M U IM I R E C E T O X Přírodovědecká fakulta, Brno, Česká republika Základy studia environmentálních procesů Laboratorní cvičení RNDr. Petra Růžičková, Ph.D. Mgr. Pavla Fialová Mgr. Petra Fišerová Mgr. Simona Rozárka Jílková, Ph.D. Mgr. Barbora Nežiková Mgr. Jiří Palat Mgr. Tomáš Persaň Mgr. Jaromír Sobotka Prof. RNDr. Jana Klánová, Ph.D. © 2020 Masarykova univerzita ISBN 978-80-210-9684-4 Obsah 1 Obecné informace a cíle předmětu.................................................................................................3 1.1 Organizace cvičení...................................................................................................................4 1.2 Vzorový protokol.....................................................................................................................5 2 Bezpečnost práce v laboratoři.........................................................................................................6 3 Úvod.................................................................................................................................................8 4 Rozdělovači koeficient n-oktanol/voda.........................................................................................10 5 Stanovení Henryho konstanty.......................................................................................................14 6 Adsorpce a vytěkávání analytů z půdy..........................................................................................16 6.1 Stanovení adsorpce fenolu na půdu......................................................................................17 6.2 Stanovení rovnovážného koeficientu Ksa pro fenol...............................................................19 7 Fotochemická degradace...............................................................................................................21 8 Stanovení lipidů, polychlorovaných bifenylů a organochlorovaných pesticidů v másle..............22 9 Stanovení persistentních organických polutantů ve vodě pomocí pasivního vzorkování.............27 10 Extrakce mikrocystinů ze vzorků vody metodou SPE....................................................................34 11 Extrakce pesticidů v půdě metodou QuEChERS............................................................................39 12 Stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků (PAHs) ve vzorku ovzduší metodou GC-MS/MS 44 13 Jehličí jako pasivní vzorkovač ovzduší...........................................................................................49 14 Stanovení zpomalovačů hoření ve vzorku prachu.........................................................................54 14.1 Stanovení halogenovaných zpomalovačů hoření ve vzorku prachu.................................59 14.2 Stanovení organofosfátových esterů ve vzorku prachu....................................................61 15 Stanovení metabolitů endokrinních disruptorů ve vzorcích moči.................................................64 2 1 Obecné informace a cíle předmětu Laboratorní cvičení Základy studia environmentálních procesů (E1230) je předmět určený studentům prvního semestru navazujícího magisterského studijního programu Životní prostředí a zdraví na Přírodovědecké fakultě, Masarykovy univerzity, vyučovaný v podzimním semestru. Předmět volně navazuje na přednášky a výpočtový seminář předmětů E6050 a E6051 Osud toxických látek v životním prostředí. Náplní těchto kurzů je seznámení studentů s chemickými a fyzikálními zákonitostmi, které umožňují kvalitativní a kvantitativní popis osudu chemických látek v životním prostředí, zahrnující transport a rovnováhy látek mezi kompartmenty a jejich chemii v matricích a biomu. Cílem předmětu Základy studia environmentálních procesů je poté přenést teoretické poznatky o chování chemických látek v prostředí a procesech na fázových rozhraních do úrovně praktických dovedností. V rámci cvičení jsou zařazeny laboratorní úlohy zaměřené na environmentálni procesy, transport a rovnováhu látek mezi kompartmenty, a látky z hlediska lidského zdraví, v souladu s náplní nového studijního oboru Životní prostředí a zdraví. Na konci kurzu bude student schopen: • rozumět a orientovat se v transportu, distribuci a chemii látek na základě vlastností jednotlivých látek a matric • interpretovat laboratorní výsledky z pohledu jejich osudu v prostředí • předpovídat environmentálni chování chemických látek na základě simulace v laboratorních podmínkách • rozvinout laboratorní dovednosti a principy správné laboratorní praxe Studenti v průběhu cvičení získají cenné praktické dovednosti s aktuálně používanými trendy, technikami a instrumentací moderní environmentálni chemie. Studenti navíc budou postupovat maximálně samostatně tak, aby získali co nejvíce vlastních praktických laboratorních zkušeností a mohli samostatně realizovat všechny etapy laboratorních postupů, a to včetně vlastního vnímání souvislostí. Navíc si upevní znalost anglické terminologie, která je pro mezinárodní charakter environmentálni chemie stěžejní. Doporučená literatura: SCHWARZENBACH, René P., P. M. GSCHWEND a Dieter M. IMBODEN. Environmental organic chemistry. Third edition. Hoboken, New Jersey: Wiley, 2016. xvii, 1005. ISBN 9781118767238. info SCHWARZENBACH, René P., P. M. GSCHWEND a Dieter M. IMBODEN. Environmental organic chemistry. 2nd ed. Hoboken, N.J.: Wiley-lnterscience, 2003. xiii, 1313. ISBN 0471357502. info 3 1.1 Organizace cvičení Filosofií praktika je samostatná práce studentů. Pro cvičení je vytvořen časový harmonogram, který je předán studentům na začátku praktika. Harmonogram se může lišit podle počtu dnů praktika a počtu skupin studentů. Výuka cvičení probíhá blokově, v případě většího počtu studentů pravidelně na týdenní bázi dle rozvrhu, v dobře vybavených studentských laboratořích, umožňující praktické provedení i složitějších laboratorních úloh. Požadavky před započetím praktika a jeho průběh: Na začátku praktika budete proškoleni o bezpečnosti práce v laboratoři a pro práci s chemickými látkami. Pro přípravu na práci v laboratoři a vstupní test z bezpečnosti si před zahájením praktika důkladně prostudujte kapitolu 2. Bez úspěšného složení testu nemůžete praktikum absolvovat. Prostudujte si, prosím, pečlivě všechny návody k úlohám a odpovězte si na přípravné otázky. Na začátku dané úlohy budete psát vstupní test, ze kterého je pro absolvování úlohy nutno získat 80 %. Veškerý materiál a pomůcky budou pro vás v laboratořích nachystány. Během praktika si dělejte poznámky a zapisujte zejména všechny detaily k prováděným postupům a výsledkům. Kdykoliv něco nevíte, zeptejte se vyučujících. Některé části se provádí společně, ale většinu jednotlivých metod budete provádět samostatně nebo ve dvojicích. Každý student vypracuje protokoly pro všechny úlohy samostatně. Protokoly obsahují stručný teoretický úvod včetně citací, popis cíle úlohy, popis případných odchylek postupu od návodů, přehledné výsledky včetně grafické podoby, komentář výsledků a odpovědi na stanovené otázky. Pozornost věnujte hlavně výsledkům a následné diskusi. Předmět je zakončen ziskem zápočtu a 4 ECTS kreditů. Podmínky k získání zápočtu: 1. docházka -100% účast na všech laboratorních cvičeních 2. vstupní test bezpečnost - získání minima 9 bodů (max. 15 bodů) 3. práce v laboratoři - každá z úloh se hodnotí jednotlivě - hodnotí se zájem o danou problematiku, příprava (vstupní test ke každé úloze), správná laboratorní praxe, pečlivost (max. 4 body za každou úlohu) 4. protokoly - každý protokol se hodnotí jednotlivě - za každý protokol minimum 3 body (max. 5 bodů). Každý student vypracuje samostatně protokol ke každé úloze ze cvičení. 4 Podmínkou pro udělení zápočtu je získání minima 36 bodů* za úspěšně řešená laboratorní cvičení (max 60 bodů). Body bude přidělovat cvičící jednotlivých cvičení na základě úspěšného dokončení příslušné úlohy. *u každé jednotlivé položky hodnocení je nutné získat alespoň minimální počet uvedených bodů. Nesplnění jakékoliv jedné z položek hodnocení vede k neudělení zápočtu. 1.2 Vzorový protokol Jméno a příjmení: Studijní program, semestr: Název předmětu: Datum zadání úlohy: Datum odevzdání protokolu: Název úlohy: Úvod: V úvodu uveďte co je předmětem (cílem) experimentální práce. . Stručně a jasně shrňte zdroje konkrétních látek a proč nás zajímá daná matrice. Uveďte možné způsoby vzorkování a následné zpracování vzorku. K faktům uveďte citace. Postup práce: Postup práce je uveden ve studijních materiálech, a proto není nutné jej do protokolu kopírovat. Zdůrazněte princip daného zpracování vzorku a uveďte případné odchylky od postupu. Výsledky a vyhodnocení: V této sekci uveďte výpočty, tabulky, grafy, případně jiné grafické znázornění výsledků. Při zpracování dat nezapomeňte na zaokrouhlování. Diskuse a závěr: Konkrétní požadavky k této stěžejní sekci jsou uvedeny u jednotlivých úloh či se dozvíte od vyučujícího v konkrétním cvičení. Obecně uveďte slovní hodnocení a shrnutí dané úlohy. Diskutujte, o čem zjištěné výsledky vypovídají, například ve srovnání s naměřenými hodnotami z jiných studií. Odpovězte na otázky na konci úlohy. Reference: Vložte použité zdroje citačním programem. 5 2 Bezpečnost práce v laboratoři • Provoz na všech pracovištích, kde se pracuje s látkami nebo přípravky škodlivými zdraví, musí být upraven tak, aby tyto látky nemohly ohrozit pracovníky na těchto pracovištích, ani v okolí pracoviště, aby neohrožovaly podzemní a povrchové vody a aby neunikaly do ovzduší v koncentraci škodící zdraví, tj. nesmí být překročeny nejvyšší přípustné koncentrace pro pracovní prostředí. • Musí být rovněž zajištěny asanační prostředky pro případ havárie. Při rozsypání nebo rozlití škodlivé látky je nutno okamžitě zajistit její zneškodnění. • Hlavní zásadou při práci se škodlivými látkami a přípravky je preventivně se vyvarovat všech možností vzniku intoxikace (vyloučit přímý kontakt pracovníků s těmito látkami), použít všech nezbytných ochranných prostředků (pracovního oděvu ochranných brýlí, vhodného typu rukavic, obličejových štítů, masek atd.) a dodržovat všechny bezpečnostní předpisy. • Při práci s chemikáliemi není dovoleno jíst ani pít nebo kouřit. Před jídlem, pitím a kouřením v pracovních přestávkách a po skončení práce si musí pracovníci důkladně umýt ruce a obličej, podle povahy práce musí po jejím skončení provést důkladnou očistu celého těla. Pokud pracovník pracuje v ochranném oděvu, nesmí jíst ani pít po celou dobu, po kterou je v tomto obleku. • Žíraviny nesmějí být přechovávány ve větší výšce, než je výše ramen pracovníka, který s nimi manipuluje (a zároveň max. ve výšce 165 cm). • Při zřeďování se vždy lije kyselina do vody a nikdy naopak. Kyselina se nalévá pomalu a opatrně, zvláště kyselina sírová. • Při rozpouštění tuhého hydroxidu se musí sypat hydroxid po malých částech do vody za stálého míchání. Nikdy se nenalévá voda na hydroxid. • Rozlitá kyselina dusičná se nesmí odstraňovat pilinami, hadry a jinými organickými látkami. Před odstraněním musí být zneutralizována a není-li to možné, musí být alespoň maximálně zředěna. Nádobí znečištěné organickými látkami se nesmí čistit kyselinou dusičnou (nebezpečí bouřlivých reakcí, vývin oxidů dusíku a samovznícení). • Rozlité kyseliny, zejména koncentrované, je třeba nejprve opatrně zředit vodou, mírně zneutralizovat posypáním uhličitanem (např. soda, křída apod.) nebo politím zředěnými roztoky alkálií, následuje opatrné spláchnutí vodou nebo tekutinu necháme vsáknout do pilin, hader apod. Při asanaci je nutno dbát na to, aby se nezamořila příliš velká plocha. • Jakékoliv manipulace s látkami dýmavými, dráždivými, zapáchajícími a toxickými plyny se smějí provádět jedině v digestoři. • Tuhé chemikálie se nesmí nikdy brát nechráněnou rukou. 