S3 Tiskový výstup SKRIPTA KE CVIČENI Z OBECNÉ MIKROBIOLOGIE, CYTOLOGIE A MORFOLOGIE BAKTERIÍ Mgr. Jana Kopecká, Ph.D. Mgr. Gabriela Rotková, Ph.D. MASARYKOVA UNIVERZITA ELPORTÁL ii Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity Ústav experimentální biologie Vytvořeno ve spolupráci se Servisním střediskem pro e-learning na MU, http://is.muni.cz/stech/. Tiskový výstup publikace vydané na Elportále MU (http://elportal.cz/) http: //is.muni.cz/elportal/?id=111222 ©2017 Masarykova univerzita Obsah Úvod v Zásady bezpečné práce v mikrobiologické laboratoři vi I Obecná mikrobiologie 1 1 Příprava živných médií, kultivace mikroorganizmů, aseptická práce 2 2 Metody sterilní práce, očkování a uchovávání mikroorganizmů 8 3 Mikroorganizmy kolem nás 18 4 Úvod pro práci s mikroskopem 21 5 Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení 27 6 Bakteriofág 37 7 Bakteriofág transdukce 42 8 Nepřímé stanovení počtu životaschopných bakterií plotnovou metodou 45 9 Přímé stanovení počtu buněk v Bůrkerově komůrce, vitální test, kvasinky 50 10 AP-test (test acidifikační schopnosti) 54 11 Fyzikální a chemické prostředky kontroly růstu mikroorganizmů 57 12 Vliv některých barviv a alkoholických nápojů na růst bakterií 64 13 Stanovení citlivosti mikroorganizmů k antibiotikům, stanovení koncentrace antibiotik 69 14 Bakteriociny 77 15 Průkaz a izolace některých půdních mikroorganizmů 80 16 Winogradského kolona 86 17 Pozorování bakteriálních endospor a jejich barvení, negativní barvení 89 18 Základní mikrobiologický rozbor vody 99 19 Úvod do identifikace bakterií, biochemické testy a standardizované identifikační systémy 107 iv_OBSAH II Cytologie a morfologie bakterií 117 1 Gramovo barvení, negativní barvení, nativní preparát 118 2 Struktury buňky (barvení inkluzí a pouzder) 126 3 Pohyb buněk 131 4 Acidorezistentní barvení 136 5 Sklíčkové kultury 139 6 Fluorescence 144 Úvod Bakterie, viry a kvasinky nepatří do stejné taxonomické rodinky. Se všemi se seznámíme a možná se i něco přiučíme. V praktiku je nutné aseptický pracovat, abychom se mohli z hezkých výsledků radovat. Při plotnové metodě by měly být výsledky ve shodě. Míchat vzorek se vždy musí, každý si to prakticky zkusí. Inhibiční zóny vznikají, když citlivé bakterie se s antibiotiky setkají. Při vitálním barvení docházíme k zjištění, barvu nepřijme buňka živá, protože je její membrána funkční a celá. Pokud s fágy pracujeme, pak i bakterie potřebujeme, aby se fágy mohly pomnožit a fázový lyzát či plaky vytvořit. Buď pozitivní modré či negativní červené, jsou buňky po „Gramoví" zbarvené. Při rozboru vody mají bakterie hody, kultivujeme je na selektivním médiu, a někdy vzorek médiem zaleju. Jde nám o enterokoky a bakterie koliformní, ve vodě není vhodný jejich výskyt enormní. Postupná identifikace a testy základní jsou pro správné určení vždycky to zásadní. Zásady bezpečné práce v mikrobiologické laboratoři 1. Vstup do laboratoře je povolen pouze osobám vykonávajícím cvičení. 2. V laboratoři vykonávejte pouze práci stanovenou obsahem cvičení. 3. V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit. 4. V laboratoři je nutné používat laboratorní plášť a prezuvky. 5. V laboratoři je zakázáno otevírat okna. Větrání je zajištěno pomocí klimatizace. 6. Před příchodem do laboratorního cvičení se seznamte s jeho obsahem. 7. Před započetím a po ukončení práce je třeba dezinfikovat pracovní plochu, umýt si a dezinfikovat ruce. 8. Na pracovní plochu pokládejte co nejméně osobních věcí. Na pracovní ploše může snadno dojít k jejich kontaminaci. Oblečení, batohy a tašky odkládejte v šatně. 9. Pracujte pečlivě a opatrně. Zabráníte tím kontaminaci materiálu a náhodnému potřísnění pracovní plochy a sebe mikrobiálními kulturami. 10. Nedotýkejte se zbytečně rukama obličeje, nenanášejte v laboratoři kosmetiku, nemanipulujte s kontaktními čočkami. 11. Při barvení mikroorganizmů používejte jednorázové ochranné rukavice, pokud je to možné, pracujte v digestoři. Ochranné rukavice není nutné používat při manipulaci s mikroorganizmy, pokud se však budete cítit bezpečněji, použijte je. 12. Kahany nechávejte hořet pouze po dobu, kdy je užíváte. 13. Použité sklo a zbytky mikrobiálních kultur odkládejte na určená místa. V žádném případě nevylévejte kultury do odpadu! Veškerý kontaminovaný materiál je před likvidací a mytím nutno dezinfikovat nebo sterilizovat (týká se i rozbitého skla), případně vyhodit do koše na nebezpečný odpad (např. buničitá vata použitá k likvidaci rozlité kultury). 14. Dojde-li k náhodnému potřísnění pokožky mikrobiální kulturou či poranění pokožky, oznamte tuto skutečnost ihned vyučujícímu. Pokožku je nutno ošetřit vhodným dezinfekčním prostředkem (ajatin, Septoderm), aby nedošlo k infekci. 15. Stejné zásady jako v bodě 14 platí i v případě znečištění pracovní plochy nebo pracovního oděvu. 16. V případě jakékoli nejistoty se informujte o správném postupu u svého vyučujícího. 17. Označte všechna média a kultury ve zkumavkách, baňkách a Petriho miskách názvem média a kultury, svým jménem a pracovní skupinou. Misky popisujte na dno! K označení používejte popisovače na sklo. 18. Všechny pracovní postupy, obzvláště pak použité bakteriální kultury, množství pipetovaných roztoků a postupy při ředění si pečlivě zaznamenávejte. 19. Po ukončení práce odneste použité pomůcky na určené místo, ukliďte pracovní plochu a vydezinfikujte ji dezinfekčním roztokem. 20. Před odchodem ze cvičení si dobře umyjte ruce a vydezinfikujte dezinfekčním prostředkem. V případě, že potřebujete krátkou přestávku v průběhu cvičení, umyjte a vydezinfikujte si ruce před opuštěním laboratoře. Část I Obecná mikrobiologie 1 Příprava živných médií, kultivace mikroorganizmů, aseptická práce Cíl cvičení Příprava a sterilizace živných médií (agar na Petriho miskách, šikmý agar a bujón). Seznámení se se zásadami aseptické práce v laboratoři. Úvodní slovo Zásady přípravy mikrobiologických půd Nutno pracovat se sterilním nádobím ve sterilním prostředí, co nejrychleji na úkor objemové přesnosti (tzv. aseptická práce). Ožehávat hrdla baněk i zkumavek. Při práci nemluvit. Nádoby s již sterilním médiem otevírat co nejméně. Kultivace Kultivace mikrobů je základním postupem sloužícím k jejich přímému průkazu. Charakter růstu bakterie je důležitým identifikačním znakem; nevýhodou je doba kultivace (např. Mycobacterium tuberculosis roste 9 týdnů, většina bakterií pouze 24-48 hodin). Mikroorganizmy (bakterie, vláknité houby, kvasinky) se v mikrobiologických laboratořích kultivují na sterilních živných médiích, které splňují všechny požadavky na výživu a mají optimální pH, osmotické poměry a re-doxpotenciál. Samozřejmostí je dostatek vody pro životní pochody a přítomnost živin: zdroje energie (organotrof- organická látka; fototrof- světlo; litotrof- anorganická látka), uhlíku (hete-rotrof - organická látka; autotrof - CO2), dusíku (amonné ionty, dusičnanové ionty, aminokyseliny, bílkoviny nebo jejich částečné hydrolyzáty) a biogenních prvků (anorganické soli), přičemž hodnoty uvedených podmínek musí zůstat optimální po celou dobu kultivace. Živná média Dle složení lze média dělit do dvou základních skupin: média syntetická (definovaná) s přesně definovaným složením (ústojné roztoky, zdrojem uhlíku obvykle glukóza, zdrojem dusíku (NFÍ4)2S04 nebo NH4CI, čisté aminokyseliny, vitamíny a růstové faktory) a média přirozená (komplexní), které mají ve svém základu živný bujón a nejsou chemicky definované. Jsou tvořeny složkami získanými po kyselé hydrolýze kaseinu, želatiny nebo po enzymatické hydrolýze masa (pepsin, trypsin, pankreatin). Podle konzistence rozeznáváme média tekutá (mléko, masopeptonový bujón, cukrová média, sladina), polotekutá, ztužená a tuhá. Výhodou tekutých médií je snadný přístup vody a živin, mikroorganizmy v nich snáze rostou. Nevýhodou je růst mikroorganizmů projevující se zakalením, sedimentem nebo blankou (dle nároků na kyslík). V tekutém médiu nelze určit, zda se jedná o čistou kulturu nebo směs více druhů, rodů. Pro přípravu ztužených půd se k bujónovému základu přidává většinou agar (směs polysacharidu z mořských řas, není využíván jako zdroj živin), méně pak želatina (nižší teplota tání, okolo 35 °C) či křemičité gely. Výhodou kultivace na pevném médiu na Petriho misce je možnost pozorování izolovaných kolonií (klonů jedné buňky), tedy izolovaných kmenů. Kolonie bakteriálního druhu je taxonomicky významný makroskopický znak. Úvodní slovo 3 Média univerzální svým složením vyhovují požadavkům na výživu širokého spektra organizmů (např. masopeptonový bujón, sladinový agar). Média selektivní svým složením zvýhodňují růst jednoho druhu nebo cílové skupiny organizmů, růst ostatních druhů je inhibován (např. Ashbyho agar - bezdusíkaté médium, rostou na něm jen organizmy schopné fixace vzdušného dusíku). Selektivní média obsahují inhibiční složku nebo naopak některá základní složka chybí, což zvýhodňuje a cíleně izoluje prokazované rody a druhy. Média selektivně diagnostická svým složením potlačují růst většiny mikroorganizmů a umožňují růst jen velmi malé skupině. Charakteristický růst se projeví změnou barvy média či kolonií vlivem biochemické reakce mikroorganizmu (např. Endova půda). Příklady kultivačních půd Masopeptonový agar (MPA) obsahuje výtažek z masa, pepton, sůl a agar, bývá základem pro další média. Krevní agar (KA) připravuje se přidáním 5-10 % deribrinované zvířecí krve k vhodnému základu (např. MPA), nejvíce používaná půda, roste na ní většina bakterií, na KA lze odečítat hemolýzu, pokud bakterie tvoří hemolyziny - vznik úplného projasnění, u neúplné hemolýzy není projasnění úplné. Endova půda (Endoagar, EA) selektivně diagnostická půda pro střevní bakterie (čeleď Enterobacteriaceae), obsahuje laktózu. Indikátorem jejího kvašení je bazický fuchsin odbarvený siřičitanem sodným. Je-li laktóza kvašena, mění se barva světle rialovočervená do temné fialové vlivem změny pH. Bakterie, které kvasí laktózu, mají tmavě fialově zabarvené kolonie. Bakterie, které laktózu nezkvašují, mají kolonie růžové. XLD agar půda pro záchyt patogenních střevních bakterií (Salmonella), obsahuje laktózu. Laktózu kvasící bakterie jsou žluté. Lze rozpoznat tvorbu H2S - černý střed kolonií. Sabouraudova půda pro záchyt kvasinek a plísní, obsahuje glukózu nebo maltózu, pH 5,0. Fortnerova půda pro záchyt anaerobů (obsahuje redukující substance). Lowenstein-Jensenova půda pevná půda pro záchyt mykobakterií, obsahuje vaječnou emulzi, glycerin, škrob, malachitovou zeleň. Slanetz-Bartley agar (SB) selektivně diagnostická půda pro bakterie rodu Enterococcus, chudá na živiny (enterokoky jsou nenáročné oproti jiným bakteriím), kolonie enterokoků mají v masivním nárůstu fialovohnědou barvu. Wilson-Blairova půda selektivní půda pro salmonely (černě kovově lesklé kolonie s černým okolím). Claubergova půda diagnostická půda pro Corynebacterium diphtheriae (černé kolonie s kovovým leskem). Čokoládový agar obsahuje krev přidávanou do horkého základu pro krevní agar (80°C), slouží ke kultivaci náročných mikrobů. Mueller-Hinton agar využívá se pro testování citlivosti a rezistence k antibiotikům a pro primární izolaci neisserií. 4 Příprava živných médií, kultivace mikroorganizmů, aseptická práce Uchování médií Až na výjimky se média uchovávají v lednici tak, aby nevysychaly - dnem vzhůru a zabalené a to po stanovenou dobu exspirace. Čerstvá média nesmí mít před očkováním bakterií mokrý povrch - před začátkem práce se dávají na několik hodin sušit. Dezinfekce, sterilizace, dekontaminace Odstranění mikroorganizmů z prostředí (dekontaminace) může být zabezpečeno různými způsoby a tomu odpovídá též dosažený efekt. Prostý úklid, mytí, praní a žehlení snižuje výskyt mikroorganizmů až o 90 %. Tím se zvyšuje účinnost následně prováděné dezinfekce nebo sterilizace. Dezinfekce s použitím chemických látek nebo fyzikální je definována jako ničení či zneškodňování vegetativních buněk patogenních mikroorganizmů na neživých předmětech, ve vnějším prostředí (ve vodě, ve vzduchu apod.) a v infekčním materiálu. Cílem dezinfekce je učinit předměty (zevní prostředí) neinfekční. Účinnost dezinfekce je závislá na rezistenci mikroorganizmů vůči těmto prostředkům, které by měly mít baktericidní účinek na většinu patogenních mikroorganizmů. Antisepse je zneškodňování patogenních zárodků v prostředí živých tkání, v ranách, na sliznicích a na kůži s použitím antiseptik. Je namířena hlavně proti mikrobům vyvolávajícím hnisání. U antiseptik není striktní požadavek na baktericidní účinek jako u dezinfekčních prostředků, stačí bakteriosta-tické působení. Antiseptika musí splňovat požadavek nejedovatosti a dobré snášenlivosti živými tkáněmi. Na rozdíl od dezinfekčních prostředků proto podléhají schválení jako každý jiný zdravotnický prostředek. U antiseptik není nutná dobrá rozpustnost ve vodě. Asepse je souhrn opatření vedoucích ke stavu, kdy je v prostředí minimum mikroorganizmů. Asepse má zabránit přístupu mikroorganizmů k živým tkáním při chirurgických operacích používáním sterilních nástrojů, obvazových látek, šicího materiálu, pryžových rukavic, přípravou operačního pole, dezinfekcí chirurgových rukou, používáním ústenek apod. Pojem asepse zahrnuje také laboratorní a výrobní metody, u nichž je snaha zabránit mikrobiální kontaminaci např. u mikrobiologických laboratorních prací a při výrobě léků. Sterilizace je zničení všech živých mikroorganizmů, včetně vysoce rezistentních bakteriálních endospor fyzikálními nebo chemickými postupy. Sterilizace nasycenou vodní parou pod tlakem (v autoklávu) se provádí nejčastěji za přetlaku 100 kPa při teplotě 120 °C po dobu 15-30 minut. Tento