Zelený mimozemšťan - krása a význam molekulární biologie rostlin Jan Hejátko Research Group Leader Brno, Nov 22, 2021 2 Osnova  Klíčové objevy, základní pojmy a přístupy  Mezníky genetiky a molekulární biologie  Centrální dogma molekulární biologie  Metody analýzy genové exprese a lokalizace proteinů in vivo  Hormonální signály a růst rostlin  GMO - důvod k obavám nebo optimismu? 3 “…We used to think our fate was in our stars. Now we know, in large measure, our fate is in our genes.” James Dewey Watson, 1989 4 Osnova  Klíčové objevy, základní pojmy a přístupy  Mezníky genetiky a molekulární biologie 5 Ora et Labora Klíčové objevy Zákony dědičnosti  1865, Brno Cyril F. Napp 6 Klíčové objevy Objev DNA Johannes Friedrich Miescher  1869, Tuebingen  Publikováno 1871 7 Oswald Avery Maclyn McCartyColin MacLeod Klíčové objevy DNA jako nositelka dědičnosti  1944, New York „R“ kolonie (nevirulentní) „S“ kolonie (virulentní) 8 Rosalind Franklin James Watson Francis Crick Maurice Wilkins Klíčové objevy Struktura DNA a genetický kód  1953, Cambridge/London Photo 51 9 Osnova  Klíčové objevy, základní pojmy a přístupy  Mezníky genetiky a molekulární biologie  Centrální dogma molekulární biologie 10 Základní pojmy Centralní dogma molekulární biologie Základní pojmy Centrální dogma molekulární biologie Základní pojmy Centrální dogma molekulární biologie 13 Osnova  Klíčové objevy, základní pojmy a přístupy  Mezníky genetiky a molekulární biologie  Centrální dogma molekulární biologie  Metody analýzy genové exprese a lokalizace proteinů in vivo  promotor  počátek transkripce  5´UTR  počátek translace  místa sestřihu  stop kodon  3´UTR  polyadenylační signál TATA ATG….ATTCATCAT ATTATCTGATATA 5´UTR 3´UTR ….ATAAATAAATGCGA Struktura genů 15  Každá buňka obsahuje totožnou sadu všech genů daného organismu, ale jen část z nich je v daném buněčném typu aktivní Základní přístupy Tkáňově specifická genová exprese 16 Základní přístupy Příprava rekombinantní DNA 17 Základní přístupy Příprava transgenních rostlin Gelvin, Nature, 2005 18 □ Transkripční fůze s promotorovou oblastí  Identifikace a klonování promotorové oblasti genu  příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a reportérový gen (uidA, GFP) TATA box počátek transkripce promotor 5’ UTR ATG…ORF reportérového genu Transkripční fůze 19 □ Transkripční fůze s promotorovou oblastí  Identifikace a klonování promotorové oblasti genu  příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a reportérový gen (uidA, GFP)  příprava transgenních organismů nesoucích tuto rekombinantní DNA a jejich histologická analýza Transkripční fůze 20 GUS reporter in mouse embryos 21 □ Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s repotérovým genem  Identifikace a klonování promotorové a kódující oblasti analyzovaného genu  příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a kódující sekvenci studovaného genu ve fůzi s reportérovým genem (uidA, GFP) TATA box promotor 5’ UTR ATG…ORF analyzovaného genu….ATG…ORF reportérového genu….....STOP Translační fůze Základní přístupy Zobrazení rekombinantních proteinů in vivo Roger Y. TsienMartin ChalfieOsamu Shimomura Nobelova cena za chemii, 2008 Green Fluorescent Protein (GFP) Základní