Molecular identification •Species, individual, sex http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c1/Male.svg/100px-Male.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c1/Male.svg/100px-Male.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c1/Male.svg/100px-Male.svg.png http://www.nhbs.com/images/jackets_resizer_xlarge/19/196496_3.jpg Identification of individuals DNA fingerprinting (DNA profiling) Identification of individuals – why? •if we do not see the individual •non-invasive genetics – elusive animals, samples from faeces, urines, hairs – can be joined with individual variation of their diet •forensic genetics – identification of DNA in animal products, poachers, etc. • •species conservation – e.g. in falconary (confirmation of parentage) Microsatellites •Tandem repetitions of short motifs • •DNA extraction • •PCR • •Detection of alleles → sequencer, fragment analysis CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTC CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT tools_1a 3LOKCELE detector laser Individual human identification https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/prodImages/high/4473287_and_4473289_FINAL650x600.jpg http://www.cstl.nist.gov/strbase/kits/Identifiler.JPG http://www.bodetech.com/wp-content/uploads/2011/01/analyze-the-samples.png 16 loci = reliable individual identification (Euro-American population) Identification of individuals depends on level of polymorphism •multilocus microsatellite fingerprinting – power estimated as „probability of identity“ (P(ID)) (Waits et al. 2001) – e.g. GenAlex program • Number of loci (H=0.6) Random Sibs •pilot studies with tissue samples are required to identify P(ID) in a population studied by e.g. non-invasive methods Brown bears in Pyrenees Taberlet et al. 1997 •Faeces and hairs • •24 microsatellites • •4 males and 1 female with unique multilocus genotypes (more than according footprints and photos) • •Multiple-tube approach Spatial activity of otters •P. Hájková – PhD thesis (2008) • vydra_snezna Identified individuals - Hornád, NP Slovenský Raj mapa_komplet_orezana SR 1 SR 2 SR 3 SR 4 SR 5 SR 6 SR 7 SR 8 SR 9 SR 10 1 km vydra1 vysek02 kopie_orezana Ind. SR 3 otter_otocena_hneda 5. 4. 2003 4. 11. 2003 10. 11. 2003 11. 11. 2003 30. 12. 2003 500 m Hornad Spatial activity in mountain habitat Human forensic genetics •Pozůstatky vojáků z války Vietnam a Korea Identifikace na základě mtDNA příbuzných osob (lze jen někdy) V současnosti: vzorek DNA (krve) při odvodu, jiné markery Armed Forces Repository of Specimen Samples for the Identification of Remains • •Soudní pře Clinton-Lewinská Pozůstatky ruského cara Nikolaje II •Kriminalistika • •Oběti tragických událostí • • • 461921_Clinton_Lewinski News Czar-Nicholas-II- Klony Bambus Sasa senanensis •Suyama et al. 2000 • •Plocha 10 hektarů • •AFLP • •22 klonů • •Klon na ploše 300 m v průměru s_senanensis_M Slavní klonální bezobratlí •Rotifera – Bdelloidea • •Ostracoda (Darwinula) • •Partenogenetické klony vysokého stáří (milióny let) Darwinula stevensoni •organismy složené z buněk s různými genotypy • •Dictyostelium discoideum chimérismus je pravidelná součást života Genetické chiméry Genetické chiméry •Ficus srůst kořenů různých jedinců • •sumky Botryllus schlosseri chimérické kolonie příbuzní jedinci • •Diplosoma listerianum i nepříbuzní Celleporella hyalina (Bryozoa) Hughes et al. 2004 •Pravděpodobnost fůze koreluje s příbuzností • •Histokompatibilita • •Lepší rozpoznávání v pokročilejších fázích → dozrávání imunokompetence • •Speciální proteiny (spongikany...) Ceratioid anglerfish File:Representatives of ceratioid families.jpg •miniaturní samec po narození vyhledá samici, její kůže vyloučí hydrolytický enzym a samec přiroste • •vzniká hermafroditická chiméra Genetické chiméry – „microchimerism“ •kosman bělovousý Callithrix jacchus (asi i rod Saguinus) • •dizygotická dvojčata • •DNA fingerprinting krve - hematopoietické chiméry • •během embryonálního vývoje vzájemná výměna buněk kostní dřeně • •týká se to asi jen krve (neinvazivní metody – chlupy, trus → jeden genotyp) • •průnik embryonálních erytroblastů a volné DNA přes placentu i u člověka • •(pohlaví dítěte před narozením lze určit i pomocí PCR sekvencí typických pro Chr Y, jako templát je periferní krev matky) • title07-01 sagui_de_tufos_brancos Canine transmissible venereal tumor (CTVT) Devil facial tumour disease -parasitic cancer -„single cell parasitic wolf“ Známé „lidské chiméry“ - geneticky nepotvrzené mateřství - chiméra matky Foekje Dillema.jpg 46XX/46XY woman - holandská atletka, mistryně na 100 a 200 m - odmítla test na pohlaví - mozaika zjištěna až posmrtně (v r. 2007) Foekje Dillema Identification of sex DNA sexing Why? 1)species without sex dimorphism (birds, but also many mammals) 2)embryos, larvae 3)non-invasive methods 4) Genetic sex identification •genetic sex determination •birds (♂=ZZ, ♀=ZW) •mammals (♂=XY, ♀=XX) •DNA amplification of W/Y chromosome •W, Y – small chromosomes http://www.nature.com/scitable/content/18935/pierce_4_10_large_2.jpg Sex identification – birds Griffith et al. 1998 •CHD1W and CHD1Z, genes at sex chromosomes (chromobox-helicase-DNA-binding gene (CHD) – Griffiths & Tiwari 1995) • •Primers amplifying introns of both genes • •Introns differ by their length • •Up to three primer combinations • •Problematic species, e.g. Struthioniformes • ♂ ♂ ♂ ♂ ♀ ♀ ♀ ostrich Manorina melanocephala (Meliphagidae) Arnold et al. 2001 •Sons = „helpers“ • •In adults 2,31 males vs. 1 female • •Offspring in nests sex ratio 1:1 (57:57) • •Males are hatching first (in 17 out of 18 nests) they are bigger and heavier when leaving the nest • • OW_NoisyMinerThumbnail medosavka hlučná Sex identification - mammals •Amplification of a gene at Y-chromosome (Sry) (in duplex PCR with X-linked or autosomal fragment) • • •Microtus cabrerae Sry at Chr X Ellobius, Tokudaia Sry completely missing •Nannomys • Large variability • • Bryja and Konečný (2003) Ellobius Tokudaia osimensis M. cabrerae DSC_5565 Nannomys •Amplification of a gene at Y-chromosome (Sry) (in duplex PCR with X-linked or autosomal fragment) • • • • •Faecal analyses: species-specific primers are required to avoid a cross amplification with species in the diet bear3 odocoileus x Murphy et al. 2003 Bryja a Konečný 2003 Sex identification - mammals