6 • Žíravé, toxické a infekční kapaliny se smějí pipetovat jedině za použití bezpečnostních pipet nebo balónku. • Při všech manipulacích s látkami ve zkumavkách a otevřených nádobách musí být ústí nádob odvrácené od pracovníků do volného prostoru. • Zátky lahví se nesmějí pokládat potřísněnou plochou na desku stolu (snížení možnosti intoxikace a kontaminace). • Kyselinu chloristou je nutno uchovávat v lahvích se zabroušeným hrdlem a odděleně od ostatních chemikálií, zejména organických. Lahve s kyselinou chloristou se nesmějí pokládat na dřevěné regály, nýbrž na skleněné, porcelánové, keramické nebo jiné ohnivzdorné a jiné neabsorbující podložky, aby se stopy po rozlití mohly snadno odstranit. • Chemické nádobí, které bylo použito pro práci s toxickými látkami nebo žíravinami, je nutné před dalším použitím dokonale vypláchnout. Obdobně musí být všechny lahve od toxických látek před jejich likvidací zbaveny zbytku obsahu. • Laboratorní úlohy se vykonávají podle připraveného návodu pod dohledem určeného vedoucího. Manipulace s tlakovými lahvemi a redukčními ventily je povolena jen v přítomnosti a pod dozorem vedoucího praktika. • Každý úraz, nehoda a způsobená škoda nebo jiná závada musí být neprodleně oznámeny vedoucímu laboratorního cvičení. • Při práci s chemikáliemi a biologickými materiály je třeba se řídit souvisejícími statěmi Provozního řádu RECETOX, včetně příloh 1 a 2. Potvrzuji svým podpisem, že jsem porozuměl(a) školené tématice a je mi známa odpovědnost za případné nedodržení či vědomé porušování uvedených pravidel. Datum a délka školení 30 min Způsob ověření znalostí Ústní Školící materiál: Tento dokument; Související statě platné verze Provozního řádu RECETOXu včetně příloh č. 1 a 2; Provozních řádů laboratoří Jméno a podpis školitele Č. UČO Příjmení a jméno Studijní obor sem/ročník Podpis 1. 7 3 Úvod Životní prostředí je kontaminováno mnoha chemickými látkami, a to především díky lidské činnosti. Problematika vstupu látek do prostředí, jejich transportu a přeměn je komplikovaná a porozumění těmto jednotlivým fyzikálně-chemickým procesům může pomoci pochopit toxické působení na organismy včetně člověka. Organické chemické polutanty dnes můžeme najít rozšířené prakticky po celé planetě, a to i na místech tisíce kilometrů vzdálených od místa původního použití. Dostávají se do jednotlivých složek prostředí z různých zdrojů, a to jak přírodních, tak i antropogenních. Ve většině případů dnes dominují vstupy z různých antropogenních technologií. Látky mohou být transportovány ve složkách, kam byly primárně emitovány, mohou přecházet přes mezifázové rozhraní do dalších složek prostředí, během tohoto svého transportu mohou být chemicky transformovány a vytvářet sekundární znečištění. Mohou se také díky svým vlastnostem kumulovat jak v abiotických složkách prostředí, tak v živých organismech, včetně člověka. Po vstupu do živých organismů mohou negativně ovlivnit zdraví, a proto je nezbytné porozumět vnějším a vnitřním koncentracím těchto látek s cílem hodnocení expozičních cest. Laboratorní studie environmentálních procesů, které ovlivňují chování organických látek v prostředí, jsou nezbytné pro snazší pochopení těchto dějů a k získání dat sloužících jako podklad pro environmentálni modelování. Specializované laboratorní kurzy, pro studenty magisterských programů vysokých škol, zaměřené na tuto problematiku, jsou přesto velmi ojedinělé. Kurz zahrnuje experimenty stanovení fázových rovnováh, rozdělovačích a distribučních koeficientů, transportu látek mezi kompartmenty, bioakumulace a degradace. Úvodní úlohy jsou zaměřené na pochopení základních principů, které jsou pak aplikovány ve stanovování organických polutantů v běžně vzorkovaných matricích. 1. Stanovení rozdělovacího koeficient n-oktanol/voda Kow 2. Stanovení Henryho konstanty 3. Adsorpce a vytěkávání chemických látek z půdy 4. Fotochemická degradace 5. Stanovení lipidů, polychlorovaných bifenylů a organochlorových pesticidů v másle 6. Stanovení persistentních organických polutantů ve vodě pomocí pasivního vzorkování 7. Extrakce mikrocystinů ze vzorků vody metodou SPE 8. Extrakce pesticidů v půdě metodou QuEChERS 9. Stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků (PAHs) ve vzorku ovzduší metodou GC-MS/MS 8 10. Jehličí jako pasivní vzorkovač ovzduší 11. Stanovení zpomalovačů hoření ve vzorku prachu 12. Stanovení metabolitů endokrinních disruptorů ve vzorcích moči 4 Rozdělovači koeficient n-oktanol/voda Teoretický úvod: V praxi (například při posuzování nebezpečnosti vybrané látky a povolení jejího užívání v průmyslu) se je nezbytné kvantifikovat vlastnosti látky. Důraz je kladen především na vlastnosti, které jsou potenciálně rizikové pro člověka či pro životní prostředí. Žíravost látky můžeme například odhadovat podle pH, těkavost podle teploty varu, radioaktivitu podle poločasu rozpadu a tak dále. Z hlediska enviromentální chemie je jednou z nejdůležitějších charakteristik látky její chování v reálných ekosystémech. Bylo by jistě z určitého pohledu ideální, pokud by naše předpovědi (modely) a měření byly natolik přesné, že bychom s absolutní jistotou mohli říct, že pokud umístíme jeden gram této látky do prostředí, tak takové procento najdeme v půdě, jiné ve vodě a zase jiné množství ve flóře či fauně. Takto přesné údaje však nemáme. Navíc by se snadno mohlo stát, že tato přehnaná přesnost by byla více ku škodě než k užitku. Představme si modelovou situaci, že cisterna vezoucí určitou látku spadne do řeky a potřebujeme rychle vědět, jak nebezpečná je situace pro ryby. Při tak detailním popisu se musíme rozhodovat podle stovek čísel pro každý druh ryb. Odhad toho, jak se látka bude chovat v systému ryba (živočich) - voda, tkví ve vytvoření modelového prostředí, které bude podobné rozhraní ryba-voda, se kterým se zároveň bude dobře pracovat v laboratoři. Z historických, praktických a ekonomických důvodů se role ryby ujal oktanol [1]. Ten dobře modeluje buněčnou membránu a díky tomu v něm naměřené koncentrace odpovídají koncentracím, které by pro danou látku byly naměřeny v biotě. Při experimentu přidáme sledovanou látku do nemísitelné soustavy voda/oktanol a po protřepání a ustanovení rovnováhy zjistíme koncentraci voktanolu a ve vodě. Tím vlastně měříme lipofilitu (hydrofilitu) dané látky. Z těchto koncentrací můžeme dosazením do následujícího vzorce vypočítat rozdělovači koeficient oktanol voda [2]. „ _ (-oktanol "■ow ~ ~~ cvoda Všimněte si, že jednotky koncentrace látky voktanolu a ve vodě se pokrátí a koeficient je tak bezrozměrná veličina. Dále si povšimněte, že čím větší je hodnota Kow, tím musí být větší hodnota c0i vodnou fázi přelijte zpět do dělicí nálevky > oktanolovou fázi odpusťte do předem promyté destilovanou vodou připravené vialky > přidejte 20 ml DCM a třepejte přibližně > přesušte síranem sodným a zfiltrujte 10 min přes vatičku v Pasteurově pipetě > po ustavení rovnováhy oddělte vrstvy > organickou fázi vysušte síranem sodným a přefiltrujte přes Pasteurovu pipetu > pod proudem dusíku vzorek zahustěte na 1 ml > odeberte 100 u.1 vzorku, lOx jej nařeďte D převeďte do mini-vialky Obrázek 1 Správné držení lahve při třepání 12 l.B - Analýza • bude provedena pomocí plynového chromatografu s hmotnostní detekcí l.C - Zpracování výsledků • z experimentálně stanovených koncentrací naftalenu ve vodě a n-oktanolu vypočtěte hodnotu lOg Kow • sestavte strukturovaný protokol (úvod, princip, pracovní postup, výpočet a závěr), připojte odpovědi na následující dotazy Doplňující dotazy Porovnejte vypočtenou hodnotu s tabulkovou hodnotou, pokud se nerovnají, vysvětlete, kde mohl vzniknout rozdíl? Vyjmenujte důvody, proč se místo oktanolu nemůže použít ethanol? Lze podle vás určit Kow všech látek? Proč je lepší určovat Kow ze směrnice než z bodu? Při jaké hodnotě rozdělovacího koeficientu je látka považována za silně lipofilní? Zdroje [1] D. Mackay, A. K. D. Celsie, and J. M. Parnis, "The evolution and future of environmental partition coefficients," Environ. Rev., vol. 24, no. 1, pp. 101-113, 2016. [2] S. Amézqueta, X. Subirats, E. Fuguet, M. Roses, and C. Räfols, "Octanol-Water Partition Constant," in Handbooks in Separation Science, C. F. B. T.-L.-P. E. Poole, Ed. Elsevier, 2020, pp. 183-208. 13 5 Stanovení Henryho konstanty Teoretický úvod Rozdělovači koeficient Pro popis distribuce látek mezi vodou a vzduchem se používá rozdělovači koeficient vzduch/voda Kaw, který je definován jako poměr rovnovážné koncentrace dané látky ve vzduchu k rovnovážné koncentraci ve vodě. Často bývá vyjádřen jako Henryho konstanta - H. Vztah mezi Kaw a Henryho konstantou může být vyjádřen pomocí zákona ideálního plynu touto rovnicí: kde cA je koncentrace analytu ve vzduchu, cw je koncentrace ve vodě, H je Henryho konstanta, R je molární plynová konstanta a T je teplota. Pokud vyjádříme množství sloučeniny ve vzduchu a ve vodě jako cA a cw, můžeme získat tzv. bezrozměrnou Henryho konstantu, která odpovídá KAw- Rozdělovači koeficient vzduch/voda se hojně používá v modelech osudu polutantů v životním prostředí. Jaké znáte jiné rozdělovači koeficienty? Vyjmenujte příklady reálných situací v prostředí, pro jejichž modelování byste použili Henryho konstantu. Při stanovení Henryho konstanty pomocí headspace analýzy předpokládáme, že platí rovnice: c0 = CA^A + CW^W kde c0 je koncentrace zkoumané látky na počátku experimentu v mg/ml, cw je koncentrace ve vodné fázi po ustavení rovnováhy, Ca koncentrace v plynné fázi po ustavení rovnováhy, Vw je objem kapalné fáze a Va objem plynné fáze. Otázky po absolvovaném praktiku: Porovnejte Vámi změřenou Henryho konstantu s literaturou. Úkol: Stanovení Henryho konstanty pro benzen metodou head-space I. Head-space Pomůcky: • 100 ml odměrná baňka 14 • kádinka • 6x nádobka na head-space (25 ml) • Plynotesná stříkačka Chemikálie: • Mili-Q. voda • Benzen • Dichloromethan (DCM) Postup práce: • připravte 100 ml roztoku 10 u.1 benzenu ve vodě • připravený roztok napipetujte do nádobek na head-space analýzu o objemech 1,5 ml, 2,5 ml, 3 ml, 5 ml, 7 ml a 10 ml • nádobky pečlivě uzavřete a nechte ustanovit rovnováhu po dobu 24 hodin II. Analýza plynné fáze pomocí plynové chromatografie Stanovení množství benzenu v plynné fázi bude provedeno pomocí plynového chromatografu. 15 6 Adsorpce a vytěkávání analytů z půdy Teoretický úvod Adsorpce na půdu Znalost chování látek v půdě, sedimentu či kalu je z environmentálního hlediska velmi důležitá. Distribuce látky mezi půdu a vodní fázi je komplexní proces, který je závislý na řadě faktorů: chemické vlastnosti látky, charakteru půdy, klimatických faktorech (např. teplota, déšť, sluneční záření, proudění vzduchu). Proto nemůže být proces jako takový simulován v laboratoři v jeho reálné šíři. Přesto může následující metodika poskytnout alespoň představu o adsorpční charakteristice látky. Stěžejním parametrem osudu látek v těchto matricích je adsorpční koeficient Kd, který je definován jako poměr mezi koncentrací látky v půdě a koncentrací látky ve vodné fázi při adsorpční rovnováze: „ cpůda —- cvoda Jaké znáte jiné rozdělovači koeficienty? Vyjmenujte příklady reálných situací v prostředí pro které byste tento model použili? Známé objemy roztoku testované látky o známé koncentraci v 0,01 M roztoku CaCb jsou přidány k půdnímu vzorku o známé hmotnosti. Směs se třepe stanovený čas. Půdní suspenze je poté oddělena centrifugací. Půdní i vodné vzorky jsou extrahovány a analyzovány. Vytěkávání z půdy Těkání z půdy je velmi složitý proces, který závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech látky (rozpustnost ve vodě, tenze par, Henryho konstanta, rozdělovači koeficient n-oktanol-voda Kow nebo sorpční koeficient pro organickou složku půdy Koc, fotolytická stabilita), environmentálních podmínkách (velikost povrchu půdy, holá půda vs. půda krytá vegetací, půdní struktura a pórovitost, teplota vzduchu a půdy, vlhkost půdy, vlhkost vzduchu, proudění vzduchu, obsah půdní organické hmoty, množství srážek apod.), skupenství aplikované látky (s, I, g) a typu aplikace (aplikace na povrch půdy vs. vpravení do půdy, aplikované množství). Některé látky se mohou vyskytovat jak v neutrální, tak v iontové formě v půdním roztoku. V závislosti na pKa pesticidu může být těkání ovlivněno hodnotou pH půdy. 16 Směr a velikost gradientu difúze jsou řízeny koncentrací (fugacitou) látky ve vzduchu a v půdě a rovnovážným rozdělovacím koeficientem půda/vzduch Ksa. Aby došlo k těkání látky z půdy, musí nejprve koncentrace (fugacita) látky v půdě překročit hodnotu koncentrace (fugacity) látky v okolním vzduchu. Koeficient Ksa je kritickým parametrem tohoto procesu. Těkání může být ovlivněno pH půdy. Jaké máme typy půd v ČR a jaké mají pH? Co z toho můžeme vyvodit? Provedení experimentu s odpařovací komorou spočívá v přesávání vzduchu „zbaveného" sledovaných látek pomocí dvou předčištěných polyuretanových filtrů přes povrch půdy, která je kontaminovaná známou koncentrací látky, a následném zachycení látky odpařené z půdy na polyuretanovém filtru umístěném na výstupu komory. Otázky po absolvovaném praktiku: Diskutujte hlavní rozdíly mezi dříve používanými pesticidy (např. DDT nebo lindan) a nově používanými pesticidy (CUPs). 