přístupy Zobrazení rekombinantních proteinů in vivo Základní přístupy Zobrazení rekombinantních proteinů in vivo Základní přístupy Zobrazení rekombinantních proteinů in vivo 26 Osnova  Klíčové objevy, základní pojmy a přístupy  Mezníky genetiky a molekulární biologie  Centrální dogma molekulární biologie  Metody analýzy genové exprese a lokalizace proteinů in vivo  Hormonální signály a růst rostlin 27  Enormní vývojová plasticita rostlin – totipotence diferencovaných rostlinných buněk Mus musculus, embryo, longitudinal section  Schopnost postembryonální organogeneze de novo (tedy tvorba bočních kořenů, listů, květů, plodů…) Co je zásadním rozdílem mezi živočichy a rostlinami? Arabidopsis thaliana, embryo at the torpedo stage  Tato vývojová plasticita umožňuje rostlinám se přizpůsobit měnícím se podmínkám vnějšího prostředí Vývojová plasticita rostlin 28  Dominantní role cytokininů a auxinu v regulaci vývojového osudu rostlinných buněk AUXIN[ng/ml] CYTOKININ [ng/ml] AUXIN:CYTOKININS – kořeny AUXIN:CYTOKININ –prýt Skoog and Miller, Symp Soc Exp Biol (1957) Hormonální regulace vývoje rostlin 29 Přenos signálu prostřednictvím MSP NUCLEUS PM AHK receptorové histidinkinasy • AHK2 • AHK3 • AHK4 REGULACE TRANSKRIPCE INTERAKCE S EFEKTOROVÝMI PROTEINY HPt proteiny • AHP1-6 Regulátory odpovědi • ARR1-24 Současný model přenosu cytokininového signálu prostřednictvím vícekrokového přenosu fosfátu 30 Signal Transduction via MSP NUCLEUS PM AHK Receptorové histidinkinasy • AHK2 • AHK3 • AHK4 HPt proteiny • AHP1-6 Regulátory odpovědi • ARR1-24 Interakce s jinými signálními drahami Structural determinants of signaling specificity Identifikace cílů a regulátorů MSP Co nás zajímá? 31  CKI1 overexpression mimics cytokinin response Kakimoto, Science, 1996 NO hormones tZ ctrl1 ctrl2Plasmid Rescue Pro35S::CK1 Identifikace CKI1 aktivační mutagenezí 32 Identification of insertional cki1 mutant allele 33 CKI1 Regulates Female Gametophyte Development CKI1/CKI1CKI1/cki1-i Hejátko et al., Mol Genet Genomics (2003) 34 cki1-i reveals non-Mendelian inheritance ♂ ♀ P: CKI1/cki1-i F1: 1 CKI1 : 2 CKI1/cki1-i : 1 cki1-i (anticipated) 1 CKI1 : 1 CKI1/cki1-i (observed) CKI1 cki1-i CKI1 cki1-i CKI1/CKI1 CKI1/cki1-i CKI1/cki1-i cki1-i/cki1-i 35 A. ♂ wt x ♀ CKI1/cki1-i B. ♂ CKI1/cki1-i x ♀ wt C. ♂ wt x ♀ CKI1/cki1-i D. ♂ CKI1/cki1-i x ♀ wt CKI1 specific primers (PCR positive control) cki1-i specific primers CKI1 and Megagametogenesis  cki1-i is not transmitted through the female gametophyte 36 FG 0FG 1FG 2FG 3FG 4 CKI1 and Megagametogenesis 37 cki1-iCKI1 late FG5FG6FG7 24 HAE48 HAE CKI1 and Megagametogenesis Hejátko et al., Mol Genet Genomics (2003) 38 CKI1 is Expressed During Megagametogenesis FG0-FG1 FG3-FG4 FG4-FG5 FG7 39 12 HAP (hours after pollination) 24 HAP48 HAP72 HAP ♀ wt x ♂ ProCKI1:GUS Paternal CKI1 is Expressed in the Arabidopsis Sporophyte Early after Fertilization 24 HAP Hejátko et al., Mol Genet Genomics (2003) 40 CKI1 is Active in Arabidopsis Gametophyte and Sporophyte Hejátko et al., Plant Cell (2009) αCKI1RD 41  Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS)  RNAi objevena u rostlin, později u Coenorhabditis elegans  U rostlin identifikována jako „sense effect“ v