způsob sterilizace umožňuje zničit bezpečně všechny formy mikroorganizmů. Autokláv je tlakový sterilizátor opatřený vodoznakem pro stav vody ve vyvíječi páry (pokud není přímo napojen na přívod páry z centrálního zdroje). Dále je vybaven pojistným ventilem, dvěma manometry (jeden k měření přetlaku páry ve vyvíječi, druhý v pracovním prostoru), odvzdušňovacím ventilem, vodní vývevou a teploměrem. Dokonalé odvzdušnení pracovního prostoru na začátku sterilizace je předpokladem úspěšné sterilizace (směs páry se vzduchem při 120°C a 30 minutové expozici nemá spolehlivý sterilizační efekt). V autoklávu lze sterilizovat různé roztoky, kovové laboratorní nástroje, pryžový materiál. Při sterilizaci bakteriologických půd je třeba dát pozor na možnost hydrolýzy disacharidů a poškození termolabilních látek. Seznam přístrojů a mikroorganizmů 5 Seznam přístrojů a mikroorganizmů • komerční masopeptonové médium (MPB - meat pepton broth) • agar, destilovaná voda • sterilní Petriho misky • skleněné biologické zkumavky, Erlenmeyerovy baňky • vatové zátky, odměrný válec, autokláv Postup • Práce probíhá ve dvojici. Popsat své zkumavky a misky zespodu. • Do Erlenmeyerovy baňky navážit 2,6 g masopeptonového bujónu. • Doplnit do 200 ml destilovanou vodou, důkladně rozmíchat a změřit pH (pH papírkem, případně upravit). • Pipetovat po 5 ml do dvou zkumavek, uzavřít vatovou či kovovou zátkou. Takto jsou zkumavky s bujónem připravené ke sterilizaci. • Ke zbytku roztoku média přidat 3,6 g agaru a promíchat. Médium zahřívat do rozvaření agaru (v autoklávu či mikrovlnné troubě), poté pipetovat opět do dvou zkumavek po 5 ml, uzavřít vatovou či kovovou zátkou. Zkumavky jsou připravené pro sterilizaci - šikmý agar. • Zbytek média v baňce uzavřít vatovou zátkou a společně se zkumavkami umístit do autoklávu. Sterilizace probíhá 20 min při tlaku 0,15 MPa a teplotě 121 °C. • Po sterilizaci v autoklávu je již médium sterilní, nutno dodržovat zásady aseptické práce (ožehávání hrdla baněk a zkumavek)! • Sterilní médium z baňky rozlévat do předem připravených sterilních Petriho misek. Do misky nalít zhruba 20 ml média, to odpovídá 4-5 mm média na výšku v misce. Misky otevírat co nejméně, při práci nemluvit (obr. 1A). Po utuhnutí misky obrátit dnem vzhůru. • Zkumavky se sterilním agarem ještě za tekutého stavu uložit do šikmé polohy a nechat utuhnout (obr. 1B). • Po několika dnech vyhodnotit, zda nedošlo ke kontaminaci. 6 Příprava živných médií, kultivace mikroorganizmů, aseptická práce Obr. 1: Příprava živných agarů (archiv autorek) Zhodnocení cvičení • Připravená média budou v příštím cvičení sloužit nejen k očkování, ale i k následnému makroskopickému pozorování kultur mikroorganizmů. Byly dodrženy zásady aseptické práce? • Došlo k nárůstu kontaminace? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Votava M., Kultivační půdy v lékařské mikrobiologii. 2000, Nakladatelství Hortus, Brno, ISBN 80-238-5058-X. Kontrolní otázky 1. Jak byla zajištěna sterilita práce? 2. Jakou výhodu má šikmý agar oproti agaru v Petriho misce? 3. Proč se charakter růstu kolonií hodnotí na Petriho misce a nikoli v bujónu? 4. Jak se od sebe liší syntetická média a přirozená? 5. Jmenujte příklady a složení ztužovadel kultivačních půd v mikrobiologii. Zajímavosti 7 6. Jaké pomůcky a postupy zaručují aseptickou práci ve cvičení? 7. Jakým způsobem je možné získat z bujónu ztuženou kultivační půdu? 8. Jaká je funkce kultivačních médií? 9. Jaký je rozdíl mezi antisepsí a aseptickou prací? 10. Inaktivují se pasterizací bakteriální endospory? 11. Co je to sterilizace; uveďte několik příkladů. 12. Uveďte několik příkladů pro zajištění aseptické práce na laboratorním stole mikrobiologického praktika bez flowboxu. 13. Čím je možné obohatit kultivační půdu? 14. Co znamená pojem dezinfekce? 15. Co znamená pojem sterilizace? Zajímavosti • Robert Koch zavedl kultivaci na extraktu zhovězího masa zpevněném želatinou. Kultivací na pevné půdě tak mohl zjistit počet druhů bakterií (dle vzhledu kolonie) a počet buněk ve vzorku (= počet kolonií) a získat čistou kulturu. • Walter Hesse na radu své manželky nahradil želatinu agarem. • Petriho misky byly v mikrobiologii zavedeny Richardem Petrim v roce 1887. • Masový výtažek je bohatý na růstové faktory, ale na živiny je poměrně chudý. Frederick Lôfier (spoluobjevitel původce záškrtu) vylepšil masový extrakt přídavkem peptonu (produkt enzymatického natrávení masa, obsahuje peptidy i volné aminokyseliny) a NaCl, tím vznikl živný bujón. • Komerční sušená kultivační média se používají od roku 1914. 2 Metody sterilní práce, očkování a uchovávání mikroorganizmů Cíl cvičení Naučit se zásady aseptické práce a dodržovat je při práci s mikroorganizmy. Zvládnutí techniky očkování mikroorganizmů (tekutá i tuhá média). Izolace jednotlivých kolonií pomocí křížového roztěru. Úvodní slovo Jako kultury označujeme mikroorganizmy kultivované v laboratorních podmínkách na živných médiích. Pracujeme-li s kulturou jednoho druhu, považujeme ji za kulturu čistou. Kultury smíšené jsou kultury několika druhů (např. izoláty z přirozeného prostředí, které je potřeba kultivací pro identifikaci oddělit = izolovat). Jako kultury technické se označují kultury používané pro výzkumné nebo provozní účely (v čistírnách odpadních vod, bakteriální filtry, bioreaktory). Technické kultury mohou být jak čisté (pivovarské kvasinky), tak smíšené (mléčné bakterie pro výrobu jogurtů). Kultury přenášíme (= přeočkováváme) na čerstvé médium z tekutého nebo z tuhého média za různými účely: přenesení do čerstvějšího média, oživení, očkování na diagnostické médium, izolace kultury, očkování pro odečet fyziologických a morfologických vlastností kultury. Charakter růstu a podmínky následné kultivace jednotlivých kultur se v laboratoři (optimální podmínky -čistá kultura, dostatek živin) vždy odlišují od růstu dané kultury v přirozeném prostředí. Růst v přirozeném prostředí doprovází kompetence o živiny, adaptace a neustálý boj s antibiotiky a me-tabolity současně přítomných dalších kmenů. Navíc je třeba si uvědomit, že mnoho bakteriálních druhů je nekultivovatelných. Izolace bakteriálního kmene Pro zisk čisté kultury jsou využívána selektivní média, na kterých vyroste pouze žádaný bakteriální taxon či skupina taxonů (druh, rod). Pro izolaci kmene na Petriho misce na selektivním nebo na neselektivním (univerzálním) médiu využíváme metodu křížového roztěru. Podle vzhledu vyrostlých kolonií lze odlišit různé morfologické typy a ty následně izolovat dalším křížovým roztěrem (odebráním buněk z dané kolonie). Křížový roztěr je metoda postupného zřeďování původní kultury za účelem zisku jednotlivých kolonií a odečtení jejich morfologie. Kolonie mikroorganizmů je ve své podstatě klon jedné buňky. Bakteriologická klička s přenášenou kulturou se po každém kroku očkování žíhá v plamenu, tím dojde k usmrcení buněk a při dalším tahu pak po agaru roztíráme pouze buňky setřené z následující oblasti křížového roztěru. Roztírá se stále menší množství buněk. V místě tzv. hádku (poslední oblast křížového roztěru) již vyrůstají jednotlivé kolonie, u kterých lze hodnotit charakteristický profil, vzhled, tvar, barvu, okraje. Kultivace Kultury v tekutém médiu můžeme kultivovat kontinuálně (např. větší objemy média s průmyslovými kmeny). Příkladem je chemostat, kdy je růstová rychlost kultury řízena koncentrací limitující živiny, která je přítokem nového média dodávána. Naočkujeme-li médium, do kterého již nejsou dodávány živiny, jedná se o kultivaci statickou. Statická kultivace může být submerzní (třepaná) nebo vzdušněná. Těmito procesy se promícháváním zvětšuje plocha fázového rozhraní a může probíhat efektivnější výměna plynů (např. prevzdušňovači rošty v bioreaktorech). Úvodní slovo 9 Vzhled kultury ovlivňuje použité médium, typ kultivace i stáří kultury. Stejný mikroorganizmus může na různých typech agarů vykazovat různé morfologické vlastnosti (pigmentace, velikost kolonií, atd.). Při práci s čistými kulturami, v našem případě z České sbírky mikroorganizmů, (), dodržujeme podmínky kultivace dle katalogu kultur - doporučené médium definovaného složení, teplota a podmínky kultivace. Pokud izolujeme kmeny z prostředí, snažíme se dodržet podmínky, které jsou pro ně v daném prostředí přirozené (koncentrace solí, živin, teplota, pH). Růstová křivka (obr. 2) je grafické vyjádření závislosti počtu buněk na délce statické kultivace a skládá se z několika fází: Lag fáze probíhá přizpůsobování a růst samotné buňky, aktivace vhodných enzymů, organizace metabolizmu. V činnosti jsou adaptivní enzymy, v buňce je přítomno mnoho RNA (zvýšená syntéza enzymů), řada ještě neadaptovaných buněk odumírá. Fáze fyziologického mládí (zrychleného růstu) bod mezi lag a log fází; všechny potřebné enzymy jsou připraveny a kultura vykazuje vysokou rychlost růstu. Log fáze (logaritmická, exponenciální) intenzivní růst buňky a metabolizmus, trvá, dokud není koncentrace živin limitující, všechny buňky se dělí konstantní maximální rychlostí. Z této části křivky se využívají parametry pro srovnávání experimentů. Buňky lze dobře charakterizovat, charakter růstu se odečítá vždy v log fázi (suchá a mokrá hmotnost buněk, nárůst metabolitů, stanovení váhy DNA, RNA). Fáze zpomaleného růstu snížení intenzity metabolizmu, hromadění metabolitů Fáze stacionární snížení rychlosti množení, počet nově vzniklých buněk se vyrovnává s počtem odumřelých, dochází k vyčerpání živin, délka života závisí na citlivosti k hladovění, mohou vznikat endospory Fáze odumírání médium je spotřebováno a buňka odbourává své zásobní látky, čelí kyselosti prostředí (ze svých zplodin), nestačí reparační systémy Obr. 2: Růstová křivka. Plná čára - celkový počet mikroorganizmů (mrtvých i živých); přerušovaná čára - počet živých mikroorganizmů (Greenwood a kol., 1999, upraveno) 10 Metody sterilní práce, očkování a uchovávání mikroorganizmů Diauxie je postupné využívání dvou substrátů. Nejdříve se využije jednoduchý zdroj, např. glukóza, a potom teprve složitější substrát, např. laktóza. Růstová křivka má v tom případě dva vrcholy. Teplota Podle optimální teploty kultivace rozlišujeme tři základní skupiny mikroorganizmů: psychrofilní s optimem růstu pod 20 °C (oceány, jeskyně, chladnička - např. pseudomonády, aeromonády, listerie); mezofilní s optimem růstu mezi 20 až 40 °C (většina bakteriálních druhů; parazitické mikroorganizmy); termofilní s optimem růstu nad 55 °C (extrémní termorilové rostou až kolem 100 *C). Vztah ke kyslíku Bakteriální druhy kultivované za přístupu vzduchu označujeme jako aerobní. Aerobní kultivace je zajištěna nátěrem a kultivací buněk na agaru na Petriho misce či ve zkumavce na agaru šikmém nebo v nízké vrstvě tekutého média (okolo 5 ml). Větší objemy tekutého média by již musely být syceny kyslíkem (aerace, submerzní kultivace). Některé střevní bakterie jsou příkladem fakultativních anaerobů, které jsou schopny růstu jak v aerobním, tak anaerobním prostředí. V prostředí s kyslíkem přepínají na energeticky výhodnější aerobní metabolizmus. V tekutém médiu se projevují růstem v celém jeho sloupci (zákal média). Anaerobní organizmy se vyskytují v prostředí s nulovou či nízkou koncentrací kyslíku, kyslík působí jako jed či inhibitor růstu. Stav anaerobiózy jako první definoval Louis Pasteur, který zavedl do mikrobiologie termíny pro aerobní a anaerobní organizmy. V závislosti na stupni tolerance vůči molekulárnímu kyslíku, lze anaerobní mikroorganizmy dělit na: striktně (obligátně) anaerobní mikroorganizmy -vyžadují úplnou absenci kyslíku, koncentrace více než 0,5 % na ně působí toxicky a odumírají; ae-rotolerantní mikroorganizmy - nevyužívají kyslík jako konečný akceptor elektronů, ale rostou v jeho nízkých koncentracích; mikroaerofilní mikroorganizmy - vyžadují určité nízké procento kyslíku, využívají ho jako konečný akceptor elektronů, ale nerostou za přítomnosti 21 % vzdušného kyslíku za normálního tlaku. Anaerobní nebo mikroaerofilní kultivace se provádí hlubokým vpichem do agaru nebo očkováním do vysoké vrstvy kapalného média. Je nutno snížit oxidoredukční potenciál přidáním redukujících látek (kyselina askorbová, thioglykolát, thiosíran) do média. Pokud anaerobní prostředí pro kultivaci vytváříme, využíváme tzv. anaerostatu a směsi chemikálií (železný prášek, kyseliny vinná, citrónová), která po ovlhčení uvolňuje vodík, který v přítomnosti katalyzátoru (Pt, Pd) reaguje s přítomným vzdušným kyslíkem za jeho vytěsnění a vzniku molekul vody. Uchování mikroorganizmů Typ uchovávání volíme podle jeho zamýšlené délky: • na Petriho misce při 4 °C, krátkodobě, nutno přeočkovávat (např. laktokoky po týdnu, bacily po 2-3 měsících) • na šikmém agaru při 4 °C, v řádu týdnů; v místnosti či termostatu při 25 °C v řádu dnů • ve zkumavce v agaru ve vpichu, po dobu několika měsíců • na porózních materiálech - želatínových discích, kuličkách, dlouhodobě • pod sterilním minerálním olejem (houby, bakterie) • lyofilizované (lyorilizace = sublimace vody ve vakuu), méně šetrná než kryoprezervace, všechny mikroorganizmy nelze lyorilizovat, např. houby; dochází ke snížení viability, lyofilizované kultury jsou připravené ihned k odeslání, snadná manipulace Úvodní slovo 11 • zmrazené na -70 °C (např. v kultivačním médiu s 15 % glycerolu) po malých objemech v hlubokomrazicím boxu, přežívání měsíce, roky • boxy s pevným CO2, suchý led (-78 °C) • kryogenní hlubokomrazící boxy (-150 °C) • kryoprezervace - zamražení kultur ve velmi nízkých teplotách, např. v tekutém dusíku (až -196°C) nebo v jiných plynech (He, Cr, H), uchovávání neomezeně dlouho. Nejvhodnější je postupné ochlazování (kontrolovaná