6.1Stanovení adsorpce fenolu na půdu I. Adsorpce na půdu Pomůcky: • 4 centrifugační zkumavky • Třepačka • Centrifuga • Odměrný válec • 4 minivialky (2 ml) • Filtrační papír Chemikálie: • Půda (jíl do 5,5 %) • Roztok fenolu v methanolu (100 mg/l) • 0,01 M roztok CaCI2 Postup práce: • do 4 centrifugačních zkumavek (V = 50 ml) navažte přibližně 5 g přesáté půdy • ke vzorkům půd přidejte 36 ml 0,01M roztoku CaCb a 4 ml roztoku fenolu v methanolu • vše umístěte na třepačku a v časových intervalech 0, 3, 6 a 24 hodin odeberte vždy jednu zkumavku 17 • centrifugací oddělte půdní a vodnou suspenzi (4000 rpm, 10 min) • ve všech časech odeberte 1 ml vodné fáze do předem připravené minivialky a uložte do lednice do provedení analýzy • v časech 0, 6 a 24 hodin oddělte půdní suspenzi a nechte ji do druhého dne vysušit na filtračním papíře II. Extrakce vzorku půdy Pomůcky: • Ultrazvuková lázeň • 2 kádinky • Odměrný válec • Vialky (2x40 ml a lx 2 ml) • Nylonový filtr Chemikálie: • Methanol Postup práce: • vysušenou půdu zvažte a nasypte do kádinky • ke vzorku půdy nalijte 15 ml methanolu • extrahujte 3x 15 minut v ultrazvukové lázni • vždy po každém 15ti minutovém cyklu extrakce odeberte extrakt do předem připravené kádinky • extrakt přefiltrujte do vialky • objem roztoku ve vialce odpařte pod proudem dusíku na objem 1 ml • kvantitativně převeďte zahuštěný extrakt do předem připravené minivialky • je-li nutné, přefiltrujte vzorek přes nylonový filtr • vialku dobře uzavřete a uložte v ledničce do dalšího zpracování III. Stanovení fenolu pomocí HPLC Koncentrace fenolu ve vzorkách z půdy a z vody budou stanoveny pomocí HPLC. 18 6.2Stanovení rovnovážného koeficientu Ksa pro fenol I. Vzorkování vzduchu Pomůcky: • Odpařovací komora • Nízkoobjemové čerpadlo • Polyuretanové filtry (PUF) - čištěný a nečištěný • Hliníková fólie Chemikálie: • Půda (jíl do 5,5 %) • Roztok fenolu v methanolu (100 mg/l) Postup práce: • Do odpařovací komory umístěte 5 g přesáté půdy • na půdu pomocí Pasteurovy pipety aplikujte ve formě kapek 1 ml roztoku fenolu v methanolu • nechejte ustavit rovnováhu po dobu 24 hodin • na vstupu odpařovací komory umístěte nečištěný PUF • na výstupu odpařovací komory umístěte nízkoobjemové čerpadlo spolu s čištěným PUF • spusťte 24-hodinový odběr • zapište stav timeru před odběrem do protokolu • po 24 hodinách vypněte čerpadlo a zapište stav timeru • vyjměte exponovaný filtr a zabalte ho do dvou vrstev alobalu a uskladněte v mrazícím boxu II. Extrakce vzorku půdy Pomůcky: • Ultrazvuková lázeň • 2 kádinky • Odměrný válec • Vialky (2x40 ml a lx 2 ml) • Nylonový filtr Chemikálie: • Methanol Postup práce: • vysušenou půdu zvažte a nasypte do kádinky • ke vzorku půdy nalijte 15 ml methanolu • extrahujte 3x 15 minut v ultrazvukové lázni 19 • vždy po každém 15ti minutovém cyklu extrakce odeberte extrakt do předem připravené kádinky • extrakt přefiltrujte do vialky • objem roztoku ve vialce odpařte pod proudem dusíku na objem 1 ml • kvantitativně převeďte zahuštěný extrakt do předem připravené minivialky • je-li nutné, přefiltrujte vzorek přes nylonový filtr • vialku dobře uzavřete a uložte v ledničce do dalšího zpracování III. Extrakce exponovaného filtru Pomůcky: • Ultrazvuková lázeň • 2 kádinky • Odměrný válec • Vialky (2x40 ml a lx 2 ml) • Hliníková fólie Chemikálie: • Methanol Postup práce: • Exponovaný PUF vložte do kádinky • Přilijte 100 ml methanolu a přikryjte hliníkovou fólií • extrahujte 45 minut v ultrazvukové lázni • odeberte extrakt do vialky • objem roztoku ve vialce odpařte pod proudem dusíku na objem 1 ml • kvantitativně převeďte zahuštěný extrakt do předem připravené minivialky • vialku dobře uzavřete a uložte v ledničce do dalšího zpracování IV. Stanovení fenolu pomocí HPLC Koncentrace fenolu ve vzorkách z půdy a z PUF budou stanoveny pomocí HPLC. 20 7 Fotochemická degradace Teoretický úvod Fotochemické reakce hrály rozhodující úlohu v evoluci atmosféry i života na Zemi. Život na Zemi je zcela závislý na slunečním záření, a to nejen díky fotosyntéze rostlin. Na jedné straně fotochemické reakce mohou znamenat vznik nových a často nežádoucích sloučenin z přirozeného či atropogenního původu, na druhé naopak likvidaci látek životní prostředí znečišťujících díky foto degradaci - fotolýze. Fotolýza patří k nejdůležitějším přírodním degradačním procesům. Například v atmosféře je přímá fotolýza důležitou reakcí, nejefektivnějším eliminačním procesem v atmosféře pro většinu látek je reakce s fotochemicky generovanými reagenty jako jsou OH radikály, ozón nebo dusičnanové radikály. Jmenujte situace z běžného života, kdy se s fotochemií setkáváte. Proč při užití některých léků nesmí pacient na sluneční záření? Uvažujte, jak by se fotochemie dala využít v lékařství. 21 8 Stanovení lipidů, polychlorovaných bifenylů a organochlorovaných pesticidů v másle Teoretický úvod: Polychlorované bifenyly (PCBs) a organochlorované pesticidy (OCPs) jsou perzistentní, toxické, bioakumulativní a lipofilní látky, které mohou podléhat dálkovému transportu ("The Stockholm Convention" 2019). I přesto, že jsou tyto látky Stockholmskou úmluvou již zakázané, stále je v prostředí nacházíme. Zamyslete se, jak je možné, že i přes zákaz jsou tyto látky stále v prostředí. V minulém století se OCPs začaly aplikovat na pole proti působení škůdců. Rostliny vypěstované na těchto polích se buď využívaly jako krmivo pro dobytek anebo byly dále zpracovány na potraviny. Mohlo se stát, že nedošlo k okamžitému zpracování a bylo nutné uskladnění v silech. V 70. letech minulého století se PCBs používaly jako příměsi do barev, které se aplikovaly v silech anebo na krmné žlaby pro dobytek. Tímto způsobem se PCBs a OCPs dostávaly potravním řetězcem skrze dobytek až do člověka (Langenbach 2013). Zamyslete se nad možnými důvody využívání těchto látek i přes jejich známou toxicitu, která byla potvrzena už v 70. letech minulého století. Myslíte si, že se něco podobného děje i teď? Co byste zvolili jako vhodnou matrici pro vzorkování PCBs a OCPs s ohledem na expozici člověka? Pro monitoring je tedy vhodné využívat například živočišné produkty, které mohou obsahovat vysoké množství tuku. Po konzumaci takového výrobku, např. másla, dojde k přesunu látek do lidského těla, kde dojde k opětovné akumulaci v tukové tkáni. Pokud by PCBs nebo OCPs byly obsaženy ve větším než povoleném množství, může se stát, že při každodenním přísunu dojde k negativním zdravotním projevům (Santillo et al. 2003). Jaké jsou vaše stravovací návyky? Kolik sníte másla týdně? A kolik jiných živočišných výrobků ? Vidíte výhodu bioproduktů nebo živočišných produktů z malých farem? 22 Obrázek 1: Transport POPs biomagnifikacískrz dobytek až do živočišných produktů (Langenbach 2013) Princip: Principem této metody je převést máslo do organické fáze, přičemž organickou fázi rozdělíme na dvě části. Jedna část je využita na zjištění obsahu tuků, druhá část na samotnou analýzu polychlorovaných bifenylů a organochlorovaných pesticidů. Pomůcky: • laboratorní sklo • nerezová špachtle • laboratorní/analytické váhy • hliníkové kalíšky • horizontální třepačka • centrifuga • Pasteurovy pipety • automatické pipety • rotační vakuová odparka • zahřívaný odpařovací systém s dusíkem • pec Chemikálie: • dichlormethan (DCM) • bezvodý síran sodný • standardy na výtěžnost (směs 13C-značených PCBs) 23 • vnitřní standard (13C-PCB 95) • čištěný silikagel (DCM, 8 hodin) • aktivovaný silikagel (muflová pec) • silikagel modifikovaný kyselinou sírovou (44% hm.) • kyselina sírová, 98% • hexan • cyklohexan • isopropanol • mili-Qvoda • nonan Postup práce: 1. navažte ~2 g připraveného másla (mi) do skleněné nádoby 2. přidejte 50 u.1 standardu na výtěžnost přímo na vzorek másla, přidejte stejné množství do mini-vialky jako referenci 3. přidejte 32 ml isopropanolu a 40 ml cyklohexanu ke vzorku (poloviční objem rozpouštědel použijte jako blank), třepejte v ruce 1-2 minuty, dokud se máslo nerozpustí 4. přidejte 44 ml mili-Q vody (22 ml k blanku), připravené vzorky třepejte 10 minut na horizontální třepačce, mezitím si připravte směs cyklohexamisopopanol (87:13, v:v) 5. abyste dosáhli dobrého rozdělení obou vrstev, centrifugujte vzorky a poté převeďte organickou část do 250ml baňky s kulatým dnem 6. přidejte 40 ml směsi cyklohexan/isopropanol (20 ml k blanku) k vodné fázi a 10 minut třepejte na třepačce - pokud je to nutné, použijte centrifugu, poté odeberte organickou část, přidejte ji k již odebranému extraktu a tento krok zopakujte ještě jednou 7. zvažte si hliníkové misky na organickou fázi (část vzorku obsahující máslo -17)2), 22ml vialky na všechny vzorky a blanky (mj) na analytických vahách 8. odpařte extrakty na rotační vakuové odparce na objem ~10 ml, přidejte ~50 ml hexanu a tuto směs dále odpařte na rotační vakuové odparce na objem ~10 ml 9. kvantitativně převeďte vzorek do zvážené 22ml vialky Stanovení obsahu tuků v másle 10. část vzorku obsahující máslo rozdělte na poloviny podle hmotnosti, jednu část převeďte do zvážené hliníkové misky, druhá část zůstává ve vialce 11. odpařte rozpouštědlo v hliníkové misce pod proudem dusíku při teplotě 80 °C do sucha a 24 poté zvažte (m4) 12. vložte hliníkovou misku do pece (105 °C/12 h), aby se vzorek úplně vysušil a opět zvažte N Čistenia analýza PCBs a OCPs 13. příprava kolony: předčištěná vata, 1 g aktivovaného silikagelu, 8 g silikagelu modifikovaného kyselinou sírovou, 1 g aktivovaného silikagelu and 2 g bezvodého síranu sodného 14. odpařte alikvoty ve 22ml vialkách na ~2 ml a kvantitativně převeďte na připravené kolony 15. vzorky eluujte 40 ml směsi hexan:DCM (1:1) 16. odpařte vzorky pod proudem dusíku při teplotě 35 °C na méně než 1 ml a převeďte do kónických mini-vialek 17. přidejte 50 u.1 vnitřního standardu 13C-PCB 95 a 50 u.1 nonanu, takto připravené vzorky odpařte na konečný objem 100 u.1 Vyhodnocení: 1. Vypočtěte procentuální množství tuku v másle a porovnejte s deklarovaným množstvím tuku udávaným na obalu. 2. Přepočtěte výsledky z ng/vzorek na ng/g tuku. 3. Vytvořte přehledové grafy pro PCBs a OCPs. Otázky: Jaké jsou zdroje PCBs a OCPs v půdách a rostlinách ? (uveďte reference) Existují nějaké limity pro obsah PCBs v másle? Pokud ano, porovnejte naměřené koncentrace s limity, (uveďte reference) Existují jiné metody pro extrakci lipidů? Uveďte příklady, (uveďte reference) Reference: Langenbach, Tomaz. 2013. "Persistence and Bioaccumulation of Persistent Organic Pollutants (POPs)." In Applied Bioremediation - Active and Passive Approaches. InTech. https://doi.org/10.5772/56418. 25 Santillo, D, A Fernandes, R Stringer, R Alcock, M Rose, S White, K Jones, and P Johnston. 