systémové negativní regulaci genové aktivity RNA interference 42 Umlčování exprese vnesením další kopie genu pro biosyntézu flavonoidů van der Krol et al., Plant Cell (1990) p35S::DFR 43 Systémový efekt na regulaci exprese GFP  Nicotiana benthamiana exprimující GFP  Retransformace jednoho z listů konstruktem pro expresi GFP  Absence GFP je viditelná jako červená fluorescence chlorofylu Voinnet and Baulcombe, Nature (1997) 44  Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS)  RNAi objevena u rostlin a později u Coenorhabditis elegans  U rostlin identifikována jako „sense effect“ v systémové negativní regulaci genové aktivity  umlčování bylo indukováno jak sense tak antisense RNA  dsRNA indukovala umlčování cca 10-100x účinněji RNA interference 45 Waterhaus et al., PNAS (1998) Posttranskripční umlčování u rostlin je zprostředkováno dsRNA 46 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 Andrew Z. Fire Craig C. Mello USA USA Stanford University School of Medicine Stanford, CA, USA University of Massachusetts Medical School Worcester, MA, USA b. 1959 b. 1960 David Baulcombe UK ? 47 Hejátko et al., Plant Cell (2009) Hormonální Signály Řídí Množství Biomasy 48 WT hormonální mutant □ Rostlinné hormony řídí tvorbu ligninu v rostlinných buněčných stěnách a vodivost cév WT mutant Lignifikované buněčné stěny Water Conductivity WT hormonal mutants Hormonální signály řídí kvalitu biomasy 49 K čemu lze lignin využít?  Průmyslová pojiva  Disperzanty  Vanilin  Příměsi do stavebních hmot  …. 50 Osnova  Klíčové objevy, základní pojmy a přístupy  Mezníky genetiky a molekulární biologie  Centrální dogma molekulární biologie  Metody analýzy genové exprese a lokalizace proteinů in vivo  Hormonální signály a růst rostlin  GMO - důvod k obavám nebo optimismu? 51 Vývoj lidské populace na Zemi 52 40% orné půdy na Zemi je vážně poškozeno nebo zcela neúrodné: • 75% půdy ve střední Americe • 20% půdy v Africe • 11% půdy v Asii 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 1961 1997 2050 hectarespercapita Zdroj: UN Millennium Ecosystem Assessment Množství orné půdy na Zemi je omezené 53 Rezistence k patogenům Bt plodiny 54 Bt plodiny a ekologické dopady jejich pěstování □ Pěstování Bt plodin v Číně zvyšuje množství přirozených nepřátel škůdců a snižuje množství nutných postřiků berušky pavouci zlatoočka Počátek pěstování Bt bavlny Lu et al., 2012, Nature Počet postřiků proti černopásce bavlníkové 55 Zvýšení nutriční hodnoty Zlatá rýže Biosyntetická dráha β-karotenu 56 Náhodná mutageneze vs. editace genomu Hu et al., 2018, Agriculture ? ….in the EU 57 Závěry  Výzkum života s využitím moderních přístupů genetiky a molekulárním biologie je úžasné dobrodružství   Genové manipulace nám dávají možnost porozumět základní mechanismům vývoje (nejen) rostlin  Příprava geneticky modifikovaných organismů je mocný nástroj, který lze zneužít, ale není důvod se ho obávat 58  Brno – místo nejen s bohatou historií…. Vítejte v Brně! Ora et Labora Cyril F. Napp 59  …..ale také budoucností vědy! Vítejte v Brně! Thank you for your attention Central European Institute of Technology Masaryk University Kamenice 753/5 625 00 Brno, Czech Republic www.ceitec.muni.cz | info@ceitec.muni.cz