rychlost zamražení: ideálně 1 °C/min. pro snížení osmotické disbalance a proti nevhodnému formování krystalů vody v buňce (amorfní led); některé odolné bakterie snesou rychlejší nebo okamžité zamražení - dle rigidity buňky). Vhodné je použít kryoprotektanty v ochranném médiu - dimethylsulfoxid, glycerol. Vlastnosti mikroorganizmů ve cvičení Escherichia coli (čeleď Enterobacteriaceae): gramnegativní rovné tyčky vyskytující se jednotlivě nebo po dvou. Pohyblivé pomocí peritrichálních bičíků nebo nepohyblivé, mezofilní, fakultativně anaerobní. Běžný komenzál tlustého střeva, pomáhá udržovat rovnováhu mikroflóry, působí proti patogenům střeva, syntetizuje vitaminy A, B, K. Pokud se dostane mimo střevo, může působit jako patogen. Fekálním znečištěním se dostává do vody, kde může přežít řadu týdnů - nejběžnější indikátor fekální kontaminace pitné vody. Slouží jako model genového inženýrství (sekvenace celého genomu), producent různých látek (např. inzulín). Patogenní kmeny E. coli jsou charakterizovány a identifikovány sérologicky (somatické, kapsulární, bičíkové antigény) i biochemicky: enterotoxigenní E. coli (ETEC) - cestovatelské průjmy, endemický výskyt v teplých oblastech; enteropatogenní E. coli (EPEC) - průjmy novorozenců, alterace epitelu střeva; enteroinvazivní E. coli (EIEC); enterohemoragická E. coli (EHEC) - způsobuje hemoragie (krvácení do orgánů trávicího traktu). Serratia marcescens (čeleď Enterobacteriaceae): gramnegativní rovné tyčky, fakultativně anaerobní, mezofilní, tvorba červeného pigmentu. Výskyt v půdě, vodě, na rostlinných površích, ale i oportunní patogen člověka - častý původce nozokomiálních infekcí močového a dýchacího traktu. Může být součástí zubního povlaku (pigmentace zubu), je původcem růžového povlaku ve vlhkém prostředí koupelen. Pseudomonas (čeleď Pseudomonadaceae): gramnegativní rovné nebo nepatrně zakřivené tyčky, schopnost pohybu jedním nebo více polárními bičíky. Optimální kultivační teplota je 25-30 °C, aerobní. Tvorba fenazinových exopigmentů pyocyaninu a fluorescinu (pyoveridinu), které způsobují modrozelené a žluté až žlutozelené zabarvení kultury i kultivačního média. Výskyt v prostředí, ve zkažené potravě (vajíčka, ryby, mléko), častá izolace z klinických vzorků. Významné lidské, zvířecí i rostlinné patogeny, původci nozokomiálních infekcí; faktorem virulence je tvorba biofilmu s vysokým stupněm rezistence na povrchu tkání nebo předmětů díky tvorbě polysacharidu alginátu (P. aerugi-nosa nebo P. fluorescens), který tvoří matrix biofilmu a chrání buňky vůči působení dezinfekčních látek, protilátek a antibiotik. Akumuluje poly-/3-hydroxybutyrát. Díky širokému spektru metabolických drah se podílí na geochemických cyklech, biodegradacích a významně se uplatňuje při bioremediacích (např. degradace toluenu) nebo jako biokontrolní agens. P. putida - bioremediace; P. fluorescens - produkce fluoresceinu 12 Metody sterilní práce, očkování a uchovávání mikroorganizmů Kocúria rosea (čeleď Micrococcaceae): grampozitivní koky uspořádané po dvou, ve čtveřicích či shlucích. Aerobní, mezorilní, tvoří růžové a červené pigmenty. Výskyt v půdě, vodě, prachu, na kůži savců. Rod byl pojmenován na počest významného brněnského mikrobiológa doc. RNDr. Miloše Kocura, CSc. Micrococcus luteus (čeleď Micrococcaceae): grampozitivní koky uspořádané po dvou, ve čtveřicích či shlucích, aerobní. Výskyt na pokožce savců, v potravinách, půdě, vzduchu a vodě. Produkce žlutého pigmentu. Staphylococcus aureus (čeleď Staphylococcaceae): grampozitivní koky vyskytující se jednotlivě, po dvou nebo v nepravidelných shlucích. Kolonie mohou být bílé nebo nažloutlé. Výskyt na kůži a sliznicích teplokrevných obratlovců, v potravinách a v prostředí. Některé druhy jsou patogenní a produkují toxiny. Bacillus (čeleď Bacillaceae): grampozitivní rovné tyčky, často ve dvojici či v řetízcích, pohyblivé, aerobní či fakultativně anaerobní. Výskyt v půdě, vodě, potravinách (rýže). Několik druhů rodu jsou patogeny člověka ěi hmyzu. Produkce toxinů {otravy z jídla, gastroenteritidy). Tvoří oválné či kulaté endo-spory, které jsou v buňce uloženy terminálne, subterminálně, paracentrálně či centrálně a které se mohou využívat jako biopesticidy (B. thuringiensis). Tvar, velikost a uložení spory je charakteristický znak pro identifikaci. • B. cereus - prostředí, způsobuje gastroenteritidy, alimentární intoxikace • B. subtilis - prostředí, izolován při potravinových otravách • B. mycoides - prostředí, rhizoidní růst • B. sphaericus - půda i vodní sedimenty, potraviny • B. thuringiensis - patogenní pro hmyz, produkce toxinů (parasporální tělísko) Saccharomyces cerevisiae patří mezi eukaryotní mikroorganizmy. Mezorilní, fakultativně anaerobní kvasinka. Buňka vejco-vitého tvaru je výrazně větší než buňky bakterií. Buněčná stěna neobsahuje peptidoglykan. Výskyt v prostředí a v průmyslových provozech. První osekvenovaný eukaryotický organizmus. Výroba potravin (pivo, víno, pečivo), produkce různých látek (např. inzulín, rekombinantní vakcína HBsAg), modelový organizmus. Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Bakteriologické plotny s MPA (MEA v případě S. cerevisiae) • Zkumavky se šikmým agarem MPA (MEA v případě S. cerevisiae) • Zkumavky s tekutým médiem MPB (MEB v případě S. cerevisiae) • Očkovací kličky, očkovací jehly, termostat, kahan Postup 13 Mikroorganizmy • Escherichia coli CCM 3954 • Pseudomonas putida, • P. fluorescens CCM 2115T • Serratia marcescens CCM 303 • Kocúria rosea CCM 839 • Micrococcus luteus CCM 169 • Bacillus cereus CCM 2010 • Staphylococcus aureus SA 812 • Saccharomyces cerevisiae Postup Do kultury ani média nesmí vniknout cizí mikroorganizmy ze vzduchu, z pomůcek, vlastní mikroflóry, dodržujeme zásady aseptické práce. Pracujeme co nejrychleji v zavřené místnosti, omytýma rukama a na dezinfikovaném stole, blízko plamene kahanu. Hrdla nádob i zátek před a po práci ožehneme plamenem. Zátky nikdy nepokládáme, ale držíme mezi malíčkem a prsteníčkem (obr. 3). Nádoby s kulturou necháváme otevřené jen po nezbytně dlouhou dobu a s hrdlem poblíž plamene. Obr. 3: Aseptická práce při očkování mikroorganizmů (archiv autorek) 14 Metody sterilní práce, očkování a uchovávání mikroorganizmů Ve cvičení kultivujeme mikroorganizmy staticky, aerobní kultivací na agarech (misky a šikmé agary) a v tekutém médiu ve zkumavkách. Kmeny jsou kultivovány na doporučených médiích v termostatu při optimální teplotě růstu dané kultury. Kultury na Petriho miskách kultivujeme vždy dnem vzhůru z důvodu udržení vlhkosti média a zabránění tvorby kondenzní vody na víčku, která by jinak skapávala na povrch média. Došlo by ke smíchání kultury na misce. Médium zároveň pomaleji vysychá. Ve cvičení každý pracuje samostatně. Všechny zkumavky i Petriho misky popsat permanentním popisovačem na sklo (druh, datum, označení skupiny, iniciály) vždy před začátkem očkovacích prací. Každý student očkuje: • 1 kmen do tekutého média • 1 kmen na šikmý agar • dva nebo čtyři různé kmeny na 1 misku do 2 nebo 4 „hádků" • 1 až 3 kmeny na Petriho misku křížovým roztěrem • směs dvou kmenů na Petriho misku křížovým roztěrem - cílem je izolace 2 typů kolonií (vhodné je naočkovat směs dvou různě pigmentovaných kmenů či grampozitivní a gramne-gativní kulturu) Očkování kultur na šikmý agar • Vyžíhat bakteriologickou kličkou a nechat vychladnout. • Do levé ruky uchopit obě zkumavky se šikmým agarem, malíčkem pravé ruky vytáhnout zátku ze zkumavky s kulturou (obr. 3). • Hrdlo zkumavky ožehnout • Sterilní (ožehnutou a vychladlou) kličku vsunout do zkumavky s kulturou, nabrat nárůst do očka kličky. Kličku vytáhnout, ožehnout hrdlo zkumavky i zátku a zkumavku zazátkovat. • Malíčkem pravé ruky vytáhnout zátku ze sterilní zkumavky s čistým šikmým agarem, ožehnout hrdlo zkumavky a kličkou naočkovat na šikmý agar tzv. hádka. • Ožehnout hrdlo zkumavky i zátku, uzavřít zkumavku a vyžíhat kličku. Očkování kultur na Petriho misku do sektorů tzv. hádkem • Zespodu rozdělit misku popisovačem na sektory a označit. • Ze zkumavky s kulturou odebrat nárůst na bakteriologickou kličku výše uvedeným postupem. • Mírně odklopit víčko Petriho misky a nanést kulturu na příslušný sektor agaru tažením kličky, tzv. hádek (obr. 4). • Přiklopit víčko a vyžíhat kličku. Postup 15 A Obr. 4: Nákres očkování na Petriho misku tzv. hádkem (A, B) a praktická ukázka, K. rosea a P. putida (C) (archiv autorek) Očkování kultur na Petriho misku — křížový roztěr (obr. 5) • Ze zkumavky s kulturou odebrat nárůst na bakteriologickou kličku výše uvedeným postupem. • Mírně odklopit víčko Petriho misky a nanést kulturu na agar tažením kličky po agaru v několika pruzích (1). • Vyžíhat kličku, nechat vychladnout a několika tahy kličkou rozetřít kulturu v koncové části nanesené kultury (2). • Vyžíhat kličku, nechat vychladnout a několika tahy kličkou rozetřít kulturu v koncové části nanesené kultury (3). • Vyžíhat kličku, nechat vychladnout a plynulým tahem, tzv. hádkem, rozetřít naředěnou kulturu (4). V místě tzv. hádka by měly vyrůst jednotlivé kolonie (5) Očkování do tekutého média • Kulturu odebrat z tuhého média kličkou (z Petriho misek odebrat jednu kolonii). • Zkumavku s tekutým médiem uchopit do levé ruky, malíkem pravé ruky vytáhnout zátku a ožehnout hrdlo zkumavky. Žíhání klitky (2) Obr. 5: Křížový roztěr (archiv autorek) 16 Metody sterilní práce, očkování a uchovávání mikroorganizmů • Odebraný vzorek rozetřít po stěně zkumavky nad hladinou média a postupně buňky převádět do jeho objemu. • Ožehnout hrdlo zkumavky i zátku, uzavřít a vyžíhat kličku. Očkování kultur z tekutého do tekutého média • Uchopit sterilní pipetu do pravé ruky (skleněnou nebo automatickou), malíkem vytáhnout zátku z baňky/zkumavky, hrdlo ožehnout a pipetou odebrat požadovaný objem kultury. Ožehnout zátku a uzavřít baňku. • Malíkem pravé ruky vytáhnout zátku z baňky/zkumavky se sterilním tekutým médiem a ožehnout hrdlo. • Vypustit kulturu z pipety do sterilního média, ožehnout zátku i hrdlo, baňku/zkumavku uzavřít a mírně protřepat. Očkování z tekutého média na Petriho misku • Uchopit sterilní pipetu do pravé ruky (skleněnou nebo automatickou), malíkem vytáhnout zátku z baňky nebo zkumavky, hrdlo ožehnout a pipetou odebrat požadovaný objem kultury (obvykle 100 ul). Ožehnout zátku a uzavřít baňku. • Daný objem vypustit do středu Petriho misky s agarem. • Sterilní hokejkou (též L kličkou) kulturu rozetřít po povrchu misky, ihned přiklopit víčko misky a chvíli nechat kulturu vsáknout do agaru. Kultivace • Kultivace probíhá při 30 či 37 °C po dobu 24-48 hodin. Zhodnocení cvičení • Prokázala se sterilita práce při přípravě médií v minulém cvičení? • Do jakých typů médií a jakým způsobem byly kmeny očkovány? • Co je účelem křížového roztěru? • Při jaké teplotě budou kmeny kultivovány? • Jak odvodíme správné podmínky kultivace? • Závisí morfologie kolonií na podmínkách kultivace? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Miniatlas mikroorganizmů (http://sci.muni.cz/mikrob/Miniatlas/mikr.htm) • Greenwood D., Slack R. C. B., Peuthere a kol., Lékařská mikrobiologie. GRADA Publishing, 1999, ISBN 80-7169-365-0. Kontrolní otázky 17 • Němec M., Matoulková D., Základy obecné mikrobiologie, Masarykova univerzita, Brno, 2015, ISBN 978-80-210-7923-6. • Sedláček L, Taxonomie prokaryot, Masarykova univerzita, Brno, 2007, ISBN 80-210-4207-9. Kontrolní otázky 1. K čemu slouží kultivace kultury na misce a k čemu kultivace na šikmém agaru? 2. Jaké jsou základní fáze růstové křivky? Sledujeme jednu buňku nebo celou populaci? 3. Je možno posuzovat čistotu kultury v tekutém médiu? Pokud ne, jak by se při posouzení přítomnosti jediné bakteriální kultury dokázalo? 4. Proč se kultury mikroorganizmů přeočkovávají? 5. Co ovlivňuje morfologii bakteriální kolonie? 6. Poroste fakultativní anaerob za přístupu kyslíku? Pokud ano, proč tomu tak je? 7. Jakými prostředky a podmínkami kultivace můžeme vyselektovat určité skupiny bakterií? 8. Jak ověříme „čistotu" kmene kultivací? 9. Co znamená a jak se provádí izolace bakteriálního kmene? 10. Jaký je princip křížového roztěru? 11. Co způsobilo, že na misce křížového roztěru kultura vůbec nevyrostla? 12. Co zajišťuje aseptickou práci při preočkovaní kultury? 13. Co způsobilo, že v poslední části křížového roztěru nevyrůstají izolované bakteriální kolonie, ale „souvislý hádek"? 14. K čemu slouží selektivní média? 15. Jak rozdělujeme mikroorganizmy podle vztahu ke kyslíku a do jakých skupin podle teplotního optima? 16. K čemu slouží očkovací klička a k čemu L-klička (= hokejka)? 17. Porovnejte kultivaci statickou a kontinuální z hlediska dostupnosti živin a hromadění meta-bolitů. 18. Která fáze růstové křivky a proč se nejvíce hodí pro odečet parametrů růstu kultury? 19. Jaký je rozdíl mezi obligátním a fakultativním anaerobem co se týče tolerance ke kyslíku? 20. Co je to smíšená bakteriální kultura? 21. Co je to čistá bakteriální kultura? 22. Jaký je rozdíl mezi termofilem a termotolerantním mezofilem co se týče citlivosti k teplotě? 23. Jaké jsou metody očkování mikroorganizmů, které pomůcky pro něj můžeme použít? 