2003. "Butter as an Indicator of Regional Persistent Organic Pollutant Contamination: Further Development of the Approach Using Polychlorinated Dioxins and Furans (PCDD/Fs), and Dioxin-like Polychlorinated Biphenyls (PCBs)." Food Additives and Contaminants 20 (3): 281-90. https://doi.org/10.1080/0265203021000057494. "The Stockholm Convention." 2019. 2019. http://chm.pops.int/Home/tabid/2121/Default.aspx. 26 9 Stanovení persistentních organických polutantů ve vodě pomocí pasivního vzorkování Teoretický úvod: Persistentní organické polutanty (POPs) jsou hydrofobní látky, ve vodě téměř nerozpustné, bioakumulativní s dlouhým poločasem rozpadu ("The Stockholm Convention" 2019). I přesto, že jsou ve vodě velmi složitě stanovitelné s dostatečnou přesností, je důležité znát v jakých koncentracích se ve vodě nachází právě díky řadě problémům, které mohou způsobovat, a které nemusí být na první pohled znatelné. Jedná se převážně o biomagnifikaci skrze potravní řetězce, přes ryby až do člověka, který je na vrcholu potravního řetězce (Deribe et al. 2011). V lidském těle mohou způsobovat řadu problémů jako alergie, hormonální nerovnováhu, či rakovinu (El-Shahawi et al. 2010). Popište jak se POPs dostávají skrze vodní prostředí až do oceánů. Otázkou je, jak se tyto látky do vodního prostředí dostávají. Pokud se POPs z primárního zdroje dostanou do řek, tak jsou potom tyto látky unášeny až do oceánů anebo může dojít k odpaření do atmosféry. Existuje několik procesů, které jsou spojené s transportem a distribucí POPs ve vodě. Ve spojení s atmosférou se POPs mohou dostávat do vody pomocí suché a mokré atmosférické depozici a naopak může docházet k vypařování POPs zpět do atmosféry (Holoubek and Klánová 2007). Dále ve spojení se sedimenty může docházet k usazování POPs, které se navážou na pevné částice, anebo jsou na částicích unášeny oceánskými proudy. Právě sedimentace v oceánech v chladnějších oblastech je předpokládanou „studní" pro POPs v globální měřítku (Dachs et al. 2002). Jaké jsou rozdíly a principy aktivního a pasivního vzorkování? Jaké jsou hlavní výhody a nevýhody pasivního a aktivního vzorkování? Jak tedy můžeme tyto látky změřit? Rutinní vzorkování vody pomocí bodového odběru poskytuje informaci o kvalitě vody jako celku (částice, volně rozpuštěné látky, koloidy) a pro daný okamžik. Při bodovém odběru jsou koncentrace POPs často pod limitem kvantifikace. Oproti tomu pasivní vzorkování má výhodu poskytnout časově integrovaný vzorek díky dlouhé expozici v prostředí (neustálá absorpce po dobu expozice). Pasivní vzorkování může být použito pro ověřovací hodnocení (ne)přítomnosti POPs, které jsou volně rozpuštěné ve vodě v nesmírně nízkých koncentracích (fg/l) (Greenwood, Mills, and Vrana 2007). Je také možné použít pouze jeden typ pasivního vzorkovače na různé typy vod - mořská voda, čerstvá voda, brakická voda. Expozice je také možná v oblastech se složitým přístupem bez zdroje elektrické energie - Arktické oblasti, vysokohorská jezera, oceánské 27 bóje. Proto je pasivní vzorkování vhodné pro monitoring POPs ve vodním prostředí (Lohmann et al. 2017). Myslíte si, že různé podmínky na vzorokovacích lokalitách ovlivňují vzorkování? Berte v potaz salinitu a teplotu vody s množstvím slunečního záření. Obrázek 1: Vlevo - standardní rozměr štítku pasivního vzorkovače používaného pro expozici ve vodním prostředí. Uprostřed - Vzorkovací klec využívaná pro expozice pasivních vzorkovačů v oceánech, na monitorovacích bájích. Vpravo - Mřížka na grilování adaptovaná jako základní kostra pro expozici pasivních vzorkovačů ve sladkovodních tělesech (řeky, jezera) Princip: Exponované silikonové gumy jsou extrahovány organickým rozpouštědlem v Soxhletově extraktoru. Poté jsou vzorky převedeny do vhodného rozpouštědla pro přečištění na koloně s modifikovaným silikagelem (H2SO4), kde je odstraněna většina matrice. Vzorky jsou dále změřeny na GC-MS/MS. Pomůcky: • 70ml Soxhlety • 250ml baňky se špičkou • chladící systém • Kuderna-Danish destilátor • laboratorní lžička • laboratorní váhy • Pasteurovy pipety • pinzety • předčištěná bavlna/skelná vata (8h, dichlormethan) 28 • silikonová guma 5,5x9,5x0,05 cm (homogenně nadávkovaná s performačními referenčními látkami; performance reference compounds (PRCs)) • varné kamínky • vodní lázeň Chemikálie: • aceton • dichlormethan (DCM) • destilovaná voda • hexan • kyselina sírová, 98% • methanol • nonan • PRCs: Dio-Biphenyl, PCB-1, PCB-2, PCB-3, PCB-10, PCB-14, PCB-21, PCB-50, PCB-55, PCB-78, PCB-104, PCB-145, PCB-204 • předčištěný (aktivovaný) silikagel (čištění: 12h, dichlormethan, Soxhlet; aktivace: 12h, 150 °C, pec) • standardy na výtěžnost (13C-značený mix PCBs a OCPs, 13C-značené PBDEs) • vnitřní standardy (13C-značený PCB 95,13C-značený BDE 77, 138) PCBs = polychlorované bifenyly; OCPs = organochlorované pesticidy; PBDEs = polybromované difenyl ethery Postup: 1) vytáhněte exponované silikonové gumy z mrazničky a nechte je zahřát na laboratorní teplotu 2) rozložte silikonové gumy na připravený kus hliníkové fólie s papírovými utěrkami 3) osušte silikonové gumy od zbytkové vody, pokud jsou pokryty rzí nebo biofilmem, namokřete papírovou utěrku destilovanou vodou a otřete 4) připravte 250ml baňku se špičkou a varnými kamínky, naplněnou ~150 ml methanolu 5) vložte 6 silikonových gum poskládaných do harmoniky do 70ml Soxhletů 6) na rozpouštědlový slepý vzorek použijte prázdný 70mL Soxhlet 7) na procesní slepý vzorek použijte 6 neexponovaných silikonových gum (s nadávkovanými PRCs) 29 8) přidejte standardy pro výtěžnost na gumy v Soxhletu (přidejte stejné množství do referenční vialky): Standardy pro výtěžnost Koncentrace (ng/ml) Přídavek (u.1) Množství ng/vzorek 13C-značené PBDEs 20 50 1 13C-značené PCBs a OCPs 200 50 10 Obrázek 2: Vlevo - Sestavená aparatura pro extrakci silikonových gum - 250mL baňka se špičkou, Soxhlet se silikonovými gumami poskládanými do harmoniky, chladič. Vpravo - Neočistené silikonové gumy po expozici. 9) extrahujte vzorky po dobu 1 hodiny na vodní lázni při 85 °C 10) po extrakci rozložte silikonové gumy na papírovou utěrku, aby vyschly 11) připojte Kuderna-Danish destilátor na baňku s extraktem 12) zredukujte extrakt na vodní lázni (85 °C) na minimální objem (1 ml) 13) přidejte 30 ml hexanu pro převod extraktu do hexanu a zredukujte objem na ~2 ml 14) čištění na koloně: a. kolonka 0lcm naplněná odspodu: kousek bavlny/skelné vaty, 1 g aktivovaného silikagelu, 8 g H2SO4 (44% hm.) modifikovaného silikagelu, 1 g neaktivovaného silikagelu, 2 g Na2S04 b. kvantitativně (3x vypláchněte) přeneste extrakt pomocí Pasteurovy pipety c. proveďte eluci se 40 ml roztoku DCM:hexan (1:1; V/V) 15) zredukujte objem vzorku na vodní lázni (Kuderna-Danish destilátor; 55 °C, poté co se odpaří DCM zvyšte teplotu na 80 °C) a přeneste kvantitativně do minivialky (pokud nutné, tak více zredukujte pod jemným proudem dusíku) 16) přidejte 50 u.1 nonanu 17) přidejte vnitřní standardy: 30 Standard Koncentrace (ng/ml) Přídavek (u.1) Množství ng/vzorek 13C-značené BDE 77, 138 100 10 1 13C-značené PCB 95 200 50 10 18) zredukujte objem vzorku na 100 u.1 pod jemným proudem dusíku 19) změřte vzorky pro obsah PCBs, OCPs, PBDEs na GC-MS/MS 20) zvažte vysušené silikonové gumy na laboratorních vahách Úkoly do protokolu: Výpočet PRCs 1) vypočtěte výtěžnost PRCs pro výpočet pomocí modelu a normalizujte data na PCB 104, PCB 145 a PCB 204 (vždy použijte data z předcházejícího kroku) a. nejprve přepočtěte hodnoty PRC z ng/vzorek na ng/g gumy (použijte hmotnosti uvedené v excelovém souboru, list info pro všechny vzorky a slepé vzorky, pro něž je uvedena hodnota hmotnosti) b. vypočtěte relativní výtěžnost exponovaného vzorku na průměr všech slepých vzorků a procesních slepých vzorků (bez rozpouštédlového slepého vzorku) c. normalizujte na průměr PCB 104, PCB 145 a PCB 204 vždy pro daný vzorek Výpočet PCBs, OCPs a PBDEs 2) proveďte korekci surových dat na slepé vzorky a. odečtěte hodnotu slepého vzorku dané lokality s korespondujícím exponovaným vzorkem (pokud je hodnota rozpouštédlového slepého vzorku vyšší než hodnota slepého vzorku dané lokality, tak odečtěte hodnotu rozpouštédlového slepého vzorku), pokud jsou hodnoty pod limitem (se znakem <), nic se neodečítá 3) dostanete specifické hodnoty pro vzorek (parametry FA) vypočtené pomocí modelu a látkově specifické hodnoty rozdělovacího koeficientu mezi polymerem a vodou; vypočtěte koncentrace ve vodě pomocí rovnic níže - nejprve vypočtěte vzorkovací rychlost (Rs; rov. 1), poté stupeň rovnováhy (DEQj rov. 2) a nakonec koncentrace ve vodě (cw; rov. 3) Co musí protokol obsahovat: 1) úvod - jeden odstavec obecně o pasivním vzorkování (2x reference) 2) krátký popis metody - maximálně 4 řádky textu 3) výsledky: a. QA/QC i. úpravy dat (zda byly odečteny slepé vzorky, sloučeniny pod limitem) 31 ii. napište, zda byly některé slepé vzorky nad limitem kvantifikace, případně kolikrát vyšší hodnoty byly b. tabulky s vypočtenými hodnotami (vypočtené Rs, DEQ a cw) c. vytvořte přehledové grafy d. srovnejte látky s nejvyšší vypočtenou koncentrací pro každou skupinu látek PCBs, OCPs a PBDEs s jinými lokalitami (př. polární oblasti) e. srovnejte sumu koncentrace PBDEs s limity vodní rámcové směrnice (napište, které kongenery jsou v sumě zastoupeny) 4) závěr Pošlete také excelový soubor s výpočty! Otázky: Myslíte, že je pasivní vzorkování vhodné pro monitorování POPs ve vodě? (reference) Proč je nutné využívat PRCs?Jaké typy látek se mohou využívat jako PRCs? (reference) Jaký typ materiálu může být použit jako pasivní vzorkovač (příklad)? Můžete vzorkovat také polární látky ve vodě pomocí pasivního vzorkování? Pokud ano, uveďte i jaký typ vzorkovače lze použít, (reference) Najděte a porovnejte rozdělovači koeficienty mezi n-oktanolem a vodou (Kow) s danými rozdělovacími koeficienty mezi polymerem a vodou (Kpw) pro skupinu PRCs (nižší, vyšší, trend?) - vytvořte graf. Rs = FA x M~0A7 Kde Rs (l/d) je vzorkovací rychlost specifická pro látku a vzorek, FA (l/d) je hodnota specifická pro vzorek získaná z výpočtu z modelu, M je molární hmotnost látky. Kde DEO je stupeň rovnováhy, t je vzorkovací čas (d), mpje hmotnost vzorkovače použitého při extrakci (kg) a Kpw je specifická hodnota rozdělovacího koeficientu mezi polymerem a vodou pro látku (l/kg) Rovnice 1: Rovnice 2: Rovnice 3: N t c, w mpKpwDEQ 32 Kde cwje koncentrace ve vodě (pg/l), Ntje naměřené množství ve vyextrahovaném vzorku (pg/vzorek) Reference: Dachs, Jordi, Rainer Lohmann, Wendy A. Ockenden, Laurence Méjanelle, Steven J. Eisenreich, and Kevin C. Jones. 2002. "Oceanic Biogeochemical Controls on Global Dynamics of Persistent Organic Pollutants." Environmental Science and Technology 36 (20): 4229-37. https://doi.org/10.1021/es025724k. Deribe, Ermias, Bj0rn Olav Rosseland, Reidar Borgstr0m, Brit Salbu, Zinabu Gebremariam, Elias Dadebo, Hans Ragnar Norli, and Ole Martin Eklo. 2011. "Bioaccumulation of Persistent Organic Pollutants (POPs) in Fish Species from Lake Koka, Ethiopia: The Influence of Lipid Content and Trophic Position." Science of the Total Environment 410-411 (December): 136-45. https://doi.Org/10.1016/j.scitotenv.2011.09.008. El-Shahawi, M S, A Hamza, A S Bashammakh, and W T Al-Saggaf. 2010. "An Overview on the Accumulation, Distribution, Transformations, Toxicity and Analytical Methods for the Monitoring of Persistent Organic Pollutants." Talanta 80 (5): 1587-97. https://doi.Org/10.1016/j.talanta.2009.09.055. Greenwood, R., G. Mills, and B. Vrana. 2007. "Comprehensive Analytical Chemistry - Passive Sampling Techniques in Environmental Monitoring." In Comprehensive Analytical Chemistry, 453. https://doi.org/10.1016/S0166-526X(06)48007-7. Holoubek, Ivan, and Jana Klánová. 