: •Universal •Degenerated •Specific •Non-overlapping • A picture containing logo Description automatically generated Source: Nature Polymerase Chain Reaction A picture containing Teams Description automatically generated Source: ThermoFisher Sanger sequencing Diagram Description automatically generated with low confidence Source: Wikipedia A picture containing text Description automatically generated A picture containing text, stationary, needle, handwear Description automatically generated Sequencing primers 5’- T T A G C T T T C A T A C G coding strand non-coding strand T A T G C - 5’ G A A A G C T A A For Rev Open Reading Frames Open Reading Frames ORF1 Leu Ala Phe Ile L A F I stop Leu Ser Tyr - L S Y ORF2 Ser Phe His Thr S F H T ORF3 Open Reading Frames Open Reading Frames Arg Met Lys Ala R M K A ORF4 Val stop Lys Leu V - K L ORF5 Tyr Glu Ser stop Y E S - ORF6 Exercise 1 CODING STRAND 5’- AGATGAAACCGCGATTCTG -3’ NON-CODING STRAND 5’- GCGTTCCACCAGAATGCTCA -3’ 5’- TGAGCATTCTGGTGGAACGC -3’ rev comp - A F W W N E H S G G T S I L V E R R - N R D S D E T A I L M K P R F Exercise 2 5’- CATGATTCTGAAAGCG -3’ Coding strand 3’- AAACGTTTACGCCCAT -5’ Coding strand 5’- TCACTTCTTTGCGCATGT -3’ Rev primer rev comp reverse 5’- TACCCGCATTTGCAAA -3’ 5’- ACATGCGCAAAGAAGTG -3’ ORF2: M I L K A ORF2: T R I C K ORF3(6): M R K E V Exercise 3 Získali jste cDNA vašeho proteinu, a naklonovali jste ji do expresního plasmidu tak, aby krátce za 3’ koncem cDNA následovala plasmidová sekvence ACG GCC GTC GTT TTA C. Pro kontrolu sekvence vašeho genu pomocí Sangerovy metody jste použili primer 5’- GTA AAA CGA CGG CCG T -3’ . Výstup sekvenátoru obsahoval přiložený fragment, odpovídající přibližně stému nukleotidu v sekvenci. Červeně je značen signál fluoroforu navázaného na ddTTP, modře na ddCTP, zeleně na ddATP, černě na ddGTP. 1.zapište úsek sekvence vlákna DNA obsahujícího vaši cDNA, který odpovídá uvedenému fragmentu výstupu sekvenátoru: 2. 2.zapište příslušný úsek sekvence mRNA, která sloužila jako templát pro vaši cDNA 3. 3. zapište úsek sekvence proteinu, který je kódován úsekem vašeho genu 5’- A C T G A G T A A C G A G G T -3’ 5’- A C C T C G T T A C T C A G T -3’ 5’ A C C U C G U U A C U C A G U -3’ T S L L S rev comp Mass Spectrometry § Detection of the ratio between relative mass and charge of ions §Whole protein (intact) (MS) §Proteolytic digest (MS) §Physical fragmentation (MS/MS) § Ionisation §Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) (+ 1H+) §ElectroSpray Ionisation (ESI) (+ nH+) §Detection §Time-Of-Flight (TOF) §Ion Trap (IT) §Fourier Transform Ion Cyclotrone Resonance (FT-ICR) §OrbiTrap Diagram Description automatically generated Source: Bronkhorst MS/MS spectra example Source: Ondrej Šedo Peptide MH+ = 1826.98: AADFFVVPTGSHFYLR Peptide fragmentation Source: Ondrej Šedo, Zbyněk Zdráhal ao, bo, yo = ztráta H2O (S,T,E,D) a*, b*, y* = ztráta NH3 (R,K,N,Q) MS/MS spectra example Source: Ondrej Šedo H F P L A V Y R a1 b1 a2 b2 y1 MS/MS spectra example Source: Ondrej Šedo MS/MS sequencing example MS/MS sequencing exercise 1 WGYRF MS/MS sequencing exercise 2 Chart Description automatically generated TYRGA MS/MS sequencing exercise 3 Chart, histogram Description automatically generated 122.02707 203.08492 235.11114 260.10638 292.1326 363.16971 373.19045 494.2102 MAGIC MS/MS sequencing exercise 4 AGRHT Chart Description automatically generated