3 Mikroorganizmy kolem nás Cíl cvičení Cílem je prokázat, kde se v prostředí, potravinách či na lidském těle vyskytují mikroorganizmy. Úvodní slovo Mikroflóra je souhrn všech mikroorganizmů vyskytujících se v definovaném prostoru přírodního prostředí, např. vodní nádrž, potraviny, tělo člověka. Mikroflóra zahrnuje viry, bakterie, kvasinky a vláknité houby (plísně). Pokud se berou v potaz pouze bakterie, hovoří se o bakteriální mikroflóre. Každé prostředí má svoji typickou autochtónni mikroflóru, tzn. přirozeně se vyskytující mikroorganizmy. Např. pro jogurty je typická přirozená mikroflóra Lactobacillus delbrueckii a Streptococcus salivarius; pro sýry s plísněmi to je Penicillium roquefortii nebo P. camemberti; pro pivo kvasinky Saccharomyces cerevisiae nebo S. pastorianus. Fyziologická mikroflóra těla je přirozená mikroflóra vyskytující se na povrchu těla člověka či zvířat nebo uvnitř jejich orgánů. Dělí se na dvě skupiny. Rezidentní mikroflóra jsou mikroorganizmy, které osídlují lidské tělo a nezpůsobují mu onemocnění ani škodu či újmu. Mikroflóra tranzientní zahrnuje mikroorganizmy, které se dočasně nacházejí v určité oblasti makroorganizmu (ústní dutina po konzumaci potravin, kůže) a které mohou být i patogenní. Přirozená mikroflóra účinně chrání před osídlením choroboplodnými mikroby z vnějšku a jejich rozmnožením, účastní se antigenní stimulace tvorby protilátek, zejména imunoglobulinů třídy IgA. Pro vymezení přirozené mikroflóry neexistuje přesná hranice - mikroby, které jsou u někoho přirozené, mohou u jiného vyvolat onemocnění. Mikroorganizmy jsou využívány po staletí, protože jejich činnost je schopna zastavit růst nežádoucích mikroorganizmů v potravinách a tím se prodlužuje skladovatelnost potravin (mléčné kvašení zelí, okurek, výroba sýrů, mléčné a ovocné kvašené nápoje). Rody Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus (bakterie mléčného kvašení) jsou široce využívané v mlékárenském průmyslu pro výrobu másla, jogurtů, sýrů a uzenářských výrobků, zakysání smetany, atd. Kvasinky Saccharomyces cerevisiae se využívají pro výrobu svrchně kvašených piv (Ale, pšeničné pivo, stout, porter) a vína. Pro výrobu spodně kvašených piv typu ležák se používá kvasinka S. pastorianus schopná kvasit za nižších teplot. MRS médium - agar pro laktobacily podle DeMana, Rogosiho a Sharpeho s octanem sodným, který potlačuje růst dalších bakterií (kromě některých mléčných bakterií, např. Leuconostoc, Pediococcus). Seznam přístrojů a mikroorganizmů • Živná média na miskách - MPA, MRS, sladinový agar • Sterilní vatové tyčinky, pipety, hokejky • Destilovaná voda Postup 19 Postup Stery z prostředí a z těla (obr. 6) • Sterilní vatovou tyčinku namočit do sterilní destilované vody. • Setřít plochu předmětu (ústa, klika, mobilní telefon, klíče, boty, pokožka, hodinky, atd.) • Tamponem potřít médium v misce. • Kultivace probíhá při 30 °C po dobu 24-48 hodin. • Krátce přiložit daný předmět či část těla (prst, mince) na misku. • Kultivace probíhá při 35 °C po dobu 24-48 hodin. Otisk z prostředí a z těla Obr. 6: Stěr či otisk mikroflóry: z paty (A), prstů na noze (B), prstů na ruce před umytím (C), prstů na ruce po umytí (D), rtů (E), podpaží (F), rtů a nosu (G), ucha (H), úst (I) a mobilu (K) (archiv autorek) Spad z ovzduší • Misku s MPA nechat otevřenou na stole (roh místnosti, u okna) po dobu min. 30 minut. • Kultivace probíhá při 30 °C po dobu 24-48 hodin. Očkování piva (neředěné, nefiltrované) • 0,3 ml neředěného vzorku pipetovat na sladinový agar a rovnoměrně rozetřít hokejkou. • Kultivace probíhá při 30 °C po dobu 24-48 hodin. Očkování jogurtu, kefíru, nepasterizovaného mléka • 0,3 ml neředěného vzorku pipetovat na MRS agar a rovnoměrně rozetřít hokejkou. • Kultivace probíhá při 30 °C po dobu 24-48 hodin. 20 Mikroorganizmy kolem nás Zhodnocení cvičení • Došlo k nárůstu na miskách? Které části těla vykazovaly největší druhovou diverzitu? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Klaban V., Ilustrovaný mikrobiologický slovník, Galén, Praha, 2005, ISBN 80-7262-341-9. • Nester E. W., Roberts C. E., Pearsall N. N., Anderson D. G., Nester M. T., Microbiology, A human perspective, WBC/McGraw-Hill, 1998, ISBN 978-0073522593. • Silhánková L., Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology, Academia, 2002, ISBN 80-200-1024-6. Kontrolní otázky 1. Které části těla jsou nejvíce osídleny a proč? 2. Jaké druhy mikroorganizmů se nejčastěji vyskytují na pokožce? 3. Co je to přechodná mikroflóra? 4. Je mikroflóra lidského těla škodlivá? 5. Vyjmenuj některé rody bakterií mléčného kvašení 6. Proč se pro výrobu spodně kvašených piv typu ležák jiný druh kvasinky? 4 Úvod pro práci s mikroskopem Cíl cvičení Cílem je seznámit se s mikroskopem a s různými mikroskopickými technikami. Úvodní slovo Lupa vytváří přímý obraz zvětšený 10-15x. Lupa je dvojvypuklá či ploskovypuklá čočka. Předmět, který pozorujeme lupou, klademe do vzdálenosti menší, než je ohnisková vzdálenost. Slouží pro pozorování makroskopických znaků kolonií. Mikroskop (obr. 7) se skládá z mechanické části (podstavec, stojan a stolek s křížovým posunem), osvětlovací části (zdroj světla, kondenzor, clona) a optické části (objektivy a okuláry). Objektiv je soustava čoček s velmi krátkou ohniskovou vzdáleností, která vytváří skutečný převrácený obraz objektu, jež se promítá mezi ohnisko okuláru a okulár. Okulárem tento obraz pozorujeme jako pod lupou a vidíme neskutečný zvětšený obraz. Okular (pevné ivétsení 10x5 Slupnice vzdálenosti aKulárů Kroužek dioptrická korekce Revolverový nosič objektivů Objektiv Držák preparátu Přepravní poj islka* Páčka apertumí clony Centrovací Šrouby kondenzoru Kondenzor Objímka pro filtry (o průměru 45 mm) Kroužek polní clony Upevňovací Šroub tubusu (použijte Šroubovák dodávaný s mikroskooerry Kolečko zarážky pro zaostřování / Stativ CX31RBSF Fřepravní pojistka* ■ Hlavní vypínač Kolečko imikrooosuw Kolečko makroposuvu Kolečko posuvu v ose X Kolečko posuvu v os* v Obr. 7: Části mikroskopu (zdroj: Návod k obsluze Olympus CX31) Pro mikroskopii lze využít jakékoli vlnění s vlnovou délkou kratší, než jsou rozměry objektu. Rozlišujeme mikroskopii optickou (zobrazení struktur lišících se vzájemně absorpcí viditelného 22 Uvod pro práci s mikroskopem světla), elektronovou a akustickou. Optická (světelná) mikroskopie Suchý objektiv paprsek vystupující z preparátu pod úhlem a se na rozhraní mezi krycím sklíčkem a vzduchem láme od kolmice a nemůže se již podílet na tvorbě obrazu. Imerzní objektiv paprsek přecházející ze skla do imerzního prostředí svůj směr nemění a může se podílet na tvorbě obrazu, na vzniku obrazu se podílí více paprsků (obr. 8). Imerzní prostředí kapalina o stejném indexu lomu (n) jako krycí sklíčko, často cedrový olej (n = 1,52). Obr. 8: Průchod paprsků suchým a olejovým imerzním objektivem (Prescott, 2013, upraveno) Vznik obrazu Podstatou tvorby ostrého obrazu čočkou jsou světelné paprsky šířící se z určitého bodu předmětu různými směry a dopadající na čočku, v obrazové rovině se sbíhají opět do jednoho bodu a skládají tak ostrý obraz předmětu. Vzhled obrazu u konvexních čoček závisí na vzdálenosti předmětu od čočky. Pokud je předmět vzdálený více než dvojnásobek ohniskové vzdálenosti, vzniká skutečný zmenšený a převrácený obraz (fotoaparát). Pokud leží předmět mezi dvojnásobkem ohniskové vzdálenosti a ohniskem, je vzniklý obraz převrácený, skutečný a zvětšený (objektiv mikroskopu). Pokud je předmět mezi ohniskem a čočkou, je vzniklý obraz zvětšený a neskutečný (lupa, okulár mikroskopu). Zvětšení čočky roste se zkracující se ohniskovou vzdáleností. Fyzikální podstata vzniku obrazu v optickém mikroskopu Ernst Abbe podal vysvětlení, které se opírá o Huygensův princip - každý bod osvětleného objektu se stává zdrojem sekundárních sférických vln. Zaostřená rovina preparátu je takovým objektem. Podle optických vlastností jednotlivých bodů objektu se dopadající světlo v každém z bodů transformuje (ohýbá se, láme, mění se jeho amplituda, fáze) a vznikají sekundární vlny. Ty spolu interferují, jako po průchodu světla štěrbinou nebo optickou mřížkou. Výsledné vlnění, které obsahuje informaci o vzhledu objektu, vstupuje do objektivu. V jednotlivých bodech zadní ohniskové roviny objektivu se setkávají sekundární vlny, které opustily rovinu předmětu rovnoběžně. Dochází k jejich interferenci a v souladu s Huygensovým principem se stávají zdrojem nových vln, které v obrazové rovině mikroskopu skládají zvětšený a převrácený obraz. Základní pojmy v mikroskopii jsou zvětšení (násobek zvětšení objektivu a okuláru), kontrast a rozlišení. Úvodní slovo 23 Rozlišovací schopnost je vzdálenost dvou bodů, které mikroskop zobrazí jako dva samostatné body. Maximální rozlišovací schopnost světelného mikroskopu je 0,2 mm. Je dána zářením, kterým objekt osvětlujeme, a vlastnostmi objektivu. Okulár pouze zvětšuje obraz tvořený objektivem. Obecně platí, že není možné rozlišit body bližší než polovina vlnové délky záření, u světla je to zhruba 250 nm. Rozlišovací schopnost u mikroskopu je dále omezena množstvím světelných paprsků, které mohou vstoupit do objektivu (světelnost objektivu). Abbého zákon 0.61 • A a = -;- n ■ sin a A - vlnová délka světla, n - index lomu prostředí před objektivem, a - polovina otvorového úhlu kužele paprsků, které mohou vstoupit do objektivu n a a jsou pro daný objektiv konstanty a celý jmenovatel ve vzorci (n • sin a) se označuje jako numerická apertura objektivu (NA). Je to jedna ze základních charakteristik objektivu a její hodnota je na objektivu uvedena. Numerická apertura nej kvalitnějších imerzních objektivuje 1,3-1,4, pro suché objektivy pak max. 1. Pro nejkratší vlnové délky (400 nm) se rozlišovací schopnost mikroskopů blíží hodnotě 0,17 um. Rozlišovací schopnost mikroskopu lze zvýšit snížením A -použití modrého světla (modrý filtr), proudu elektronů (elektronová mikroskopie) nebo zvyšováním n - použití imerzního oleje, vody. Přidáním imerzního oleje, který má vyšší index lomu než vzduch, mezi preparát a objektiv se předchází ztrátám světla, které se láme na rozhraní preparát/prostředí. Do objektivu dopadne větší množství paprsků. Metody zvyšující kontrast zobrazení ve světelném mikroskopu jsou: Zástin clona zachycuje paprsky procházející přímo do objektivu. Objekty jsou osvětleny z boku a my pozorujeme pouze světlo, které se na nich láme nebo odráží. Podobného efektu dosáhneme tím, že na zdroj světla položíme minci. Fázový kontrast (obr. 9) slouží k pozorování nativního preparátu (živé nebarvené nefixované buňky). Na kondenzor se umístí maska s kruhovou štěrbinou, kterou proniká světlo do objektu. V objektivu, v místě obrazu kondenzorové masky, je umístěna fázová maska (označení objektivu Ph). V místě štěrbiny u kondenzorové masky je u fázové masky napařena polopropustná vrstva kovu, který mění fázi světla o čtvrtinu vlnové délky. Díky tomuto uspořádání prochází nedifraktované (neohnuté) záření ze zdroje částí fázové masky, která mění fázi světla. Ostatní vlnění, které se na objektu ohnulo nebo zlomilo, projde beze změny. Tato technika převádí rozdíly v posunu fáze světla procházejícího různými části objektu, které nevidíme, na rozdíly v intenzitě světla, které můžeme pozorovat. Lze pozorovat tvar buněk, pohyb. „Husté" části buňky s vysokým indexem lomu jsou zářivé. Toho se využívá při pozorování endospor vně i uvnitř buněk, pokud je buňka tvoří. Pro fázový kontrast je charakteristický tzv. „haló" efekt (zářivá korona) kolem buněk. 24 Uvod pro práci s mikroskopem Obr. 9: Fázový kontrast. Bacillus cereus (A), haló efekt kolem buněk a zářící endospory; Sporo-sarcina ureae (B), z balíčku jsou vidět pouze horní 4 buňky tvořící endospory (archiv autorek) Nomarského diferenciální interferenční kontrast pracuje se dvěma koherentními (interference schopnými) paprsky, jeden prochází objektem, druhý mimo objekt. Hranol dělí původně lineárně polarizované světlo na dvě vzájemně kolmo polarizované složky. Polarizátor srovnává vlny, jež jsou v různých rovinách. Nomarského destička v kondenzoru je hranol, jež zpracovává polarizované světlo tak, že na preparát jdou dva paprsky souběžně vedle sebe. V analyzátoru vidíme 3D obraz v závislosti na různém indexu lomu různých částí buňky. Zvýrazněním i malých rozdílů vznikne plastický obraz povrchu buňky (obr. 10). m f kf T 1 r Obr. 10: Nomarského kontrast, Bacillus cereus (archiv autorek) Postup 25 Postup • Zapnout zdroj světla a na stolek vsunout preparát. • Regulátor světla a kondenzor není potřeba nastavovat. • Objekt hledat pomocí makroposuvu a doostřit mikroposuvem. • Postupně zvyšovat zvětšení výměnou objektivů na revolveru, objektiv nesmí narazit na sklíčko preparátu! • Objektivy na revolveru jsou obvykle parfokální (zaostřeny na přibližně stejnou vzdálenost), po výměně objektivu není třeba objekt znovu hledat, ale stačí doostřit mikroposuvem. • Revolverový měnič objektivů slouží pro výběr vhodného objektivu. • Objektivy označené Ph slouží pro pozorování preparátů při fázovém kontrastu. • Pro objektivy s černým a bílým pruhem (objektiv lOOx) je vždy nutné použít imerzní olej! Pro objektivy zvětšení lOx, 20x a 40x se imerzní olej nepoužívá! • Při použití imerzního oleje je objektiv nezbytné po skončení pozorování vyčistit směsí etanolu a etheru! Použití imerzního oleje • Zaostřit objekt největším neimerzním objektivem (nejčastěji 40x). • Otočit revolver do polohy mezi tento a imerzní objektiv a na místo preparátu, které pozorujeme, kápnout kapku imerzního oleje. • Otočit revolver na imerzní objektiv, který se musí ponořit do oleje a doostřit mikroposuvem. • Pokud objekt není vidět, je třeba přiblížit objektiv k preparátu, nesmí do něj narazit. Zboku sledovat objektiv a stolek s preparátem. • Následně je třeba pomalu pohybovat objektivem směrem od preparátu a pozorovat, dokud není vidět preparát v okulárech. Pokud stále není nic vidět, ostření opakujeme. Zhodnocení cvičení • Podařilo se zaostřit na preparát? Byl patrný rozdíl při pozorování vzorku v jasném poli, fázovém a Nomarského kontrastu? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Matis D., Mikroskopická technika. ISBN: 80-968522-0-5, 2001. • Plášek J., Nové metody optické mikroskopie. Pokroky matematiky, fyziky a astronomie, 1996, 41: 1-24. • Harley J., Laboratory exercises in mikrobiology, 2013, ISBN-10: 0077510550. 26 Uvod pro práci s mikroskopem • Hrazdíra L, Mornstein V., Lékařská biofyzika a přístrojová technika, Neptun, Brno, 2004, ISBN-10: 80-902896-1-4. • Virtuální mikroskopování http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/virtual/virtual.html, 18. 2. 2017 • Vlnová optika http://www.sweb.cz/radek.jandora/fll.htm • Davidson M., W., Abramowitz M., Optical microscopy, dostupné z https://cw.fel.cvut.cz/ wiki/_media/courses/a6m33zsl/davidson-abramowitz-optical_microscopy.pdf (18. 2. 2017) Kontrolní otázky 1. K čemu slouží makro- a mikroposuv? 2. Proč se nesmí po použití imerzního oleje znovu použít neimerzní objektiv? 3. K čemu slouží imerzní olej? 4. Co je podstatou fázového kontrastu? 5 Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení Cíl cvičení Zjištění morfologie mikrobiálních kultur - makroskopicky. Gramovo barvení. Pozorování a hodnocení mikroskopických preparátů. Úvodní slovo Morfologické a cytologické znaky pomáhají identifikaci, jejich pomocí se provádí kontrola kontaminace kultury a může se posoudit fyziologický stav kultury. Makroskopické a mikroskopické znaky se hodnotí vždy současně. Makroskopické znaky V tekutých půdách makroskopické znaky nelze hodnotit. Při růstu v tekutém médiu lze hodnotit charakter růstu (obr. 11) přítomností sedimentu (fakultativně aerobní kultury), difúzního zákalu (aerobní kultury mají zákal v celém médiu), blanky na povrchu kapaliny (špatná smáčivost buněk či mycelia, povrchové napětí, u většiny kultur tvořících drsné vrásčité kolonie), hrubých vloček (aerobní kultury), mázdry (povrchový útvar sedlinotvorných kvasinek, po vyčerpání sacharidů dochází k aerobnímu využití vyprodukovaného etanolu) a zbarvení w Růst pouze ve svrchní vrstvě Sediment burek Růst pod svrch ní vrstvou média Tvorba hrubých vloček Obr. 11: Růst mikroorganizmů v tekutém médiu (Prescott, 2013, upraveno) Makroskopické hodnocení spočívá v popisu kolonií. Vzhled kolonií je ovlivněn typem živného média, stářím kultury a typem kultivace. Na šikmém agaru nelze hodnotit jednotlivé kolonie. Lze posoudit rychlost růstu, tvar nátěru (rovný, plný, bodový, ostnitý, rhizoidní), profil nátěru (plochý, vypouklý), povrch nátěru (lesklý, drsný, suchý), konzistenci a pigmenty. Pomocí růstu ve vpichu šikmého agaru lze určit nároky mikroorganizmu na kyslík: aerobní rostou v horní části vpichu, anaerobní u dna a fakultativně anaerobní po celé délce vpichu. Kolonie je klon buněk narostlý z jednotlivé buňky. Na Petriho miskách lze při správně provedeném křížovém roztěru pozorovat a hodnotit jednotlivé kolonie (obr. 12): velikost (průměr; mm), tvar (pravidelný, kulatý, oválný, nepravidelně laločnatý, vláknitý, rhizoidní, plazící se), profil (vyvýšený, plochý, pupkovitý, miskovitý), okraj (pravidelný, filiformní, laločnatý, okrouhlý), povrch (hladký, lesklý- S - fáze, matný, drsný - R- fáze), transparence (průhledná, průsvitná, neprůsvitná), barva (bezbarvá, pigmentace). Další charakteristiky, které se mohou posuzovat, jsou 28 Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení vůně, zápach (po jasmínu, žluklém másle, ovocný), tvorba mycelia, změny média (dvorec zbarvení, hemolýza, precipitát), konzistence, která se zjišťuje bakteriální kličkou (viskózni, mazlavá, drobivá, zarůstající do agaru). PROFIL TVAR OKRAJE bradaviitý Obr. 12: Tvary bakteriálních kolonií (Rosypal, 1981) Nerovnosti růstu kolonií mohou být způsobeny stářím kultury. Mukoidní (M) charakter růstu se projevuje jako vlhké, slizovité a velmi lesklé kolonie tvořené opouzdřenými buňkami (např. Azotobacter, Leuconostoc). Hladké (S) kolonie mají rovný okraj s leskem nebo bez lesku u neo-pouzdřených buněk. Drsné (R) kolonie se vyznačují suchými, nerovnými okraji. Liší se výškou vrásnění. V drsných koloniích rostou buňky tvořící řetízky, mycelia či pseudomycelia (např. Ba-cillus, Trichosporon, kvasinky Pichia, Hansenula, Candida). Změny typu kolonií M - S - R jsou důsledkem mutací. Například mikroorganizmy z infekčního materiálu jsou většinou typu M, ale po několika přeočkováních se makroskopicky změní na typ S; zpětná změna z S na M typ je výjimečná. Fenotyp S, M a R je ovlivněn složením média. Zkvasitelné sacharidy (20 %) podporují S a M typ. Tenzidy způsobují hladké až lesklé fenotypy R typů. Mikroskopické znaky U mikroskopických preparátů se hodnotí tvar, velikost a uspořádání buněk, přítomnost zvláštních útvarů na buňce, způsob rozmnožování viditelný v preparátu. Preparáty lze pozorovat v nativním preparátu ve fázovém kontrastu nebo zvýraznit morfologii buňky a jejích struktur fixací a barvením (např. Gramovo, Ziehl-Nielsenovo barvení). U nativního preparátu (pozorování suspenze) se na podložní sklíčko vždy přikládá krycí sklíčko. Při pozorování plísní, kvasinek či aktinomycet se využívá sklíčkových kultur (krycí sklíčko je vytaženo z agaru, ve kterém bylo během kultivace zapíchnuto, je kulturou porostlé). Buňky mohou mít rozmanité tvary (obr. 13): koky (sférické, zploštělé, diplokoky, streptokoky, tetrády, sarciny, stafylokoky), tyčinky (rovné, zakřivené, větvící se, palisády, pleomorfní), kokobacily, buňky s pupeny či prostékami, spirily, hvězdice, mycelia. Úvodní slovo 29 Kcky kok diplokQk enkapsukwaný stafylokok diplokok ^^^^^^ Pneumococcus protaženátyEka Fusobacterium sarcina tetráda kvi ovitý tvar EJcfellovibrio O CZ) kokobaciluE bacilus diplobacilus CZX^XľľXZ) Streptobacilli iEící a s prívesky ' hvfa sto Obr. 13: Tvary bakteriálních buněk Zdroj (upraveno): Wikipedia.org - Bacterial cellular morphologies Velikost vybraných bakteriálních buněk je uvedena v Tab. 1. Tab. 1: Velikost bakteriálních buněk Mikroorganizmus Velikost (um) Chlamydia 0,3 x 0,3 Bdellovibrio 0,8 x 0,3 Rickettsia 1 x 0,3 Staphylococcus aureus 0,8-1 x 0,8-1 Escherichia coli 2-3 x 0,4-0,6 Bacillus subtilis 1,8-4,8 x 0,9-1,1 Streptomyces vlákno x 0,7-1,6 Chromatium 25 x 10 Spirochety 500 Nativní preparát Při pozorování suspenze nativního preparátu buňky nikdy nefixujeme. Preparát je nebarvený, slouží ke zjištění skutečného tvaru a struktury buněk neporušených fixací a barvením. Využívá se při pozorování růstu a množení, pohybu bakterií. Význam má při studiu buněčných útvarů, které se obtížně barví, např. spor. Pro pozorování struktur se využívá jasné pole, fázový nebo 30 Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení Nomarského kontrast. Fixace preparátu Podstatou fixace je vysrážení buněčných koloidů, zejména bílkovin. Fixací buňky lépe přilnou ke sklíčku, nespláchnou se aplikací barviva či rozpouštědla a lépe přijímají barvivo. Preparát se fixuje až ve chvíli, kdy je nátěr buněk suchý, aby nedošlo k uvaření buněk. Fixace se provádí protažením podložního skla s nátěrem buněk, který je umístěn na horní straně sklíčka, nesvítivou částí plamene. Pokud byly buňky kultivovány v tekutém cukerném prostředí, je nutné buňky od média separovat centrifugací a následně je promýt vodou či pufrem. Buňky kvasinek a plísní jsou větší než buňky bakterií, tepelná fixace může pozměnit jejich tvar. Proto se většinou fixují chemikáliemi. Fixace i barvení mírně buňku deformují, jejich charakteristický tvar zůstává. Pro měření přesné velikosti buněk se využívá nefixovaný preparát negativně obarvený (obarvení okolí buňky). Barvené preparáty Slouží ke zjištění typu buněčné stěny, tvaru buněk a uspořádání jejich shluků, přítomnosti a uložení endospor, přítomnosti pouzder a vnitřních buněčných struktur (inkluzí) a životaschopnosti buněk. Pro určení morfologie buňky a charakteristických shluků stačí jednoduché barvení buněčné stěny (např. krystalovou violetí) bez rozlišování grampozitivního či gramnegativního typu. Vitální test ukazuje poměr živých a mrtvých buněk v nefixovaném preparátu. Vitální barvení je barvením mrtvých buněk, protože mrtvé buňky přijímají barvivo nebo ho efluxními systémy nevylučují (např. zředěnou Lôfflerovu modř). Struktury buňky se rozlišují diferenciačným barvením, a to jak vnitřní a vnější morfologické útvary (endospory, exospory, pouzdra, buněčné stěny), tak chemické složky (barvení volutinu, glykogenu, škrobu). Diagnostické barvení napomáhá identifikaci bakterií (např. Gramovo, acidorezistentní barvení karbolfuchsinem, barvení dle Giemsy). Při negativním barvení se buňky nefixují ani se nebarví, obarveno je pouze jejich okolí (např. tuší, nigrosinem). Využívá se pro měření přesné velikosti buněk nedeformovaných fixací a barvením. Preparát se před barvením fixuje vždy kromě negativního barvení a vitálního testu. K barvení se používají zředěné vodné roztoky organických barviv, obvykle soli. Bazická barviva mají barevný kationt, kyselá potom aniont. Při barvení bakterií se většinou používají bazická barviva (např. krystalová violeť, methylenová modř, safranin, bazický fuchsin, malachitová zeleň). Barvení lze zvýraznit mořením buněk (např. fenolem, taninem), při kterém má moridlo roli prostředníka s vyšší afinitou k buňce a zároveň k barvivu, než je afinita buňky k samotnému barvivu. Gramovo barvení Gramovo barvení je jednou z nej důležitějších diagnostických metod při identifikaci bakterií. Rozlišuje skupinu grampozitivních (barví se modrofialové) a gramnegativních buněk (barví se červeno-růžově) a udává některé fyziologické a chemické vlastnosti buňky. Podstata rozdílného chování při Gramové barvení nebyla dosud uspokojivě objasněna, s největší pravděpodobností se zde však uplatňují rozdíly ve složení buněčné stěny obou skupin bakterií. Jde o barvení fixovaného preparátu krystalovou violetí a následné moření buněk jódem v roztoku KI. Vzniká komplex barvivo-jód-buněčná stěna. Rozdíl při barvení vzniká při promývání preparátu organickým rozpouštědlem (acetonem nebo alkoholem). U gramnegativních buněk odbarvovací činidlo rozpustí vnější lipopo-lysacharidovou vrstvu, komplex krystalové violeti s jódem se vymyje přes tenkou vrstvu peptidogly-kanu a buňky se odbarví, naopak grampozitivní bakterie si zbarvení ponechávají. Pro zvýraznění rozdílu se gramnegativní bakterie dobarvují jiným kontrastním barvivem (např. bazickým safrani-nem, karbolfuchsinem) a barví se do červena, růžová. Grampozitivní buňky mají v buněčné stěně navázánu krystalovou violeť, která se alkoholem nevyplavila a zůstávají zbarveny do modra, modrofialová. Chyby, které mohou nastat při barvení, jsou: příliš silný nátěr buněk na sklíčku; uvaření Seznam přístrojů a mikroorganizmů 31 buněk při fixaci; příliš dlouhé odbarvování buněk alkoholem. Gramovo barvení je do jisté míry ovlivněno fyziologickým stavem buněk, stářím kultury a složením kultivačního média. Pro barvení se využívají buňky staré 24 hodin. Buňky mohou ztratit svoji grampozitivitu např. mechanickým poškozením, UV zářením, působením kyselin, zásad či rozpouštědel. Mikroorganizmy, které se někdy barví pozitivně a někdy negativně, označujeme jako gramlabilní/gramvariabilní. Některé bakteriální rody Gramovým barvením nelze obarvit, jsou to rody bez buněčné stěny (mykoplazmata), spirálovité bakterie a silně acidorezistentní rody (myko-bakterie); např. Borrelia burgdorferi, B. recurrentis, Bartonella henselae, Chlamydia trachomatis, C. pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Coxiella burnetii, Ehrlichia chaffeensis, Anaplasma pha-gocytophilum, Legionella sp., Leptospira sp. , Mycobacterium bovis , M. tuberculosis, M. avium, M. intracellular, M. kansasii, M. leprae, M. marinum, A , Orientia tsutsugamushi, Treponema pallidum. Buněčná stěna bakterií Buňky gramnegativního typu (obr. 14B) mají buněčnou stěnu složenou z vnější lipopolysachari-dové membrány a vnitřní relativně tenké peptidoglykanové (zhruba 5-10 % buněčné stěny) vrstvy obsahující kyselinu muramovou. Spojení mezi peptidoglykanem a vnější membránou zajišťují lipo-proteiny. Lipopolysacharidy jsou složeny z lipidu A, jaderného (též základního, dřeňového) polysacharidu a O-antigenu (též O-řetězec). Vnější membrána slouží jako ochranná bariéra před vnějším prostředím, brání prostupu látek nebo postup alespoň zpomaluje (žlučové soli, antibiotika, jedy, atd.). V buněčné stěně grampozitivního typu (obr. 14A) chybí vnější membrána a peptidogly-kanová vrstva je poměrně tlustá. Někteří zástupci mohou mít jako složku buněčné stěny kyselinu teichoovou, lipoteichoovou anebo neutrální polysacharidy, u několika zástupců jsou ve stěně přítomny mykolové kyseliny. Zvláštní skupinou jsou bakterie bez buněčné stěny, tzv. mykoplazmata, které nejsou schopny syntetizovat prekurzory peptidoglykanu. Buňky jsou obklopeny pouze cytoplazmatickou membránou. Obr. 14: Buněčná stěna grampozitivního (A) a gramnegativního (B) typu (Prescott a kol., 1996, upraveno) Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Podložní a krycí skla, očkovací kličky, lupy • Barviva pro Gramovo barvení (krystalová violeť, Lugolův roztok, safranin) 32 Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení • Destilovaná voda Mikroorganizmy • Escherichia coli CCM 3954 • Pseudomonas putida, • P. fluorescens CCM 2115T • Serratia marcescens CCM 303 • Kocúria rosea CCM 839 • Micrococcus luteus CCM 169 • Bacillus cereus CCM 2010 • Bacillus subtilis CCM 2216 • Staphylococcus aureus SA 812 • Saccharomyces cerevisiae Postup • Ve cvičení každý pracuje samostatně. • Preparáty popsat buď na sklíčko či papírek přilepený ke sklíčku. Každý hodnotí a barví: • Morfologii kolonií a růstu na agarech a v tekutém médiu • Gramovo barvení - čistá a směsná kultura • Mikroskopicky pozorovat všechny kultury ve cvičení a vyhodnotit tvar buněk, tvorbu shluků a typ buněčné stěny • Nativní preparát Nativní preparát — aseptická práce při nanášení buněk na sklíčko • Dobře očištěné podložní sklíčko vyjmout z alkoholu a protáhnout plamenem. • Označit sklíčko číslem vyšetřované kultury. • Doprostřed sklíčka nanést kapku sterilní destilované vody. • Ožehnutou, vychladlou očkovací kličkou vnést do kapky malé množství kultury, rozmíchat. Kultury stačí nepatrné množství, aby preparát nebyl hustý. • Kapka se neroztírá, překrývá se krycím sklíčkem tak, aby v preparátu nebyly vzduchové bublinky (nepřikládat svrchu na kapku, ale nejprve jednou hranou, nepřitlačovat). • Přebytečnou kapalinu odsát filtračním papírem. • Buňky z tekutého média pozorovat přímo v médiu bez ředění v kapce vody. Zhodnocení cvičení 33 • Pro nativní preparát zvolit objektiv s fázovým kontrastem (Ph). • Preparát pozorovat do 5 minut od přípravy z důvodu rychlého vysychání. Gramovo barvení • Dobře očištěné podložní sklíčko vyjmout z alkoholu a protáhnout plamenem. • Označit sklíčko číslem vyšetřované kultury. • Doprostřed sklíčka nanést kapku sterilní destilované vody. • Ožehnutou, vychladlou očkovací kličkou vnést do kapky malé množství kultury. • Suspenzi z kultury rozetřít po sklíčku, nechat dobře zaschnout a fixovat plamenem (několikrát sklíčko protáhnout plamenem). • Preparát ponořit do roztoku krystalové violeti (30 sekund), barvivo opláchnout vodou. • Preparát ponořit do Lugolova roztoku (30 sekund), barvivo opláchnout vodou. • Preparát převrstvit etanolem (nebo acetonem), maximálně na 15-20 sekund. • Opláchnout slabým proudem vody. • Preparát ponořit do safraninu na 1 minutu (takto se dobarví pouze buňky gramnegativní, u kterých došlo k vyplavení krystalové violeti; safraninem však dobarvujeme každý preparát, i když předpokládáme přítomnost grampozitivních buněk - předem nevíme, o jaký typ buněčné stěny se v preparátu jedná). • Preparát osušit mezi dvěma filtračními papíry a pozorovat při zvětšení lOOOx (s imerzním objektivem) v jasném poli (označení objektivu BF). Zhodnocení cvičení • Podařilo se správně obarvit a pozorovat kultury? • Pokud ne, proč? 34 Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení Na obr. 15, 16 a 17 si můžete prohlédnout křížové roztěry a mikroskopické preparáty (Gramovo barvení) kultur používaných ve cvičení. Obr. 15: Čisté kultury bakterií na agaru a obarvené dle Grama. Escherichia coli (A), Pseudomonas putida (B), Serratia marcescens (C), Saccharomyces cerevisiae (D), Bacillus cereus (E), Kocuria rosea (F), Micrococcus luteus (G), Staphylococcus aureus SA 812 (H) (archiv autorek) Obr. 16: Smíšené kultury bakterií. S. marcescens a B. subtilis (archiv autorek) Další informace k této problematice najdete v následující literatuře 35 Obr. 17: Směsné kultury obarvené dle Grama. S. marcescens a K. rosea (A), M. luteus a P. putida (B) (archiv autorek) Další informace k této problematice najdete v následující literatuře 1. Miniatlas mikroorganizmů (23. 2. 2017) 2. Prescott L., M., Harley J. P., Klein D. A., Microbiology, WCB, Dubuque, 1996, ISBN 0-697-29390-4. 3. Rosypal S., Obecná bakteriologie, SPN Praha, 1981. 4. Silhánková L., Demnerová K., Návody pro laboratoře z mikrobiologie, VSCHT, Praha, 1993. 5. Atlas mykologie, http://www.mycology.adelaide.edu.au/ (23.2.2017) 6. Centers for Disease Control and Prevention, http://www.cdc.gov/az/a.html (23.2.2017) Kontrolní otázky 1. Jaká barviva se používají při barvení dle Grama a co zde působí jako mořidlo? 2. Co všechno můžeme v preparátu (v buňce) barvit? 3. Které morfologické znaky se popisují u kolonií mikroorganizmů? 4. Jsou všechny bakterie barvitelné Gramem? Pokud ne, uveďte nějaké příklady. 5. Na čem závisí morfologie bakteriální kolonie? 6. Jaké vlastnosti bakteriálních kolonií se popisují? 7. Proč se provádí fixace preparátu? 36 Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení 8. Uveďte alespoň 2 příklady bakteriálního rodu tvořícího kokovité buňky a 2 příklady buněk tyčinkovitých. 9. Jaká struktura buňky se barví Gramovým barvením a co z takto obarveného preparátu můžeme vyčíst? 10. Který objektiv poskytuje větší zvětšení - imerzní nebo suchý? K čemu imerze slouží? 11. Jak se dle Grama barví kvasinky; jaký mají typ buněčné stěny? 12. Jak se dle Grama barví Escherichia colil 13. Co je to peptidoglykan? 14. Jaké jsou hlavní rozdíly v přípravě a účelu preparátu barveného podle Grama a nativního preparátu? 15. K čemu slouží různé typy barvení buněk? 6 Bakteriofág Cíl cvičení Stanovit titr fágového lyzátu metodou dvouvrstvého agaru. Úvodní slovo Bakteriofágy (též fágy) jsou viry napadající bakteriální buňky. Velikost bakteriofágů se pohybuje od 20 do 200 nm, velikost genomu 2 až 200 kb, jsou menší než bakterie. Jejich počet je v prostředí asi desetkrát vyšší než počet bakteriálních buněk. Ze 20-50 % jsou příčinou jejich mortality, napomáhají koloběhu látek, zvyšování množství organických látek v prostředí. Geneticky se neshodují s ostatními viry (viry živočichů a rostlin). Evoluce fágů probíhá současně s evolucí bakterií, jsou kontinuálně se vyvíjejícím rezervoárem genů. Nukleová kyselina bakteriofága (jedno nebo dvouřetězcová, kruhová nebo lineární, DNA nebo RNA) je uložena v proteinové kapsidě většinou tvaru ikosaedru, která je pomocí krčku spojena s bičíkem umístěným v kontraktilní pochvě. Na bazálni ploténku bičíku jsou napojena bičíková vlákna pro přichycení na povrchové receptory bakteriálního hostitele (obr. 18). Obr. 18: Struktura T4 bakteriofága (Prescott a kol., 1996, upraveno) Rozmezí bakteriálního hostitele může být u fágů velice úzké či naopak široké. Některé fágy jsou natolik specifické, že se množí jen v určitých kmenech konkrétního bakteriálního druhu. Fágy se širokým spektrem hostitele se nazývají fágy polyvalentní. Chimérní fág vzniká homologní rekombinací mezi dvěma fágy, má vlastnosti od obou původních fágů. Podle průběhu životního cyklu se fágy dělí na dvě skupiny: Virulentní fágy s lytickým životním cyklem (obr. 19A) způsobují lyži hostitelského kmene bakterie. Životní cyklus má tyto fáze: 1. adsorpce virionu na povrch vnímavé buňky (u grampozitivních bakterií většinou na teichoové kyseliny), penetrace nukleové kyseliny fága do cytoplazmy buňky, 2. replikace fágové DNA s využitím RNA polymerázy hostitele, syntéza rané mRNA fága a proteinů kontrolujících syntézu dalších virů, syntéza pozdních bílkovin fága, 3. kompletace nových virových částic (virionů), 4. uvolnění virionů do vnějšího prostředí umožněné syntézou endolyzinů a lyží buňky. Uvolněné viriony pak mohou infikovat další citlivé buňky. 38 Bakteriofág Pokud lytická infekce probíhá v tekutém médiu s narostlými buňkami hostitelského kmene, dojde po určité době k vyčeření a dostaneme tzv. fágový lyzát (kultivační prostředí obsahující aktivní virové částice, zbytky membrán a vylitý buněčný obsah). Pokud probíhá lyže u hostitelského kmene na agaru, vznikají plaky, projasněná místa. Temperované fágy s lyzogenním cyklem (obr. 19B) se rekombinací začleňují do ge-nomu hostitele, jejich nukleová kyselina se replikuje a přenáší na potomstvo spolu s genomem. Takový fág se nazývá profág, může se uvolnit a vyčlenit z nukleové kyseliny bakteriální buňky po působení některých vnějších faktorů (např. UV záření, působení mutagenů či stresových faktorů). Při chybném vyčlenění (tj. při posunutí čtecího rámce) se může spolu s genetickou informací fága vyčlenit i část genomu hostitelské bakterie, která je součástí nové virové částice a může být šířena dál. Tento proces se nazývá transdukce a např. u druhu Staphylococcus aureus je nejčastějším způsobem horizontálního přenosu genů, který viru může přinášet určitým způsobem výhodné geny. Stejně tak i bakteriím, neboť bakteriofágy napomáhají například v shiftech sérotypů bakterií (serotype-converting phages). Hlavičky jsou plněny dna (3) Syntéza prázdných fágových hlaviček, Fágová dna řídí buněčný metabolizmus k produkci virových složek - proteinů a kopii fág o vé dna (2). Binárni děleni, každá buňka obsahuje inkorporovanou fáaovou dna Límeček, bičík a bazálni destička jsou pripojený k hlavičce, bičíková vlákna jsou připojena ako poslední (3). Lyže bakteriální buňky, uvolnění kompletních infekčních fágů (4). Fág se přichytil nareceptor na buněčné stěně bakterie, kterou proniká a vsunuje svou dna rn. \ Fágová dna se vkládá do bakteriálního chromozomu. o O \o o) LYZOGEKN"! CYKLUS G Fág je replikován společně s bakteriální DNA před binárním dělením. Obr. 19: Životní cyklus fága (zdroj: Virtual Learning Environment - Viruses; upraveno) Infekce bakteriální buňky fágem nemusí být vždy úspěšná. Některé bakterie překrývají receptory pro navázání fágů např. proteinem A, anebo pokud infekce a penetrace proběhne, bakterie aktivují reštrikčné modifikační systémy a endonukleázy rozštěpí cizorodou nukleovou kyselinu. To jsou hlavní problémy fágové terapie. Řešením je izolace fágových mutant, které jsou schopné překonat obranné mechanizmy hostitele a lyžovat původně necitlivé kmeny. Fágová terapie je použití fágů k léčbě bakteriálních infekcí. Bakteriofágy schopné lyže patogenních bakteriích se dostaly do popředí zájmu po objevu bakteriálních kmenů rezistentních na záložní antibiotika (např. meticilin). Jedny z prvních výzkumů fágové terapie probíhaly od 60. let v zemích bývalého Sovětského svazu; v Gruzii bylo do studií zahrnuto až 31 tisíc dětských pacientů trpících průjmy. Západní Evropa a USA se k výzkumu připojily později. Bakteriofágy byly v minulosti hojně užívány k léčbě a prevenci infekcí. Zatímco dříve byly pro fágovou terapii využívány preparáty obsahující celé fágové částice, v současnosti otevírá nové možnosti v boji proti obtížně léčitelným infekcím izolace dobře charakterizovaných purifikovaných fágových komponent s antimikrobiálními vlastnostmi. Dnes je fágová terapie rozvíjena zejména Seznam přístrojů a mikroorganizmů 39 u infekcí vyvolaných bakteriálními rody Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Proteus, Klebsiella, Shigella, Salmonella, Escherichia, Enterococcus a Listeria. Výhodou fágové terapie je vysoká speciŕita k cílovému kmeni hostitele, fágy nejsou nebezpečné pro přirozenou mikroflóru pacienta. Speciŕita fága však vyžaduje velmi přesnou diagnostiku patogena a stanovení jeho citlivosti k danému fágu. Výhodné je používat polyvalentní fágy nebo jejich směsi, které jsou schopné lyžovat většinu patogenních kmenů daného druhu, které se podílejí na vzniku infekce. Bakteriofágy jsou schopny pomnožit se v místě infekce, proto je možné podat pacientovi malou jednorázovou dávku preparátu. Naproti tomu antibiotika jsou metabo-lizována, eliminována z organizmu a nekoncentrují se v místě infekce, což vyžaduje opakované dávky. U fágových preparátů nebyly, až na několik výjimek, dosud pozorovány závažné vedlejší účinky, ve srovnání s antibiotiky. Problém může nastat při uvolnění endotoxinů do organizmu pacienta v důsledku lyže bakteriálních buněk. Případný vznik rezistence na určitého fága je často spjat se ztrátou patogenity příslušného bakteriálního kmene. Povrchové buněčné komponenty, fágové receptory, bývají spojené s bakteriální virulencí a jejich mutace vede současně ke ztrátě obou uvedených funkcí. Naproti tomu kmeny rezistentní na antibiotika si uchovávají vlastnosti virulence. Vývoj nových antibiotik je zdlouhavý a nákladný. Vyhledání nového terapeutického fága proti rezistentnímu bakteriálnímu kmeni je rychlejší a levnější proces. Fágová terapie se nevyužívá pouze v medicíně, ale také při ošetřování potravin proti bakteriálnímu napadení, ve fytoterapii, v pěstitelství a rostlinné výrobě proti bakteriálnímu onemocnění rostlin. Ke stanovení počtu fágových částic se používají nepřímé metody založené na tvorbě plak. Plaky jsou projasněné zóny na tuhém médiu souvisle porostlém hostitelským bakteriálním kmenem. Vznikají v místě, kde se v okamžiku očkování nacházela jedna aktivní fágová částice, která dala po infekci vznik dalším virionům, ty napadly okolní citlivé buňky. V několika po sobě následujících lytických cyklech dochází k lyži velkého počtu sousedních hostitelských buněk a vzniká plaka. Základním předpokladem metody je, že počet hostitelských buněk musí být vyšší než počet fágových částic. Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • masopeptonový bujón (MPB) • masopeptonový agar (MPA) - 2 % a 0,7 % • sterilní tris HCl pufr (pH 7,2) • sterilní 0,22 % CaCl2 • sterilní Petriho misky, pipety, zkumavky, vodní lázeň, termostat Mikroorganizmy • Staphylococcus aureus SA 812, stafylofág 812 40 Bakteriofág Postup Příprava fágového lyzátu • 2 ml narostlého 24 hodinového inokula S. aureus SA 812 naočkovat do 100 ml čerstvého MPB v prevzdušňovači láhvi a za intenzivního prevzdušňovaní pokračovat v kultivaci další 4 hodiny při teplotě 30 °C. • Po 4 hodinách aseptický přidat 10 ml sterilního 0,22% CaCl2 a 5 ml zásobního lyzátu fága 812 a pokračovat v kultivaci. • Po 60 minutách přemístit prevzdušňovači láhev do temna a laboratorní teploty. • Za 12-24 hodin se médium vyčeří, přesto v něm zůstává určitý počet necitlivých buněk. • Lyzát sterilizovat přídavkem chloroformu (5-10 kapek na 10 ml lyzátu), nechat působit 1-2 hodiny, lyzát stáhnout sterilní pipetou a přenést do sterilní baňky. • V takto připraveném lyzátu se při teplotě 4 °C významně nemění počet aktivních fágových částic po dobu 1-2 měsíců. Příprava hostitelských buněk • Ze zásobní kultury S. aureus SA 812 naočkovat 20 ml sterilního MPB (ve 100mi baňce) a kultivovat 24 hodin při teplotě 30 °C. Stanovení počtu virionů: • Lyzát fága 812 zředit ve sterilním tris HC1 pufru, vždy sterilně přenášet 0,1 ml lyzátu nebo předchozího ředění do 0,9 ml pufru, na každé ředění použít novou sterilní špičku, dobře promíchávat! • Připravit sterilní zkumavky, které budou obsahovat 3 ml 0,7% MPA, rozvařeného a vytem-perovaného na 45 °C. • K 20 ml hostitelských buněk sterilně přidat 2 ml 0,22% CaCl2 a pipetovat 0,3 ml inokula do každé zkumavky. • Na bakteriologické plotny s 2% MPA pipetovat 0,1 ml příslušných ředění fága, ihned po pipetování misku zalít obsahem jedné zkumavky, krouživým pohybem agar promíchat s pi-petovanou kapkou a ve vodorovné poloze nechat utuhnout. • Misky umístit dnem vzhůru do termostatu a kultivovat při 30 °C 12-24 hodin. Zhodnocení cvičení • Spočítat počet plak na miskách (obr. 20) s nejvhodnějším ředěním (na misce okolo 20-200 plak). K miskám, na kterých je méně než 10 plak při hodnocení nepřihlížet. Výsledek je v jednotkách PFU/ml (plaques forming units, počet fágových částic schopných vytvářet plaky v 1 ml, nikoliv absolutní počet virionů). Další informace k této problematice najdete v následující literatuře 41 Obr. 20: Plaky vzniklé vysetím řady ředění (ředění 10 3 až 10 10) fágového lyzátu (archiv autorek) U ředění 10-3 došlo k lyži veškerých buněk, naopak u ředění 10-10 k lyži buněk nedošlo. Pro výpočet je nejvhodnější ředění 10-7. Příklad výpočtu: Na 3 miskách (0,1 ml vzorku ředění 10_5/miska) se vytvořilo 122, 132, 139 plak, aritmetický průměr je 131 plak. Titr lyzátu je = 131 • 105 = 1, 31 • 107 v 0,1 ml, tedy 1, 31 • 108 PFU/ml Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Eyer L., Pantůček, R., Růžičková V., Doškář J., Nové perspektivy fágové terapie, přehledový článek v Klinická mikrobiologie a infekční lékařství, 2007. • Skripta Praktikum z mikrobiologie • Otradovcová L., Izolace a charakterizace mutant polyvalentního stafylokokového bakte-riofága účinných proti methicilin-rezistentním kmenům Staphylococcus aureus, Diplomová práce, MU, Brno, 2012. Kontrolní otázky 1. Čím se liší bakteriofágy od virů rostlin a živočichů? 2. Jaký je význam virů pro přenos genetické informace v prostředí? 3. Čím jsou viry prospěšné při terapii onemocnění? 4. Co je nutné mít pro kultivaci bakteriofága? 5. K čemu slouží CaCl2? 7 Bakteriofág — transdukce Cíl cvičení Ověřit správný průběh transdukce přenesením rezistence k antibiotiku z donorových na recipientní bakteriální buňky. Úvodní slovo Transdukce je přenos genetického materiálu prostřednictvím viru z buňky donorové do buňky recipientní. Pomocí bakteriálních virů (též bakteriofágů či fágů) lze přenést jakýkoli fragment chromozomu z donorové bakteriální buňky do buňky recipientní, jedná se o horizontální výměnu genetické informace. Přenesený fragment pak rekombinuje s homologickým úsekem recipientní buňky, integruje se do jejího genomu, což se projeví v jejím fenotypu. Mechanizmus přenosu není zcela objasněn, ale pravděpodobně jde o chybu při sbalování DNA do fágové hlavy během sestavování fágových částic v infikované buňce. Místo replikované fágové DNA je do fágové hlavy zabalena DNA donorové buňky, část chromozomu nebo plazmid, který může být přenesen fágem do recipientní buňky. V literatuře je v současnosti popsáno více než 250 stafylokokových bakteriofágů. Schopnost transdukce mají pouze některé z nich, a to fágy náležící do sérologické skupiny B a příbuzné skupiny F. Za prototyp transdukujícího fága je považován fág 011 sérologické skupiny B, který je schopen zabalit do své hlavy chromozómami nebo plazmidovou DNA až do velikosti svého genomu, t.j. 45 kb. Indukovat fága lze UV zářením nebo mitomycinem C z chromozomu kmene NCTC 8325, kde je integrován ve formě profága. Dalšími bakteriofágy s vysokou efektivitou transdukce jsou např. fágy 52A, 53 a 80. V současnosti je u Staphylococcus aureus metoda transdukce využívána k cílenému vnášení mobilních genetických elementů do kmenů a k přípravě pozměněných variant kmenů, ke studiu horizontálního přenosu genů a k identifikaci přenášených genů. Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • MPA, MPB • roztok CaCl2, citrát sodný • tetracyklín • centrifuga Mikroorganizmy • Donorový kmen Staphylococcus aureus Jevons B (obsahuje 2 plazmidy, rezistence na kadmium a tetracyklín) • Recipientní kmen Staphylococcus aureus RN4220 • Transdukující fág JB CCM 7872 Postup 43 Postup Příprava transdukujícího fágového lyzátu • Očkovat donorový kmen (20 ul zamražené kultury do 20 ml MPB) a inkubovat při 37 °C po dobu 18 hodin. • Přenést 2 ml 18hodinové kultury do 50 ml čerstvého MPB v prevzdušňovači láhvi a inkubovat při 37 °C po dobu 2 hodin za intenzivního prevzdušňovaní. • Přidat 6 ml lyzátu fága, roztok CaCl2 do výsledné koncentrace 2 niM a inkubovat za stejných podmínek jako při 37 °C po dobu 2 hodin za intenzivního prevzdušňovaní (zásobní roztok CaCl2 o koncentraci 0,02 M, pro dosažení výsledné koncentrace přidat 1/10 objemu). • Uskladnit lyzát přes noc v lednici (dokončení lyže, v případě úplné lyže bakteriální kultury bezprostředně po ukončení inkubace lze tento krok vynechat). • Odstranit zbytky buněk donorového kmene centrifugací (5000 rpm / 30 minut) a filtrovat přes 0,45 um bakteriologický filtr. • Stanovit titr fágových částic v lyzátu metodou dvouvrstvého agaru (pro výpočet frekvence transdukce). Transdukce plazmidů • Očkovat recipientní kmen (20 ul zamražené kultury do 20 ml MPB) a inkubovat při 37 °C po dobu 18 hodin. • Stanovit titr recipientního kmene (pro výpočet frekvence transdukce). • Přidat roztok CaCl2 ke kultuře recipientního kmene do výsledné koncentrace 2 mM (zásobní roztok CaCl2 o koncentraci 0,02 M, pro dosažení výsledné koncentrace přidat 1/10 objemu). • Smíchat 1 ml kultury recipienta s 1 ml transdukujícího fágového lyzátu tak, že hodnota multiplicity infekce (poměr počtu fágových částic k počtu buněk) bude max. 1. • Inkubovat transdukční směsi při 37 °C po dobu 25 minut za stálého třepání. • Přidat roztok citrátu sodného k transdukční směsi do výsledné koncentrace 15 mM, cent-rifugovat (3000 rpm / 10 minut / 4-8 °C) a resuspendovat pelet v roztoku 17 mM citrátu sodného. Objem pro resuspendaci závisí na počtu misek, na které se bude transdukční směs vysévat a na množství směsi vyseté na jednu misku, ideálně 100-300 ul (roztok citrátu sodného se zásobní koncentrací 0,03 M - k transdukční směsi se přidá v poměru 1:1; roztok se zásobní koncentrací 0,017 M - pro resuspendaci peletu). • Vyset transdukční směs na misky s MPA obohaceným o citrát sodný (20 mM) a tetracyklín, 5 ug/ml (roztok citrátu sodného se zásobní koncentrací 1 M - do 100 ml rozvařeného sterilního média přidat 2 ml. Tetracyklín v zásobní koncentraci 5 mg/ml - do rozvařeného sterilního média přidat 1/1000 objemu). • Inkubovat misky při 37 °C po dobu 24 hodin. • Zjistit počet kolonií transduktant na miskách. Výpočet frekvence transdukce je podíl počtu transduktant (CFU/ml - colony-forming units/1 ml) k počtu fágových částic v transdu-kujícím lyzátu (PFU/ml - plaque-forming units/1 ml). 44 Bakteriofág - transdukce Zhodnocení cvičení • Došlo k přenosu plazmidu? • Jak jsme přenos ověřili? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Rosypal S., Doškář J., Pantůček R., Kailerová J., Relichová J., Růžičková V., Šmarda J. ml., Šmarda J., Štěpán J., Terminologie molekulární biologie, MU Brno, 2001. • Varga M., Charakterizace systému nespecifické transdukce plazmidů u Staphylococcus aureus. Dizertační práce, MU Brno, 2013. • Varga M., Transdukce plazmidů zprostředkovaná profágy kmenů Staphylococcus aureus. Diplomová práce, MU Brno, 2009. Kontrolní otázky 1. Co ověříme pomocí kontrol? (a) Miska s antibiotiky + donorový kmen (b) Miska s antibiotiky + recipientní kmen před transdukcí (c) Miska bez antibiotik + recipientní kmen před transdukcí 2. Na jaké z kontrolních misek buňky narůst mají/nemají? 3. Co je transdukce? 4. Používají se pro transdukcí fágy s lytickým nebo lyzogenním cyklem? Proč? 8 Nepřímé stanovení počtu životaschopných bakterií plotnovou metodou Cíl cvičení Získání řady ředění kultury mikroorganizmu. Stanovit počet životaschopných buněk. Úvodní slovo Pro stanovení počtu buněk ve vzorku se využívají přímé a nepřímé metody. Mezi přímé metody patří stanovení počtu buněk pomocí mikroskopu, počítání samotných buněk v preparátu ze vzorku, bez kultivace. Výhodou je rychlost a stanovení počtu jak živých tak mrtvých buněk či jejich poměr, např. porovnáním poměru neobarvených živých buněk s počtem mrtvých, které se obarvují. Mezi nepřímé metody patří metody kultivační. Kultivací části vzorku zjistíme počet životaschopných buněk, které vytvoří kolonie. Při některých fyziologických a genetických experimentech je nutné znát počet buněk ve vzorku. Počet buněk slouží jako standard pro porovnávání výsledků. Jednotkou výpočtu plotnové metody je počet životaschopných (na plotnách rostoucích) buněk v 1 ml média/vzorku, tzv. colony forming units - CFU/ml. Plotnová metoda (kultivační nepřímá metoda) spočívá ve stanovení počtu narostlých kolonií za předpokladu, že každá buňka vytvoří jednu izolovanou kolonii. Plotnovou metodu lze provést dvěma způsoby, smícháním vzorku s tekutým temperovaným agarem nebo pipetováním vzorku na misku s agarem a rozetření L-kličkou (obr. 21). © J. Kopecká, 6. Rotková Obr. 21: Očkování suspenze buněk na misku - rozetření bakteriologickou L-kličkou (archiv autorek) Nefelometrické stanovení využívá intenzity světla odraženého od buněk, stanovení optické denzity suspenze buněk. Výhodou této metody je stanovení kalibrační křivky, počet buněk lze odečíst z lineární části křivky. Při ředění vzorku a pipetování buněk do ředícího roztoku je třeba dát pozor na rozbití buněk osmotickým šokem. Podle hustoty výchozí suspenze se určí počet zkumavek ředící řady. Pokud se očekává 0-103 CFU/ml, suspenze se jeví bez opalescence; při počtu 105 CFU/ml suspenze lehce opaleskuje; množství 107 až 109 CFU/ml vytváří mléčný zákal dle velikosti a tvaru buněk. V protokolech bývá uvedeno, s jakým počtem buněk (CFU/ml) se pracovalo případně s jakým zákalem (%). Zákal je méně přesná hodnota, která slouží pro rychlou orientaci. Ve spektrofotometru lze měřit zákal média či ředícího roztoku, který obsahuje i mrtvé buňky. Pokud se při stejné metodě opakovaně pracuje za stejných podmínek se stejně starou kulturou, tedy i stejným zákalem, lze předpokládat přibližně stejný počet živých a mrtvých buněk. V rámci daného expe- 46 Nepřímé stanovení počtu životaschopných bakterií plotnovou metodou rimentu je při opakování metody hodnota extinkce víceméně konstantní. Pro stanovení počtu buněk v různých prostředích je k dispozici řada metod, pro daný účel se volí metoda nejlépe vyhovující. Stanovení počtu mikroorganizmů se provádí v daném objemu a přepočítává se obvykle na 1 ml původního vzorku. Těmito výsledky jsou pak korigovány získané výsledky experimentů. Pomocí CFU/ml lze sledovat přírůstek buněk v čase. Pokud jsou během kultivace v tekutém médiu odebírány dobře promíchané vzorky, porovnáním počtu buněk v čase lze získat obraz o fyziologickém stavu kultury, o jejím prospívání či odumírání (účinky fyzikálních či chemických zásahů do rostoucí kultury, podpůrné či inhibující látky v potravinářství, v mikrobiálních technologiích atd.). Grafickým vynesením hodnot CFU/ml odebíraných ze vzorku v tekutém médiu (bez dodávání živin) po stejných časových intervalech lze sestavit růstovou křivku mikroorganizmu v daném prostředí. Díky stanovení počtu buněk lze hodnotit podíly jednotlivých skupin bakterií smíšené kultury v jejich celkovém zastoupení. Lze porovnávat makroskopické znaky kultivovaných zástupců a pracovat na médiích základních i selektivních, případně selektivně diagnostických. V praxi lze využít tzv. automatické počítače kolonií (obr. 22A) nebo stěrovou a výplachovou metodu pomocí analyzátoru (obr. 22B). Přístroj Lumitester PD (obr. 22B) dokáže rychle určit celkový stupeň kontaminace ovšem bez rozlišení druhů a rodů mikroorganizmů (měření luminiscence). Tento přístroj se využívá např. v potravinářských provozech. Obr. 22: Přístroje pro automatické počítání kolonií (A) a celkový stupeň kontaminace (B). Zdroj: www.marconi.sk (A; upraveno), Qualifood.cz (B; upraveno) Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Sterilní bakteriologické plotny s MPA • Sterilní zkumavky, pipety, L-kličky • Sterilní fosfátový pufr nebo fyziologický roztok Mikroorganizmy • Micrococcus luteus CCM 169 Postup 47 Postup Ředění kultury • Do sady sterilních zkumavek pipetovat po 0,9 ml sterilního fyziologického roztoku. • Z dobře promíchaného vzorku s kulturou odebrat 0,1 ml suspenze a přenést do první zkumavky. • Promíchat čistou špičkou obsah první zkumavky (celkový objem 1 ml), odebrat 0,1 ml a přenést do další zkumavky. • Promíchat obsah druhé zkumavky a 0,1 ml přenést do třetí zkumavky. Takto pokračovat až na konec ředící řady (Obr. 23). Očkování • Popsat Petriho misky s MPA na víčko (kolonie se budou počítat tečkováním dna misky popisovačem). • Ze zkumavek s ředěním 10-4 až 10-6 pipetovat 0,1 ml suspenze do misky. Pro každé ředění používat minimálně dvě misky, lépe tři, pro vytvoření průměru z ředění. • Pipetovaný objem rozetřít sterilní L-kličkou krouživým pohybem po celém agaru, dnem misky otáčet proti pohybu roztírání, netlačit na L-kličku. Při pipetování a roztírání otevírat misky co nejméně. Vzorek rozetřít rovnoměrně, aby kolonie narostly izolovaně. • Misky kultivovat dnem vzhůru 2-3 dny při 30 °C. Kontrola sterility ředícího roztoku • Ze zásobního fyziologického roztoku odebrat 0,1 ml, pipetovat na misku a rozetřít sterilní čistou L-kličkou. Kultivovat dnem vzhůru 2-3 dny při 30 °C. OJml 0,1 m! 