2007. "Spatial and Temporal Trends of Global, Regional, and Local Pops Distribution." In The Fate of Persistent Organic Pollutants in the Environment, 219-28. Dordrecht: Springer Netherlands, https://doi.org/10.1007/978-l-4020-6642-9_17. Lohmann, Rainer, Derek Muir, Eddy Y. Zeng, Lian Jun Bao, Ian J. Allan, Kenneth Arinaitwe, Kees Booij, et al. 2017. "Aquatic Global Passive Sampling (AQUA-GAPS) Revisited: First Steps toward a Network of Networks for Monitoring Organic Contaminants in the Aquatic Environment." Environmental Science and Technology 51 (3): 1060-67. https://doi.org/10.1021/acs.est.6b05159. "The Stockholm Convention." 2019. 2019. http://chm.pops.int/Home/tabid/2121/Default.aspx. 33 10 Extrakce mikrocystinů ze vzorků vody metodou SPE Teoretický úvod: Sinice (cyanobakterie) jsou organismy přirozeně se vyskytující ve vodním prostředí, které jsou součástí fytoplanktonu. Pokud je ve vodě dostatek živin (důležitý je zejména obsah dusíku a fosforu) a příznivé podmínky pro růst biomasy, dochází k jejich přemnožení a vzniká tzv. vodní květ (Babica, Maršálek, and Bláha 2005). K rozvoji vodního květu dochází při teplém a slunném počasí, tedy převážně v létě a začátkem podzimu. Při odumírání a rozkladu sinic pak dochází k uvolňování cyanotoxinů do vodního prostředí. Z jakých zdrojů se do vodního prostředí může dostávat nadměrné množství živin? Jak nazýváme jev spojený s nadměrným přísunem živin do vodního prostředí? Za jakých podmínek bude docházet k odumírání a rozkladu sinic? Mikrocystiny jsou široce rozšířenou podskupinou cyanotoxinů, které jsou produkovány sinicemi rodu Microcystis, Planktothrix, Anabaena či Oscillatoria (Babica, Maršálek, and Bláha 2005). Mikrocystiny jsou cyklické heptapeptidy a obsahují tedy 7 aminokyselin. Jsou pojmenovány podle aminokyselin, navázaných ve své struktuře. Jeden z nejčastěji se vyskytujících a nejvíce studovaných mikrocystinů je mikrocystin-LR, který ve své struktuře má aminokyseliny leucin (L) a arginin (R). C02H i O Obr. 1: Strukturní vzorec mikrocystinu-LR. Mikrocystiny jsou netěkavé a hydrofilní látky, které jsou stabilní na slunci, a také stabilní v širokém rozmezí teplot a pH (USEPA, 2006a). Ve vodním prostředí tak mohou toxiny přetrvávat v řádech týdnů až měsíců (USEPA, 2006b). Mikrocystiny jsou obecně hepatotoxiny. Kromě toho mohou způsobit podráždění kůže, očí a jícnu (World Health Organization, 2003). Mikrocystiny tedy mohou představovat 34 zdravotní riziko převážně tehdy, když vodní nádrže s nadměrným výskytem sinic slouží k rekreaci a nebojsou využívány jako zdroj pitné vody. Jak můžeme být nejčastěji vystaveni působenísinicových toxinů? Jaké budou hlavní expoziční cesty? Extrakce mikrocystinů ze vzorků vody metodou SPE Princip: Mikrocystiny jsou ze vzorku vody zakoncentrovány pomocí extrakce na tuhou fázi (solid phase extraction - SPE). Mikrocystiny jsou navázány na pevný sorbent a poté jsou eluovány malým množstvím rozpouštědla. Takto zpracovaný extrakt je připraven k analýze mikrocystinů pomocí HPLC-MS (vysoko účinná kapalinová chromatografie s hmotnostní detekcí). Chemikálie a spotřební materiál: • methanol • 1% kyselina chlorovodíková • roztok thiosíranu sodného (c = 10 g/l) • GF (glass fiber) filtry (0,45u.m) • SPE kolonky se sorbentem C18 • čisté l,5ml skleněné vialky, víčka, septa • střička s destilovanou vodou Přístroje: • filtrační aparatura Nalgene DS0320 • aparatura pro SPE • elektrická olejová (membránová) vývěva • odpařovací systém s dusíkem • pH metr Postup: Příprava vzorků • vzorek o objemu 100 ml přefiltrujte přes GF filtr (0,45um) Pozn. V případě použití kohoutkové vody není potřeba vzorek filtrovat. • přidejte methanol v množství do 10 % celkového objemu (v/v) vzorku • vzorek okyselte přidáním HCI na pH~6, pH zkontrolovat pomocí pH metru • přidejte 1 ml roztoku thiosíranu sodného 35 Aktivace a ekvilibrace SPE kolony • pokyny ke konkrétním typům kolon jsou uvedeny na příbalových letácích od výrobce • v případě použití kolon Supelclean LC-18 3ml Tubes postupujte takto: o aktivace 5 ml 100% methanolu (bez použití podtlaku) o ekvilibrace 5 ml vody (možno použít podtlak) • v průběhu aktivace, ekvilibrace a přetahování vzorku kolona nesmí vyschnout! Přetažení vzorku • vzorek přetáhněte přes kolonku za použití podtlaku, průtok 5 ml/min • po přetažení vzorku sušte kolonu proudem vzduchu (1 min) • vysušenou kolonu promyjte 5 ml 20% methanolu Eluce analvtů • eluci proveďte 5 ml 100% methanolu za použití podtlaku • eluát v případě potřeby skladujte v mrazáku (při teplotě -18°C) Zakoncentrování eluátu • eluát odpařte do sucha pod proudem dusíku • odparek rozpusťte v 500 u.1 50% methanolu a převeďte do mini-vialky • vzorky v minivialkách před analýzou skladujte v mrazáku (t = -18 °C) Vyhodnocení: Přepočítejte naměřenou koncentraci ve vzorku na původní objem vzorku, koncentraci uveďte v u.g/1. Zjistěte, zda existuje limit pro mikrocystiny v pitné vodě. Pokud ano, porovnejte s naměřenými výsledky. Otázky: Z jakého důvodu jsou vodním květem postiženy vodní nádrže a ne tekoucí řeky? Jak lze předcházet přemnožení sinic ve vodních nádržích? Jakým způsobem lze odstranit cyanotoxiny z vody při její úpravě na vodu pitnou? 36 Stanovení mikrocystinů v lyofilizované biomase sinic Princip: Navážka lyofilizované biomasy sinic je extrahována ultrazvukem. Buněčný debris je oddělen centrifugací, supernatant je zfiltrován a připraven pro analýzu mikrocystinů. Chemikálie a spotřební materiál: • 50% methanol • l,5ml Epperdorf zkumavky • plastové stříkačky 2ml • stříkačkové nylonové filtry (0,45 um) • minivialky, víčka, septa Přístroje: • analytické váhy • automatická pipeta • vortex • ultrazvukový homogenizátor nebo lázeň • centrifuga Postup: • do Eppendorf zkumavky navažte cca 5 mg lyofilizované biomasy (zaznamenejte si přesnou navážku) • přidejte 1 ml 50% methanolu a důkladně vortexujte • extrahujte pomocí ultrazvukového homogenizátoru (2 x 20 s, cycle 0,8 x 10%, power 90%), mezi oběma extrakcemi nechejte vzorek vychladnout • centrifugací odděltet buněčný debris (maximální otáčky, 10 min) • supernatant přefiltrujte pomocí stříkačky a filtru do minivialky • takto získaný vzorek lOx zřeďte 50% methanolem na objem 1 ml • vzorky před analýzou skladujte při teplotě -18 °C Vyhodnocení: Naměřené hodnoty obsahu mikrocystinů ve vzorku biomasy přepočítejte na původní navážku. 37 Otázky: Proč je lepší použít pro extrakci ultrazvukový homogenizátor než ultrazvukovou lázeň? Jaké další cyanotoxiny sinice produkují? Reference: Babica, Pavel, Blahoslav Maršálek, and Luděk Bláha. 2005. "Microcystiny-Cyklické Heptapeptidy Sinic." http://www.sinice.cz/res/file/popular/microcystiny.pdf. USEPA, 2006a; Toxicological reviews of Cyanobacterial Toxins: Microcystins LR, RR, YR and LA; Toxicological reviews of Cyanobacterial Toxins: Microcystins LR, RR, YR and LA; NCEA-C-1765. National Center for Environmental Assessment, USEPA, Cincinnati, OH. USEPA; 2006b; Regulatory Determinations Support Document for Selected Contaminants from the Second Drinking Water Contaminant Candidate List (CCL2); Regulatory Determinations Support Document for Selected Contaminants from the Second Drinking Water Contaminant Candidate List (CCL2); EPA Report 815-D-06-007. Chapter 15 pp. 14-15. Office of Ground Water and Drinking Water, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC. World Health Organization; 2003; Cyanobacterial Toxins: Microcystin-LR in Drinking Water; Cyanobacterial Toxins: Microcystin-LR in Drinking Water; WHO/SDE/WSH/03.04/57. World Health Organization, Geneva, Switzerland. 38 11 Extrakce pesticidů v půdě metodou QuEChERS Teoretický úvod: Pesticidy jsou nezbytné pro zajištění dostatku potravy pro lidskou populaci. Jejich použití lze sledovat už od starověku. Pesticidy jsou širokou skupinou látek, lišící se chemickou strukturou a tím i svými vlastnostmi. Velká část jich byla postupně zakázána, protože se odhalily jejich problematické vlastnosti jako je perzistence, toxicita pro necílové organismy či dálkový transport.1,2 Které látky se používaly jako pesticidy dříve? Jsou pesticidy detekovány i v potravinách ? Pokud ano, jak je lze z potravin před konzumací eliminovat? Pesticidy se dostávají aplikací či špatným skladováním do životního prostředí, kde mohou negativně ovlivňovat ekosystémy i organismy. Ačkoli jsou pesticidy primárně aplikovány na rostliny, dostávají se postupně do ovzduší, podzemní vody i půdy. Půda pak může být rezervoárem těchto látek a sekundárně je uvolňovat do prostředí.2 Jak různé aplikace pesticidů ovlivňují jejich osud v životním prostředí? V současné době je jednou z nejrozšířenějších metod pro přípravu vzorků půdy metoda označovaná zkratkou QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe). Je založená na extrakci a vysolení pesticidů z homogenního vzorku s dostatečnou vlhkostí do organického rozpouštědla. QuEChERS má vysokou propustnost vzorků, má méně kroků přípravy, je potřeba méně materiálu, je velmi efektivní a rychlá, vhodná pro široké spektrum sloučenin a nevyžaduje použití žádného chlorovaného rozpouštědla. Metoda QuEChERS má dvě základní etapy, extrakční a čistící. V případě běžných vzorků půdy bez rostlinného materiálu lze čistící krok eliminovat. Použitím vhodných sorbentů se sníží účinek matrice na finální instrumentální analýzu a zvýší se robustnost metody.3 Proč jsou chlorovaná rozpouštědla považována za problematická? Jak může matrice ovlivnit finální instrumentální analýzu? 39 Tabulka 1 - Typy sorbentů a jimi vázané látky Sorbent Zachycené látky Síran horečnatý (bezvodý) Voda PSA (směs primárních a sekundárních aminů) Mastné kyseliny, polární pigmenty a cukry Oxid křemičitý (Silica-CIS) Hydrofobní látky Grafitizovaný neporézní uhlík (EnviCarb) Necílové sloučeniny Postup práce Pomůcky: • polypropylenové (PP) zkumavky • laboratorní váhy • ultrazvuková lázeň • centrifuga • laboratorní sklo • automatické pipety Chemikálie: • bezvodý síran horečnatý • acetonitril • chlorid sodný • směs hydrátů citronanů sodných • PSA (směs primárních a sekundárních aminů) • silica-C18 (silikagel modifikovaný uhlovodíkovými řetězci C18) • směs standardů pesticidů • 5% roztok kyseliny mravenčí v acetonitrilu • mili-Qvoda Zpracování vzorků: • navažte si přibližně 5 g půdy do 50ml PP zkumavky • ke vzorku přidejte směs standardů pesticidů (dle pokynů vyučujícího) • půdu obohacenou pesticidy důkladně promíchejte na třepačce cca 1 hodinu a uchovejte 1 týden v chladničce, aby došlo k ustavení sorpční rovnováhy. (Vpřípadě blokových cvičení připraví předem vedoucí cvičení.) • ke vzorku půdy obohacené pesticidy přidejte 5 ml mili-Q vody a 10 ml acetonitrilu 40 směs třepejte jednu minutu a poté 15 minut extrahujte pomocí ultrazvuku (viz. Obr. 1 a 2) Obrázek la 2- Extrakce vzorků půdy v ultrazvukové lázni k vytvořené suspenzi postupně přidávejte 4 g MgS04 + 1 g NaCI + směs citronanů (1 g Na2Citr.2H20 + 0.5 g Na2HCitr.l.5H20), po každém přídavku cca 1 minutu třepejte Poznámka: Po přidání síranu horečnatého důkladně protřepejte, aby se netvořily hrudky. Po přidání citronanů dochází k uvolnění tepla, proto je vhodné vzorky během třepání chladit, aby nedošlo k rozkladu méně stabilních pesticidů. zkumavku centrifugujte po dobu 5 minut při 3000 rpm (viz. Obr. 3) Obrázek 3 - Centrifugace vzorků 41 • z horní vrstvy odeberte 5 x 1 ml do čistých PP zkumavek • k 1 ml alikvotního podílu extraktu přidejte: 1. - 2. 150 mg MgS04 3. 50 mg PSA + 150 mg MgS04 4. 50 mg Silica-C18 + 150 mg MgS04 5. 50 mg EnviCarb + 150 mg MgS04 Obrázek 4 - Kapalinová chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí • zkumavky uzavřete, protřepejte přibližně 1 minutu a následně centrifugujte po dobu 5 minut při 3000 rpm • odeberte 0,5 ml extraktu do 2ml vialky, přidejte 0,5 ml mili-Q vody, 10 u.1 5% HCOOH v acetonitrilu a vnitřní standard dle pokynů vyučujícího • měření bude provedeno pomocí kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí (LC-MS/MS) (viz. Obr. 4) Otázky Jaké další metody se dají využít pro extrakci půdy? Proč je důležité na začátku důkladně prosít vzorek půdy? Pro který další typ vzorků je vhodné použít metodu OuEChERS? Uveďte 3 příklady pesticidů, jejich zařazení do skupiny a jejich používání. 42 Reference (1) Gavrilescu, M. Fate of Pesticides in the Environment and Its Bioremediation. Eng. LifeSci. 2005, 5 (6), 497-526. https://doi.org/10.1002/elsc.200520098. (2) Martinez Vidal, J. L; Plaza-Bolaňos, P.; Romero-González, R.; Garrido Frenich, A. Determination of Pesticide Transformation Products: A Review of Extraction and Detection Methods. J. Chromatogr. A 2009,1216 (40), 6767-6788. https://doi.Org/10.1016/j.chroma.2009.08.013. (3) Asensio-Ramos, M.; Hernández-Borges, J.; Ravelo-Pérez, L. M.; Rodríguez-Delgado, M. A. Evaluation of a Modified QuEChERS Method for the Extraction of Pesticides from Agricultural, Ornamental and Forestal Soils. Anal. Bioanal. Chem. 2010, 396 (6), 2307-2319. https://doi.org/10.1007/s00216-009-3440-2. 43 12 Stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků (PAHs) ve vzorku ovzduší metodou GC-MS/MS Teoretický úvod: Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAHs) jsou lipofilní, všudypřítomné, organické sloučeniny, které se skládají alespoň ze dvou kondenzovaných aromatických jader'1,2'. Mají nespočet zástupců, a tak se v drtivé většině případů měří jen 16 EPA PAHs, které se označují jako prioritní'3'. Mezi těchto vybraných 16 zástupců patří i benzo(a)pyren, který je pro lidi prokazatelně karcinogenní'3'. Toxicita PAHs je různá pro každého zástupce, ale obecně to jsou dráždivé látky, mohou poškozovat ledvinovou a jaterní tkáň, jsou karcinogenní, mutagenní a teratogenní'1'. Je vybraných 16 zástupců opravdu reprezentativních? Co jejich deriváty nebo PAHs s více jádry, které mohou být více toxické? PAHs nejsou perzistentní, v atmosféře degradují, a přesto podléhají dálkovému přenosu'3'. Jsou semi-volatilní, což znamená, že se v atmosféře vyskytují v plynné i časticové fázi a dělí se mezi ně na základě svých vlastností a meteorologických podmínek (např. teplota)'3'. PAHs jsou produktem nedokonalého spalování jakékoli organické hmoty'4'. Záměrně se vyrábějí jen výjimečně, většinou pro vědecké použití'4'. Do prostředí se dostávají lidskou činností (doprava, domácí topeniště, ...), ale i z přírodních zdrojů (sopky, přírodní požáry, ...)'4'. Primárně jsou emitovány do ovzduší, a proto bývají v ovzduší i nejčastěji měřeny či monitorovány. Mezi jednotlivými částmi životního prostředí však můžou volně přecházet'5'. Jaké zdroje PAHs budou dominovat na různých lokalitách ? Jaké jsou zdroje PAHs ve vnitřním prostředí? Vzorkovat ovzduší lze dvěma základními přístupy - aktivně a pasivně'6'. Aktivní vzorkovače mají v sobě pumpu a vyžadují stálý přívod elektřiny. Jsou také drahé a náročné'6'. Z těchto důvodů se začalo používat pasivní vzorkování'6'. Pasivní vzorkování využívá principu difúze, během kterého se látky sorbují na vzorkovací médium'6'. Jako vzorkovací médium může být použit váleček z polyuretanové pěny nebo XAD pryskyřice'7'. Myslíte si, že se vzorkovací média liší ve svých vlastnostech ? Pokud ano, ovlivní to vzorkování? U pasivního vzorkovače se nedá určit přesná koncentrace látek v ovzduší, pro tyto účely se používají různé modely a extrapolace'8'. V této úloze bude použit vzorkovač z obrázku 1. Není tolik efektivní při 44 vzorkování částic, ale používá se například pro srovnání jednotlivých lokalit mezi sebou nebo jako prvotní screening znečištění vzorkovací lokality'9'. Proč je důležité vzorkovat i částice? Která informace se zanedbá, když vzorkujeme jen částice nebo jen volné ovzduší? Postup práce Demonstrace odběru vzorku ovzduší na polyuretanový filtr (PUF) pasivního vzorkovače: Pomůcky: • pasivní vzorkovač (Obrázek 1) • předčištěný polyuretanový filtr (8h aceton, 8h dichlormethan), zabalený ve dvou vrstvách alobalu • laboratorní rukavice • alobal, PE sáček (zip lock) • odběrový protokol Obrázek 1 Pasivní vzorkovač ovzduší na a) fotografii a b) schématu (www.monairnet.eu) Vzorkování: • uchopte středovou tyč pasivního vzorkovače za zavěšovací hák • navlečte dvě bezpečnostní matky, které zakotvují horní část vzorkovače • navlečte podložku a svrchní část vzorkovače (nerezová polokoule o průměru 30 cm) • následuje podložka, matička a delší nerezová trubička • umístěte na středovou tyč předčištěný polyuretanový filtr s vloženým nerezovým středem 45 • pokračujte s navlékáním v pořadí podložka, kratší nerezová trubička, matička, podložka, spodní část vzorkovače, podložka a dvě bezpečnostní matičky • jako poslední zahákněte do otvoru na středové tyči bezpečnostní háček • obvyklá doba expozice takto sestaveného pasivního vzorkovače je 28 dní Práce v laboratoři: Pomůcky: • automatický extraktor Búchi, extrakční baňka s varnými kamínky, extrakční patrona • vialky • automatická pipeta a Pasteurova pipeta • skleněná trubička • skleněná kolona • mini-vialka • předčištěná vata • laboratorní sklo Chemikálie: • dichlormethan, n-hexan, nonan • recovery standard (izotopicky značené sloučeniny PAHs) • aktivovaný silikagel (12 h při 150 °C) • vnitřní standard Zpracování vzorků: do tří čtvrtin varné baňky nalijte extrakční rozpouštědlo (DCM) a přidejte 3-4 varné kamínky • vyjměte exponovaný polyurethanový filtr (PUF) z alobalu a vložte jej spolu se skleněnou trubičkou do extrakční patrony • přidejte k PUF recovery standard podle pokynu vyučujícího a umístěte patronu do těla automatického extraktoru • ujistěte se, zda jsou všechny části dobře utěsněné, otevřete proud chladící vody a zapněte extraktor, zvolte program pro extrakci dichlormethanem (horká extrakce 40 minut, proplachování 20 minut) Obrázek 2 Fotka automatického extraktoru Búchi 46 Obrázek 3 Fotka skleněných kolon po skončení programu vyjměte patronu s filtrem a extrakt odpařte na objem asi 5 ml příslušným programem pomocí Pasteurovy pipety kvantitativně převeďte zahuštěný extrakt do vialky vzorky zkoncentrujte pod proudem dusíku na objem 1 ml připravte kolonu k čištění: o na dno skleněné kolony vložte smotek předčištěné vaty o nad něj nasypte 5 g aktivovaného silikagelu a tyčinkou mírně sklepejte naneste vzorek, proveďte eluci 10 ml hexanu a 20 ml dichlormethanu eluáty jímejte do vialek eluát odpařte pod mírným proudem dusíku na 1 ml vzorek převeďte do mini-vialky, přidejte 50 u.1 nonanu přidejte vnitřní standard podle pokynů vyučujícího mini-vialku pečlivě uzavřete a předejte vyučujícímu měření bude provedeno pomocí plynové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí (GC-MS/MS) Otázky Jak se mění koncentrace PAHs v ovzduší v průběhu roku? Jaké jsou rozdíly v koncentracích PAHs mezi městem a vesnicí? Jaká další vzorkovací média se dají použít pro PAHs v ovzduší? Obrázek 4 Fotka dusíkového koncentrátoru V jakých jednotkách budou Vaše výsledky? Dají se převést na ng m~3? 47 Zdroje 1. Kim, K.-H., Jahan, S. A., Kabir, E. and Brown, R. J. C: A review of airborne polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and their human health effects, Environ. Int., 60, 71-80, doi:10.1016/J.ENVINT.2013.07.019, 2013. 2. Andersson, J.T., Achten, C, 2015. Time to Say Goodbye to the 16 EPA PAHs? Toward an Up-to-Date Use of PACs for Environmental Purposes. Polycycl. Aromat. Compd. 35, 330-354. https://doi.org/10.1080/10406638.2014.991042 3. Keyte, I.J., Harrison, R.M., Lammel, G., 2013. Chemical reactivity and long-range transport potential of polycyclic aromatic hydrocarbons-a review. Chem. Soc. Rev. 42, 9333-9391. https://doi.org/10.1039/c3cs60147a 4. Dat, N.D., Chang, M.B., 2017. Review on characteristics of PAHs in atmosphere, anthropogenic sources and control technologies. Sci. Total Environ. 609, 682-693. https://doi.Org/10.1016/j.scitotenv.2017.07.204 5. Cetin B, Óztúrk F, Keles M, Yurdakul S (2017) PAHs and PCBs in an Eastern Mediterranean megacity, Istanbul: their spatial and temporal distributions, air-soil exchange and toxicological effects. Environ Pollut 220:1322-1332. https://doi.Org/10.1016/j.envpol.2016.ll.002 6. Pohlker C, Baumann K., Lammel G.: Air sampling methods, in: Foken T. (ed.): Handbook of atmospheric measurements, Springer, Cham, Switzerland, 2020 7. Wania, F., Shen, L, Lei, Y.D., Teixeira, C, Muir, D.C.G., 2003. Development and Calibration of a Resin-Based Passive Sampling System for Monitoring Persistent Organic Pollutants in the Atmosphere. Environ. Sci. Technol. 37, 1352-1359. https://doi.org/10.1021/es026166c 8. Melymuk, L., Robson, M., Helm, P.A., Diamond, M.L., 2011. Evaluation of passive air sampler calibrations: Selection of sampling rates and implications for the measurement of persistent organic pollutants in air. Atmos. Environ. 45, 1867-1875. https://doi.Org/10.1016/j.atmosenv.2011.01.011 9. Jaward, F.M., Farrar, N.J., Harner, T., Sweetman, A.J., Jones, K.C., 2004. Passive air sampling of polycyclic aromatic hydrocarbons and polychlorinated naphthalenes across Europe. Environ. Toxicol. Chem. 23, 1355-1364. https://doi.org/10.1897/03-420 48 13 Jehličí jako pasivní vzorkovač ovzduší Teoretický úvod: Termín perzistentní organické polutanty (POPs) byl zaveden v rámci Stockholmské úmluvy o persistentních organických polutantech, která byla podepsána v roce 2001 ve Stockholmu pod patronátem Programu OSN pro životní prostředí (UNEP)(1). POPs jsou jednou z nejproblematičtějších skupin organických sloučenin v životním prostředí. Tyto látky jsou lipofilní, toxické, bioakumulativní, semi-volatilní a odolné vůči degradaci. Podléhají dálkovému transportu a dostávají se tak i do oblastí, ve kterých nebyly nikdy vyráběny ani používány'2'. Dokážete vysvětlit princip atmosférického dálkového transportu? Mezi POPs patří řada organických látek, jako jsou organochlorované pesticidy (OCPs, např. DDT), polychlorované bifenyly (PCBs) nebo polychlorované dibenzo-dioxiny a dibenzo-furany (PCDDs, PCDFs). Často se k POPs přiřazují i polycyklické aromatické uhlovodíky (PAHs), ačkoli nejsou perzistentní. Sdílejí však ostatní problematické vlastnosti, a tak se často monitorují společně. Jaké jsou rozdíly ve struktuře POPs a PAHs? Které vlastnosti spolu tyto dvě skupiny sdílejí? Vzorkují se ve všech složkách životního prostředí a jsou zahrnuty v mnoha monitorovacích projektech'3'. POPs a PAHs lze také měřit v biologických matricích. Na RECETOXu se tyto látky měří například v krevním séru nebo v jehličí. V této úloze budete zpracovávat jehličí, které představuje užitečný nástroj k hodnocení kontaminace volného ovzduší'4'. Výhodou jehličnatých stromů je jejich dlouhá životnost. Dokážou efektivně sorbovat POPs a PAHs během dlouhých časových období, protože jehlice obsahují na svém povrchu voskovou vrstvu, která je lipofilní'4'. Slouží tak jako přírodní pasivní vzorkovač ovzduší'4'. Jakou výhodu má jehličí oproti klasickému vzorkovači ovzduší? Kterými různými procesy se polutanty do jehličí mohou dostat? Na čem jsou tyto procesy závislé? 49 Postup práce Pomůcky: • alobal, PE sáček (zip lock) • mlýnek • laboratorní váhy • automatický extraktor Búchi • extrakční patrony • přečištěná vata • Pasteurova pipeta, automatická pipeta • skleněné kolony (velké, malé) • laboratorní sklo • Turbovap nádobka • Turbovap Chemikálie: • dichlormethan, n-hexan, nonan • recovery standardy (Izotopově značené sloučeniny PAHs, odpovídající sloučeniny pro PCBs a OCPs - upřesní vyučující) • přečištěný silikagel • aktivovaný silikagel (12 h při 150 °C) • aktivovaný silikagel (12 h při 150 °C) modifikovaný kyselinou sírovou (22 ml kyseliny sírové na 50 g aktivovaného silikagelu) • kyselina sírová • vnitřní standard 50 Zpracování vzorků: • z vysušených jehlic si navažte přibližně 10 gramů a v laboratorních rukavicích oddělte jehlice od brachyblastů Obrázek 6 Fotka mlýnku na jehlice jehlice a brachyblasty vložte do papírových extrakčních patron. Nahoru položte kousek přečištěné vaty přidejte recovery standard podle pokynu vyučujícího a patrony vložte do automatického extraktoru do tří čtvrtin varné baňky nalijte extrakční rozpouštědlo (DCM) a přidejte 3-4 varné kamínky ujistěte se, zda jsou všechny části dobře utěsněné, otevřete proud chladící vody a zapněte extraktor, zvolte program pro extrakci dichlormethanem (horká extrakce 40 minut, proplachování 20 minut) po skončení programu vyjměte patronu a extrakt odpařte Obrázek 7 Fotka automatického extraktoru na objem asi 5 ml příslušným programem 51 • pomocí Pasteurovy pipety kvantitativně převeďte zahuštěný extrakt do vialky • vzorky zakoncentrujte pod proudem dusíku, nebo přidejte rozpouštědlo (DCM) tak, aby závěrečný objem byl 10 ml a rozdělte na dva podle pokynů vyučujícího (analýza PAHs a analýza PCBs + OCPs) • odpařte obě frakce pod jemným proudem dusíku na objem 1 ml • vzorky zasypte malým množstvím přečištěného silikagelu tak, aby vznikla homogenní sypká směs • připravte kolonu k čištění pro vzorky určené na analýzu PAHs: o na dno skleněné kolony dejte na spodek kousek přečištěné vaty o nasypte 5 g aktivovaného silikagelu • naneste vzorek, proveďte eluci 10 ml n-hexanu a 20 ml dichlormethanu • eluáty jímejte do vialek • připravte kolonu k čištění pro vzorky určené na analýzu PCBs + OCPs: o do velké kolony dejte na spodek kousek přečištěné vaty o nasypte 5 g aktivovaného silikagelu a 25 g aktivovaného silikagelu modifikovaného kyselinou sírovou • naneste vzorek • proveďte eluci 100 ml směsi n-hexamdichlormethan (1:1) • eluáty jímejte do turbovapových nádobek • použijte k přečištění vzorků PAHs gelovou permeační chromatografii • vzorky PAHs zkoncentrujte pod proudem dusíku a vzorky PCBs + OCPs v odpařovacím systému Turbovap • vzorek převeďte do mini-vialky, přidejte 50 u.1 nonanu • přidejte vnitřní standard podle pokynů vyučujícího • mini-vialku pečlivě uzavřete a předejte vyučujícímu • měření bude provedeno pomocí plynové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní detekcí (GC-MS/MS) Obrázek 8 Fotka odpařovacího systému Otázky Porovnejte výsledné koncentrace látek PAHs, PCBs, OCPs jehlic a brachyblastů v přepočtu na navážku. Co mohlo způsobit jejich rozdíly? Porovnejte koncentrace jednotlivých skupin mezi sebou. Jaké jsou zdroje těchto látek v ovzduší? 52 Proč není vhodné používat listy z listnatých stromů? Zamyslete se, jestli se liší koncentrace celých jehlic, nastříhaných a namletých. Jestli ano, jakým způsobem? Zdroje 1. UNEP (2008) United Nations Environment Programme. Stockholm Convention. http://chm.pops.int/Portals/0/download.aspx?d=UNEP-POPS-COP-CONVTEXT-2017.English.pdf (21.5.2020) 2. El-Shahawi, M.S., Hamza, A., Bashammakh, A.S., Al-Saggaf, W.T., 2010. An overview on the accumulation, distribution, transformations, toxicity and analytical methods for the monitoring of persistent organic pollutants. Talanta 80, 1587-1597. https://doi.Org/10.1016/j.talanta.2009.09.055 3. Klánová, J., Harner, T., 2013. The challenge of producing reliable results under highly variable conditions and the role of passive air samplers in the Global Monitoring Plan. TrAC - Trends Anal. Chem. 46, 139-149. https://doi.Org/10.1016/j.trac.2012.07.021 4. I. Holoubek, P. Kořínek, Z. Šeda, E. Schneiderová, I. Holoubková, A. Pad, J. Tříska, P. Cudlín, J. Čáslavský, 2000. The use of mosses and pine needles to detect persistent organic pollutants at local and regional scales. Environmental Pollution, Volume 109, Issue 2, 283-292, https://doi.org/10.1016/S0269-7491(99)00260-2. 53 14Stanovení zpomalovačů hoření ve vzorku prachu Teoretický úvod: Vnitřní prostředí Vnitřním prostředím nazýváme místa v uzavřených prostorách jako jsou například naše domy, kanceláře, školy, veřejné prostory nebo dopravní prostředky. Vzhledem k faktu, že v naší moderní společnosti trávíme nad 90 % času v těchto prostorách1, je vnitřní prostředí stěžejní pro lidské zdraví. Kolik času trávíte ve vnitřním prostředí? Pozorujete rozdíly mezi pracovním a víkendovým dnem nebo létem a zimou? Prach Ve vnitřním prostředí můžeme vzorkovat vzduch, samotné materiály, anebo usazený prach. Prach je všudypřítomná matrice, která obsahuje heterogenní směs částic složených například z vláken, usazených částic z ovzduší, vlasů, popela, hlíny, drobků nebo bakterií, pylu či plísně2. Zároveň obsahuje směs chemikálií (semivolatilní a netěkavé) reflektujících složení okolního prostředí. Kvůli tomu má prach významný podíl na expozici. Tato expozice je ovlivněna jak lidským chováním ve vnitřním prostředí, tak obsahem chemikálií v prachu. Pro některé látky (např. zpomalovače hoření) je prach hlavní matricí pro lidskou expozici3. Velká výhoda prachu je, že je snadno získatelný. Díky výše zmíněným vlastnostem je prach důležitý pro posuzování expozice a je hodnotnou matricí pro zkoumání vnitřního prostředí4. Kolik jste za svůj život snědli prachu? Průměrně dítě do jednoho roku sní 30 mg/den, dítě ve věku jednoho až šesti let 60 mg/den a od šesti let je pak průměrné množství snědeného prachu 30 mg/den. Možnosti vzorkování Prach je možné vzorkovat dvěma různými metodami: (1) stery - Obr. la; a (2) vysávání - Obr. lb.2 Stery mohou být jak suché, tak mokré, například použitím isopropylalkoholu. K samotnému steru bývají používány jak předčištěné ubrousky, tak speciální zařízení, která mohou regulovat tlak na povrch stíraného materiálu.2 Metody steru se používají především pro hladké povrchy nábytku, elektrospotřebičů nebo oken. V závislosti na druhu informace, kterou chceme získat, lze zvolit různé přístupy vzorkování vysáváním. Můžeme analyzovat prach z celého sáčku vysavače, nebo vysát vysavačem samostatně do sáčku plochu celého bytu, případně se můžeme zaměřit na vysávání jednotlivých částí prostoru. K tomu se pak používají např. nylonové ponožky, které se vloží do hlavice vysavače a prach se v nich zachytí. Další 54 možností je použití speciální hlavice s mřížkou pro filtr, na kterém se zachytí vzorkovaný prach. Tato metoda se používá především pro podlahy, koberce a čalouněný nábytek. Jaké vidíte limity dvou uvedených vzorkovacích metod? V jakých jednotkách byste prezentovali získané výsledky? Stery mohou být jak suché, tak mokré. Předpokládáte nějaký rozdíl ve výsledcích v závislosti na použití metody? Pokud ano, jaký? Obr. 1: a- vlhký stěr hladkého povrchu TV, b- nástavec na domácí vysavač pro vzorkování prachu, který je zadržen na křemenném filtru. Homogenizace prachu Jak již bylo zmíněno, prach je tvořen z usazených heterogenních částic. Pro lepší reprodukovatelnost a spojitost s expozicí se prach prosívá a rozděluje do frakcí podle velikosti částic, Zatím však není definovaná doporučená velikost částic pro jednotné vzorkování. Na Obr. 2 můžete vidět frakce od velikosti částic >2 mm po <0,25 mm. 55 Obr. 2: Prach ze sáčku z vysavače a) před prosíváním, podle velikosti částic b) >2 mm, c) 2 mm >x> 1 mm, d) 1 mm >x>0,5mm, e)0,5mm >x>0,25mm af) 0,25mm >x.s Která frakce je podle vás nejvíce relevantní, co se týče expozice? Myslíte si, že je problém, že není ustanovena jednotná velikost pro analýzu prachu ? Proč? Jakou velikost byste zvolili vy? Zpomalovače hoření Jednou z mnoha skupin chemikálií, které detekujeme v prachu, jsou zpomalovače hoření.4 Zpomalovače hoření jsou používány v mnoha hořlavých materiálech (např. elektronika, plasty nebo textil) k omezení jejich hořlavosti a k prodloužení času na útěk.6 Zpomalovače hoření jsou nesourodou skupinou látek a mohou být jak anorganické, tak organické. Organické zpomalovače hoření dělíme do dvou skupin, které se liší jak fyzikálně-chemickými vlastnostmi, tak použitím v jednotlivých materiálech. První skupinou jsou halogenované zpomalovače hoření7 (např. polybromované difenylethery (PBDE) nebo hexabromobenzen) a druhou skupinou jsou polárnější organofosfátové estery,8 které jsou používány i jako změkčovadla (př. zástupců na Obr. 3). Kvůli všudypřítomnosti zpomalovačů hoření v různorodých prostředích a evidencím o jejich možné toxicitě je sledování těchto látek důležité. 56 Br Br TDCIPP TNBP Obr. 3: Vybraní zástupci zpomalovačů hoření: obecný vzorec polybromovaných difenyetherů (PBDEs), dva zástupci nových zpomalovačů hoření (DBDPE a HBB) a dva zástupci organofosfátových estrů s chlorem (TDCIPP) a bez chloru (TNBP). Jakým způsobem mohou být zpomalovače hoření toxické? Otázky po absolvovaném praktiku: Popište mechanismus, jakým PBDE zpomalují hoření. Které organické zpomalovače hoření jsou polárnější? Bude to mít vliv na volbu přípravy vzorku k analýze? Během cvičení byla několikrát zmíněna rovnováha. Při kterých částech přípravy vzorku jsme využívali ustanovování rovnováhy? Reference: (1) Schweizer, C; Edwards, R. D.; Bayer-Oglesby, L; Gauderman, W. J.; Ilacqua, V.; Jantunen, M. J.; Lai, H. K.; Nieuwenhuijsen, M. J.; Kúnzli, N. Indoor Time-Microenvironment-Activity Patterns in Seven Regions of Europe. J. Expo. Sci. Environ. Epidemiol. 2007,17(2), 170-181. (2) Lioy, P. J.; Freeman, N. C. G.; Millette, J. R. Dust: A Metric for Use in Residential and Building Exposure Assessment and Source Characterization. Environ. Health Perspect. 2002, 110 (10), 969-983. https://doi.org/10.1289/ehp.02110969. (3) Jones-Otazo, H. a.; Clarke, J. P.; Diamond, M. L; Archbold, J. a.; Ferguson, G.; Harner, T.; Richardson, G. M.; Ryan, J. J.; Wilford, B. Is House Dust the Missing Exposure Pathway for 57 PBDEs? An Analysis of the Urban Fate and Human Exposure to PBDEs. Environ. Sei. Technol. 2005, 39 (14), 5121-5130. https://doi.org/10.1021/es048267b. Melymuk, L; Demirtepe, H.; Jílková, S. R. Indoor Dust and Associated Chemical Exposures. Curr. Opin. Environ. Sei. Heal. 2020,15, 1-6. https://doi.org/10.1016/jxoesh.2020.01.005. Jílková, S. R. Endocrine Disrupting Chemicals, Masaryk UNiversity, 2019. De Wit, C. A. An Overview of Brominated Flame Retardants in the Environment. Chemosphere 2002, 46 (5), 583-624. https://doi.org/10.1016/S0045-6535(01)00225-9. de Wit, C. A. An Overview of Brominated Flame Retardants in the Environment; 2002; Vol. 46. https://doi.org/10.1016/S0045-6535(01)00225-9. van der Veen, I.; de Boer, J. Phosphorus Flame Retardants: Properties, Production, Environmental Occurrence, Toxicity and Analysis. Chemosphere 2012, 88 (10), 1119-1153. https://doi.org/10.1016/jxhemosphere.2012.03.067. 58 14.1 Stanovení halogenovaných zpomalovačů hoření ve vzorku prachu I. Soxhletova extrakce Pomůcky: • vzorek domácího prachu z vysavače • jednorázové extrakční patrony • předčištěná vata • automatický extraktor Búchi • extrakční baňka • teflonové varné kamínky • vialky EPA 20 ml, EPA40 ml • jednorázové skleněné Pasteurovy pipety • předvážky Chemikálie: • extrakční standardy • dichlormethan (DCM) Postup práce: • vzorek domácího prachu (cca 0,1 g) navažte do jednorázové extrakční patrony • přidejte ke vzorku extrakční standardy • v patrone vzorek přikryjte kouskem předčištěné vaty a zatěžte malou skleněnou zátkou • do extrakční nádobky nalijte rozpouštědlo (DCM), cca 150 ml, přidejte teflonový varný kamínek • extrahujte programem pro extrakci DCM (40 minut horký Soxhlet, 20 minut prokapávání rozpouštědlem) • po ukončení extrakce zkoncentrujte vzorek příslušným programem na objem menší než 10 ml •vzorek kvantitativně převeďte do 20ml vialky (původní extrakční nádobku promyjte alespoň 2x 1-2 ml DCM a přidejte k extraktu ve vialce) • odpařte extrakt pod proudem dusíku na objem cca 1-2 ml II. Čištění Pomůcky: • skleněná kolona, vnitřní průměr 1 cm • vialka o objemu 40 ml • Pasteurova pipeta, vata • mini-vialka o objemu 1 ml 59 Obr. 4: Automatický extraktor Búchi Chemikálie: • čištěný aktivovaný silikagel (aktivace 12 hod při 150°C) • čištěný neaktivovaný silikagel • silikagel modifikovaný kyselinou sírovou (22 ml koncentrované H2SO4 + 50 g aktivovaného silikagelu) • hexan, DCM, nonan Postup práce: • připravte kolonu k separaci: o na dno kolony vložte smotek vaty o na něj nasypte asi 1 cm vysoký sloupec čištěného aktivovaného silikagelu, nad tuto vrstvu 5 g čištěného aktivovaného silikagelu modifikovaného kyselinou sírovou o tyčinkou mírně sklepejte o na vrchol sloupce nasypte 1-2 cm vrstvu neaktivovaného silikagelu a opět sklepejte • vzorek kvantitativně naneste na kolonu • proveďte eluci 30 ml 50% DCM v hexanu do 40ml vialky • vzorek zakoncentrujte pod mírným proudem dusíku na cca 100 u.1 • vzorek převeďte do předem označené mini-vialky, přidejte 40 u.1 nonanu a odpařte na finální objem 40 u.1 • přidejte vnitřní standardy • mini-vialku pečlivě uzavřete a uschovejte v ledničce až do provedení analýzy 60 Obr. 5: Eluce vzorku z kolony se silikagelem modifikovaným kyselinou sírovou III. Stanovení analytů pomocí GC-MS Stanovení BFR bude provedeno pomocí GC-MS. 14.2 Stanovení organofosfátových esterů ve vzorku prachu I. Extrakce v methanolu Pomůcky: • vzorek prachu • extrakční nádobka (vialka nebo kádinka) • vialky EPA 20 ml • jednorázové skleněné Pasteurovy pipety • předvážky Chemikálie: • izotopicky značené extrakční standardy OPEs • methanol Postup práce: • navažte přibližně 100 mg prachu do vialky • ke vzorku ve vialce přidejte izotopicky značené extrakční standardy OPEs • extrakci proveďte třikrát: o do vialky přidejte 3 ml methanolu 61 o extrahujte v ultrazvukové lázni 20 min o 10 minut nechte usadit o převeďte extrakt do nové vialky výsledek: 9 ml extraktu ve vialce Obr. 6: Extrakce v ultrazvukové lázni II. Čištění Pomůcky: • injekční stříkačky 2ml • stříkačkové nylonové filtry (0,45 um) • mini-vialky (2 ml) • jednorázové skleněné Pasteurovy pipety • předvážky Chemikálie: • methanol • Mili-Qvoda Postup práce: • extrakt zakoncentrujte pod proudem dusíku a při ohřevu na teplotu 35 °C na přibližně 1 ml • extrakt přefiltrujte přes stříkačkový nylonový filtr • filtrát zakoncentrujte pod proudem dusíku na méně než0,5 ml • přidejte methanol tak, abyste měli přesně 0,5 ml vzorku • přidejte 0,5 ml Mili-Q. vody Obr. 7: Filtrace extraktu přes stříkačkový nylonový filtr III. Stanovení analytů pomocí LC-MS Stanovení OPEs bude provedeno pomocí LC-MS. 63 15 Stanovení metabolitů endokrinních disruptorů ve vzorcích moči Teoretický úvod: Lidé jsou vystaveni působení množství látek, u kterých jsou známé nebo předpokládané negativní účinky na zdraví. Látky známé jako endokrinní disruptory (ED) narušují hormonální rovnováhu a tím způsobují další nežádoucí zdravotní efekty (WHO, 2013). Tyto látky jsou hojně průmyslově využívány a nacházejí se v množství výrobků kolem nás. Proto je důležité znát jejich množství v lidských organismech (Esteban and Castaňo, 2009). ED jsou lidským tělem poměrně snadno odbourávány, tudíž je možné sledovat jejich koncentrace ve formě metabolitů například v moči (Barr et al., 2002). Avšak i přesto, že jsou snadno odbouratelné, jejich koncentrace v lidských organismech neklesají. Naopak kvůli vysoké expozici hladiny ED v lidských tkáních stále vzrůstají. Proto jsou tyto látky často označované za pseudopersistentní. Jaké mohou být expoziční cesty ED do lidského organismu? Ftaláty Ftaláty jsou průmyslově používány jako změkčovače plastů, rozpouštědla nebo stabilizační činidla. Existuje mnoho výrobků s obsahem ftalátů, například plastové součástky automobilů, lékařské vybavení apod. (Kolarik et al., 2008). Ftaláty jsou často obsaženy i v kosmetických produktech, jako jsou parfémy, laky na vlasy nebo nehty, apod. (Bernard et al., 2014). Jsou rovněž používány při výrobě PVC (polyvinylchloridu) nebo výrobků obsahujících PVC, jako jsou například plastové tašky, obaly na skladování kosmetiky apod. V kosmetických prostředcích se tedy ftaláty mohou objevovat jak cíleně (např. jako rozpouštědla), tak neúmyslně, kdy se do výrobku dostanou z plastového obalu. Ftaláty jakožto přídavky totiž nejsou pevně chemicky vázány na plast, proto se z něj mohou časem uvolňovat, dostávat se do prostředí a různě v něm migrovat (Gimeno et al., 2014). Alternativní náhrady Vzhledem k tomu, že některé ftaláty jsou kvůli svému negativnímu působení legislativně omezeny, používají se v průmyslu tzv. alternativní náhrady. To jsou látky, které mají velmi podobné vlastnosti jako ftaláty, ale v současné době jsou považovány za bezpečné. Bohužel, právě díky jejich podobným vlastnostem v produktech se dá předpokládat podobné působení taktéž v organismech, proto je vhodné monitorovat i tyto látky (Schütze et al., 2012). V našem případě se jedná o látku s názvem DINCH (Diisononyl ester 1,2-cyclohexan dikarboxylové kyseliny). Ta je v současné době hojně používána, a to i v takových produktech, jako jsou výrobky pro děti nebo lékařské vybavení. 64 Bisfenoly Bisfenoly jsou syntetické sloučeniny hojně používané v množství výrobků. Jsou definovány jako nepersistentní látky s krátkým poločasem života (okolo 6 hodin) v lidském organismu (Sakhi et al., 2018). Dekonjugované bisfenoly v moči jsou často používány jako biomarkery k určení celkové expozice bisfenolům (Moos et al., 2014). Nejběžnějším zástupcem je bisfenol A (BPA), který je používán v různých produktech, jako jsou dentální tmely, konzervy, termopapíry, produkty osobní péče nebo potravinové obaly (Geens et al., 2014). Vliv BPA na estrogenní aktivitu a reprodukční toxicitu je dobře znám, kvůli svým endokrinně disruptivním účinkům a toxicitě ošetřen legislativou REACH (ECHA, 2013). Proto bylo jeho použití v kojeneckých lahvích v Evropě od roku 2011 legislativně omezeno (EU, 2011) a později dokonce zakázáno Evropskou komisí (ECHA, 2016). Vhodné látky k nahrazení BPA v některých produktech jsou bisfenol S a bisfenol F. Pesticidy Pesticidy jsou široce používané látky, které jsou často aplikovány a nadvyužívány v zemědělství, ale i na residenčních plochách, což vede k jejich rozšíření do všech složek prostředí. Je tedy nemožné se expozici pesticidům zcela vyhnout. Většina akutních efektů expozice je dobře známá, ale chronická expozice nízkým dávkám může způsobit závažné problémy, navíc je to téma, o kterém není dostatek informací (Baker et al., 2000). Existuje mnoho skupin pesticidů, jako jsou karbamátové insekticidy, organofosfátové insekticidy, organochlorované pesticidy nebo pyrethroidy. V tomto případě bude kladen důraz na metabolity organofosfátových insekticidů a pyrethroidů, jelikož mají vyšší polaritu, a proto bude výskyt jejich metabolitů v moči více očekávaný/pravděpodobný. Zamyslete se nad průběhem svého normálního dne. Kolikrát a kde přijdete do kontaktu s těmito látkami? Napadají vás nějaké kroky, jak zmenšit potenciální expozici výše zmíněným látkám ? Následující postup přípravy vzorku je vhodný pro všechny zmíněné skupiny látek, limitující je pouze přítomnost konkrétních isotopicky značených standardů. Postup práce Pomůcky • 2,5ml Epperdorf zkumavky • skleněné Pasteurovy pipety • manifold na SPE • kolonky Oasis HLB (60 mg, 3cc) • mini-vialky 65 Chemikálie • octan amonný • ß-glukuronidaza • kyselina octová • acetonitril • methanol • mili-Qvoda • směsný standard příslušných izotopicky značených metabolitů Zpracování vzorků • do čisté 2,5ml Eppendorf zkumavky napipetujte 0,5 ml moči (do slepého vzorku 0,5 ml Mili-Q vody), značený standard (10 ng/ml; 5 ng/vzorek) a 127,5 u.1 roztoku ß-glukuronidazy v octanu amonném (6,25 ml lmM octanu amonného a 125 u.1 ß-glukuronidazy) • zkumavku zavřete, vortexujte po dobu 10 sekund a nechejte inkubovat při 37 °C po dobu 90 minut Obrázek 1 Aparatura pro inkubační enzymatickou reakci (37 "C, 90 minut) Proč necháváme reagovat naše cílové analyty s enzymem (6-glukuronidázou) při teplotě 37 °C? Přečištění vzorku Pro přečištění vzorku a zároveň extrakci cílových analytů použijte extrakci na tuhé fázi, neboli solid-phase extraction (SPE): • do manifoldu umístěte kolonky s C18 sorbentem (Oasis HLB, 60 mg, 3 cc) • kolonky nejprve aktivujte 1 ml methanolu, poté ekvilibrujte 1 ml 0,1% kyseliny octové 66 • poté přes kolonku převeďte vzorek • kolonku promyjte 1 ml 0,1% kyseliny octové a 1 ml vody • nakonec vzorek eluujte 1 ml methanolu, z tohoto eluátu odeberte 500 u.1 do mini-vialek • vzorky budou poté analyzovány za použití HPLC-MS/MS systému Obrázek 2 Manifold a kolonky pro SPE Otázky Vysvětlete princip SPE. Jaké další látky byste očekávali, že naleznete v moči a proč? Jaké další metody zpracování vzorků moči se používají? Které další nežádoucí látky se mohou ve vzorcích moči vyskytovat, a od čeho je tedy pomocí SPE přečišťujeme? Reference: Baker, S.E., Barr, D.B., Driskell, W.J., Beeson, M.D., Needham, LL, 2000. Quantification of selected pesticide metabolites in human urine using isotope dilution high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Expo. Anal. Environ. Epidemiol. 10, 789-798. Barr, D.B., Barr, J.R., Maggio, V.L., Whitehead, R.D., Sadowski, M.A., Whyatt, R.M., Needham, L.L, 2002. A multi-analyte method for the quantification of contemporary pesticides in human serum and plasma using high-resolution mass spectrometry. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 778, 99-111. https://doi.org/10.1016/S0378-4347(01)00444-3 67 Bernard, L, Decaudin, B., Lecoeur, M., Richard, D., Bourdeaux, D., Cueff, R., Sautou, V., 2014. Analytical methods for the determination of DEHP plasticizer alternatives present in medical devices: A review. Talanta 129, 39-54. https://doi.Org/10.1016/j.talanta.2014.04.069 ECHA, 2016. Annex XV report PROPOSAL FOR IDENTIFICATION OF A SUBSTANCE OF VERY HIGH CONCERN ON THE BASIS OF THE CRITERIA SET OUT IN REACH ARTICLE 57 1, 80. ECHA, 2013. Inclusion of Substances of Very High Concern in the Candidate List for eventual inclusion in Annex XIV 1, 1-4. Esteban, M., Castano, A., 2009. Non-invasive matrices in human biomonitoring: A review. Environ. Int. 35, 438-449. https://doi.Org/10.1016/j.envint.2008.09.003 EU, 2011. Commission Regulation (EU) No 10/2011 of 14 January 2011 on plastic materials and articles intended to come into contact with food. Off. J. Eur. Union. Geens, T, Bruckers, L., Covaci, A., Schoeters, G., Fierens, T., Sioen, I., Vanermen, G., Baeyens, W., Morrens, B., Loots, I., Nelen, V., de Bellevaux, B.N., Larebeke, N. Van, Hond, E. Den, 2014. Determinants of bisphenol A and phthalate metabolites in urine of Flemish adolescents. Environ. Res. 134, 110-117. https://doi.Org/10.1016/j.envres.2014.07.020 Gimeno, P., Thomas, S., Bousquet, C, Maggio, A.-F., Civade, C, Brenier, C, Bonnet, P.-A., 2014. Identification and quantification of 14 phthalates and 5 non-phthalate plasticizers in PVC medical devices by GC-MS. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sei. 949-950, 99-108. https://doi.Org/10.1016/j.jchromb.2013.12.037 Kolarik, B., Bornehag, CG., Naydenov, K., Sundell, J., Stavova, P., Nielsen, O.F., 2008. The concentrations of phthalates in settled dust in Bulgarian homes in relation to building characteristic and cleaning habits in the family. Atmos. Environ. 42, 8553-8559. https://doi.Org/10.1016/j.atmosenv.2008.08.028 Moos, R.K., Angerer, J., Wittsiepe, J., Wilhelm, M., Brüning, T, Koch, H.M., 2014. Rapid determination of nine parabens and seven other environmental phenols in urine samples of German children and adults. Int. J. Hyg. Environ. Health 217, 845-853. https://doi.Org/10.1016/j.ijheh.2014.06.003 Sakhi, A.K., Sabaredzovic, A., Papadopoulou, E., Cequier, E., Thomsen, C, 2018. Levels, variability and determinants of environmental phenols in pairs of Norwegian mothers and children. Environ. Int. 114, 242-251. https://doi.Org/10.1016/j.envint.2018.02.037 Schütze, A., Pälmke, C, Angerer, J., Weiss, T, Brüning, T, Koch, H.M., 2012. Quantification of biomarkers of environmental exposure to di(isononyl)cyclohexane-l,2-dicarboxylate (DINCH) in urine via HPLC-MS/MS. J. Chromatogr. B 895-896, 123-130. https://doi.Org/10.1016/j.jchromb.2012.03.030 68 WHO, 2013. Endocrine DisruptiState of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals 2012. Summary for Decision-Makers, https://doi.org/10.1002/9781118346747.chl 69 Tato práce byla provedena za podpory projektu MUNI/FR/1160/2019 a výzkumné infrastruktury RECETOX (LM2018121, MŠMT).