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml y . . . A /N /N°': f MPA JMPA JlPf MPA IMPAli MPA lMPAfc/IPA] 6 x 0,9 ml fosfátového pufru Kontrola: 0,1 ml fosfátový pufr © G. Rotková Obr. 23: Schéma postupu plotnové metody (archiv autorek) 48 Nepřímé stanovení počtu životaschopných bakterií plotnovou metodou Hodnocení K hodnocení vybrat dvojici (trojici) misek vhodného ředění (obr. 24, misky se zhruba 20-200 koloniemi) a spočítat počet kolonií. Kolonie počítat ze dna misky a označit popisovačem na sklo tečkou. Ze získaných hodnot vypočítat průměr, číslo vynásobit kladnou hodnotou ředění a hodnotou 10 (na misku se nanášelo 0,1 ml, výsledek je přepočítaný na 1 ml). Získaný údaj je hodnota CFU/ml (colony forming units, počet bakterií schopných vytvořit kolonii/ml). CFU/ml = průměrný počet kolonií • hodnota ředění (kladný exponent) • 10 Správný formát výsledku je např. 2, 4 • 104 CFU/ml, nikoli 24 • 103 CFU/ml. Obr. 24: Plotnová metoda. Vhodné ředění pro počítání kolonií je v tomto případě ředění 10 6 (C), ředění 10-4 (A) a 10-5 (B) obsahuje příliš vysoký počet kolonií (archiv autorek) Zhodnocení cvičení 49 Zhodnocení cvičení • Které ředění při odečítání výsledků (počtu kolonií) bylo nej vhodnější? • Jaký byl počet (CFU/ml) buněk v původním vzorku? Probíhala práce aseptický? Pokud ne, proč? • Byl zaznamenán velký rozdíl v počtu kolonií mezi miskami jednoho ředění (nesprávně promíchaný vzorek)? • Došlo k nárůstu bakterií na kontrolních miskách s rozetřeným pufrem? • Mohla kontaminace ovlivnit celkový počet CFU/ml, proč (morfotyp kolonií)? • Byl vzorek dobře počitatelný (špatně rozetřený vzorek)? Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Klaban V., Ilustrovaný mikrobiologický slovník, Galén, Praha, 2005, ISBN 80-7262-341-9. Kontrolní otázky 1. Jaký je výpočet CFU/ml u plotnové metody, co znamenají jednotlivé členy vzorce? 2. Plotnovou metodu jsme prováděli na neselektivním médiu a pracovali jsme s čistou kulturou. Kdy se využívá plotnová metoda na selektivních médiích? 3. Pokud bychom při plotnové metodě místo kultury mikrokoka použili např. rybniční vodu. Stanovíme CFU/ml, jak a proč se bude lišit morfologie narostlých kolonií od nárůstu ředěné kultury mikrokoka? Budou kolonie rybniční vody také jediného morfologického typu? 4. Podle čeho zvažujeme množství zkumavek s pufrem (délku ředící řady) plotnové metody, kdy stačí využít jednu či dvě zkumavky a kdy je potřeba mnohem vyššího počtu? 5. Jaká jednotka se používá pro výpočet nárůstu při použití plotnové metody? 6. Proč a jak se při plotnové metodě provádí kontrola ředícího roztoku? 7. Co znamená zkratka CFU/ml a co vyjadřuje? 8. Proč se při plotnové metodě neočkuje bakteriologickou kličkou? 9. Vypočtěte CFU/ml, pokud byl stanoven počet kolonií 210 a 190 v ředění 10-6. Do 0,9 ml pufru v první zkumavce se pipetovalo 0,1 ml kultury. 10. Popište podstatu plotnové metody. 11. Jaký je rozdíl mezi přímým a nepřímým stanovením počtu buněk? 12. Proč je nutno promíchat zásobní vzorek a dále dobře promíchávat obsah zkumavek ředící řady? 13. Jak poznáme kontaminaci ředícího roztoku? 14. Proč se na misku při plotnové metodě neroztírá např. 1 ml vzorku? 15. Podle čeho odvodíte vhodný typ kultivačního média pro plotnovou metodu? 9 Přímé stanovení počtu buněk v Biirke-rově komůrce, vitální test, kvasinky Cíl cvičení Stanovit procento přežívajících buněk v závislosti na době inkubace při zvýšené teplotě. Úvodní slovo Pro stanovení počtu buněk ve vzorku se využívají přímé a nepřímé metody. Mezi nepřímé metody patří metody kultivační. Mezi přímé metody patří stanovení počtu buněk pomocí mikroskopu, počítání samotných buněk v preparátu ze vzorku, bez kultivace. Výhodou je rychlost a stanovení počtu jak živých tak mrtvých buněk či jejich poměr. Pro počítání buněk v preparátu je třeba mít suspenzi s vhodnou hustotou buněk. Pro odlišení živých a mrtvých buněk se využívají barvené preparáty. Buňky se mohou spočítat i pomocí fixovaného barveného preparátu či preparát nebarveného, živé a mrtvé buňky se ale neodliší. Pro přímé stanovení se používají počítací komůrky, např. Thomova, Bůrkerova (obr. 25), což je skleněná destička s počítací mřížkou různé velikosti. Prostor mezi podložním a krycím sklíčkem je na komůrce vždy vyznačen. Pracuje se s určitým objemem vzorku, ze známého objemu se dopočítává objem vzorku pro 1 ml. Po nakápnutí promíchaného vzorku na mřížku se buňky usadí na dně a mikroskopicky lze stanovit počet buněk na daných ploškách sítě. Obr. 25: Bůrkerova počítací komůrka (archiv A. Vávrové) Vitální test (barvení nativního preparátu) slouží ke zjištění okamžitého stavu populace sledovaných buněk. Je založen na propustnosti membrány mrtvých buněk. Cytoplazmatická membrána mrtvých buněk není semipermeabilní, barvivo se dostává dovnitř. Živé buňky se naopak průniku barviva „brání" svými kanálky v membráně; barvivo nepropustí nebo ho odbourají. K barvení mrtvých buněk v prostředí buněk živých se využívá netoxických barviv, např. roztok metylenové modři zředěný a pufrovaný fosfátem s pH 4,6. Pomocí vitálního testu lze sledovat např. působení zvýšené teploty na přežívání buněk v čase. Výhodou testu je rychlost, nízká spotřeba materiálu oproti plotnové metodě a možnost rozlišení poměru živých a mrtvých buněk. Nevýhodou je, že sledované buňky nelze dále kultivovat. Vitální test se využívá v praxi při kontrole životaschopnosti mikroorganizmů během technologických procesů. Sleduje se jejich odpověď (změna počtu či poměru) na přídavek či úbytek různých látek či na probíhající fyzikální proces. Z výsledků testu vitality lze okamžitě rozhodovat o zasažení do technologického procesu během kultivace buněk. Seznam přístrojů a mikroorganizmů 51 Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Erlenmeyerova baňka, zkumavky, pipety, kapátko • Sterilní destilovaná voda • Vodní lázeň, teploměr, mikroskop • Bůrkerova komůrka • Metylenová modř Mikroorganizmy • Kvasinky Saccharomyces cerevisiae, pekařské droždí Postup • Připravit suspenzi kvasinkových buněk z pekařského droždí či z nárůstu sbírkové kultury ve sterilní destilované vodě v baňce. • Pipetovat po 1 ml suspenze do 4 zkumavek. • První zkumavku zpracovat jako kontrolní vzorek pro zjištění počtu živých buněk při pokojové teplotě při začátku pokusu (0 minut). • Stanovit počet živých a mrtvých buněk. Do prohlubně Bůrkerovy komůrky nanést kapku suspenze a zakrýt krycím sklem. K okraji krycího sklíčka přikápnout metylenovou modř, na opačné straně ji odsát filtračním papírem, až je celý preparát zbarven modře. • Po usazení buněk (1-2 minuty) pozorovat a spočítat živé (neobarvené) a mrtvé (modré) buňky při zvětšení 400 x. • Pro každý čas spočítat buňky v min. 10 čtvercích. Do součtu zahrnout i buňky ležící na 2 hranách políčka (buď pravá a horní nebo levá a spodní hrana, obr. 26) J-- E J. Kopecká Obr. 26: Počítání buněk při vitálním testu. Červeně jsou znázorněny buňky, které se započítávají do celkového počtu buněk v políčku (archiv autorek) 52 Přímé stanovení počtu buněk v Bůrkerově komůrce, vitální test, kvasinky • Zbylé zkumavky umístit do vodní lázně o teplotě 61 °C. Stanovit počet živých a mrtvých buněk po 7, 14 a 21 minutách (obr. 27) postupem popsaným výše. • Dle vzorce vypočítat celkový počet buněk (mrtvé + živé). „ , , , , součet živých a mrtvých buněk celkový počet buněk/ml = - x 250 x 1000 10 x počet poliček • V MS Excel sestrojit graf závislosti přežívajících buněk na délce vystavení zvýšené teplotě (osa x, % přežívajících buněk; osa y, čas). a * /**.""*! j n s ■ °s - * 0 ' A. 'a' "•" *„*• • • • . o° ■ o 0 o. • o o f0 ° s ' s * • . • .f i „.<">.* o I • .o . . ? 15 , •*__\ „ *° J ,* ° 4 t + 4 + r 4- - -,. 4- 4 B. holi matmi...................... - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ J. _ _ _ +\ + 1 + !+ + z B. eubtilis......................... - — - — — — — — - — + - — — T + +■ — - — + 4 +:+ i + + ! + ! + _ B. Ucttmurbi...................... - + X + + "ŕ ■1- 4- + + + 1+ + B. antbtacle....................... + + + I 4- + f 4 + j+ + (SramneRativnI bakterie J i , Vibrio C'ndol-pwUive).............. + z + X * + i 1 ľ + +■ : + + + + f ^ ' 4 -i + + +Í+4-+ + + z "T" Vibrio Cirnlol-aetativ-c).............. + +• X + + + + + + + + -f 4 (■ 4- + + + + + + -■ B. Proteus......................... -* + + -* + + + + + + H + + + + -t — 4- + + + + + + • B. pj-ocyanem...................... + ■r + • + + + + + ■r + ■f + + + t + 4 + + + i + + + + ■r B. dywnterlEe ÍShisa)............... X 4 1 X \ y + í + í 4 + + + + + +.+ + + B. drscawrte (Flesner)............. X + x t f ■i + + -f + + 4 4- 4- H + 4 + + + x + B. dy«nLrriŕe (Mt. Desert).......... + + 4 + + + X + + + \ + 4 f- i + + + + + B. tyj>hosu8....................... ■ŕ + + + 4- 4 + + + + + + + + ! + + 4- + + + + + B. i».i r., - -, - r. - :: . A................. + + + t- + +- + + ■1 + i + + -\ + + + + 4- 4- 4- 4 + + +1 + + 4- B. paratyphosua. B................. + 4 + + 1 r ■1 + + i + ■t + + + + ■ŕ + i + 4 ■(■ + 4 + +! + + 4 8. enterldEUa (Gacrtncr)............ + + 4 + 1 + 1- 4 ■1 + + + + + + + + + i- 4- + 4- + + + + + 4- +■ + + + ;•*•>• : aru .'■ :.. . -, ."iiM ZľÍíľÍc NilitaJiii ikutbcivuii. EsdiiľiiĽhifcťuli D KU.'[00 ,i, '.: k U 2fct>k) '.! KTHMJml OKTJ/ISDml □ KTJI0O ml D KT];iOD ml Povrchová voda! Nařízeni vlády i. 61/2003 Sb., o ukazatelích a hodnolách pfipustního zneciStíni povrchových vod a odpadních vod. náležitostech povoleni k vypouitřni odpadních vod do vod povrchových a do kanalizací a o citlivých oblajtcch- Pta Fcyjfiiien úpravy na picnnu tvídu r: ■ . ■ .■■ j Povrchová voda m koupaní AI L lOVů litx'ld ilJ fT! DlrSEli KůdrůU Kůliformcii bakici-it ;■ K~ ii' SOMKlT/lDOinl :.-:ktj n -j ktju1c i :ot-x k~j ■ TermDfíileTjniiii kuli lui m t baklCi c :C.rTI1Wml ľiJnlOKTJVlDOml ZODŮC-KTMXTiJ 40 KTJ.'I ml 100 KTJ/IOľj ml JOOOKTJ.lOOml !■■ ■- nTJ 100 ml ■ ■ ■ vr: »kth ffll 1 J'.-kT'-lO? mi .Ir. ■■■ii-. " \Tm 5' - ' KT." SĽOÍm - ifili nil fikLT." MikicikupíĽlrt ubrii iiri aipaniirnS 50 kli 1 ni 3000 KTJŕl ml ICiD0C*KTÍ/Hm k mrpnní vijndirdawrt miiori njiril} sumy* voily UK pIlNuu >VÓU KrUrflAnw i} Jednoduchí ftTih*lni ůpravi i duinhkc*, nipNklad rychlá Jlltiicc ■ d»«tfcl,tt Biím jyiikalui upnu chcreKkÉ úprtvi a dřsinltkce. nípílKM dilansviiii ocrTlirovjaw vady. iriíeni. vfo&vvétt uuzaváiiE. fuiriar, dciúfrkce (zivřrtíné chlorováni} Intenzivní fyňkilm i dMuiiaVi upraví, rozíiřtni úprava. » d?jiniŕkce, niprilbd thLurotaíii do budit zlámu, sraženi, vlůfclsovini. U£a2ú\ui. filtrací, adsorpce (alaivri uhlil. desinfekc* |oic-Tiiricf. za^ťTTČn< chlorování I Roisalt analýí krácení p'tn.'i vi balená voda upravovaná z j -1 ■-■ 11 Ihiv':Iiii «l'(y: náhradní zásobováni, sludny 1 ,l ImtIi lil.1 i .'li OKTJ/10O ml 0 KTJ/250 ml II Kl.líKUl rul O h 1 .Ľni;:, n i ksliíúrmni bakteria (I lll.l/HII) iril 1) 1', l.líll.ll rul 0 KTJ/100 ml ClosIrkUum iuMliimnnľ. U KIJIUKI ml Peeudomonaa aaruijinosa Ľ KTj7?MiiiI jioíty kolonií pil 22 *Ľ 2oa Ku/1 mi 500 KTJ/1 flll 200 KTJ/1 ml MO KTJ/1 ml počjy kolonií pil 3£i *C tOĽ KTJ/I mP 20KTJ/1 ml 100 KTJ/1 ml 1UO KTJ/1 ml pilná voda balená voda upravovaná z uovitliuvéliu zdroje náhradní zásobováni. tíu-Jny nscliBiinhla coli 0 Kl.i/Kl!) ml 0 KTJ/250 ml 0 KTJ/100 ml 0 KTJ/100 ml Jiolifmmnl bokleiie 0 KTJ/100 ml ri KU/iBii mi 0 KTJ/100 ml ClDstrklium porfrlriflcnti 0 KTJ/100 mí PsfludDmtMias aoruplnosn 0 KTJ/250 ml [m ivk^lianliiň^-t; VWl KIJ/I ml 1111] Kl.líl inl 111 j ľ.l.i.'l ml MU) K[.iíi ji.; i-. lyh'U.............■(. ■m Hl.m rul . ■ M.M ,i, ion n.l.r/..... 100 KTJ/1 ml enttrokoky □ KTJ/100 ml 0 KTJÍ2M ml 0 KTJ/1 DO ml 0 KTJ/100 ml RfjzsaM malýz roíljoru teplé vudy podle 252/2004 teplá voda rkřniúl HĽB legínnely 100 KTJ/100 ml (j KTJrSOm pučty kolonii při 36 "C 2U0 KTJ/t ml Rozsah .tiiiilyz ruzburu teplé vody z individuálního zdroje pro hygienu zaměstnanců podle 252/2004 ,l[)|;li:k,í iuykilliilk'.fli;i d ľ. i lí ľ::i mi l :,i lilii In. i.Kil i) Kl Jí 10...... Iľ ; ......ly Ulil Kl.lílOU lul pocty kolonii pfi :ig 'C 200 KTJ/1 ml ťseudomonas aoruijlnosa 0 KTJřtOO ml Slaphylococuit eitt^us OKTJ/tOQ ml Obr. 55: Výběr požadavků na mikrobiologickou a biologickou analýzu pitné a povrchové vody (Vyhláška č. 252/2004 Sb.) 106 Základní mikrobiologický rozbor vody Další informace k této problematice najdete v následující literatuře • Baudišová D., Správnost a přesnost výsledků při mikrobiologických analýzách vody, VUV, 1998 (zdroj: http://www.mzp.cz/ris/ais-ris-info-copy.nsf/4d735ff9c7e64b58cl2569e7001a2d9c/ 3e5d5bba30el4c0a8025680e003396c6?OpenDocument; 13. 3. 2016) • Centrum pro cyanobakterie a jejich toxiny, www.sinice.cz (13. 3. 2016) • Fykologická laboratoř Přírodovědecké fakulty Jihočeské univerzity, www.sinicearasy.cz (13. 3. 2016) • Kvalita pitné vody, http://sweb.cz/Hlavaty.Vaclav/kvalita.htm (13. 3. 2016) • Vyhláška č. 252/2004 Sb. (zdroj: http://sweb.cz/Hlavaty.Vaclav/vyhl.htm, 13. 3. 2016) Kontrolní otázky 1. Jaké mohou být zdroje nepřesností při mikrobiologickém rozboru vody? 2. Jak se liší postup při základním mikrobiologickém rozboru vody povrchové a pitné? 3. Jaký je postup stanovení celkového počtu psychrofilních a mezofilních bakterií ve vzorku vody pitné nebo povrchové? 4. Jaká selektivně diagnostická média můžeme použít při základním mikrobiologickém rozboru vody? Počítáme na nich všechny kolonie? 5. Jaká je bakteriální indikátorová skupina pro základní mikrobiologický rozbor vody? 6. Využívání jakého cukru se sleduje na Endově agaru? 7. Počítají se na selektivně diagnostických médiích všechny bakteriální kolonie? 8. Jmenujte alespoň 4 druhy bakterií přirozeně osídlující vody. 19 Úvod do identifikace bakterií, biochemické testy a standardizované identifikační systémy Cíl cvičení • Identifikace neznámého izolátu pomocí fenotypových vlastností. • Výběr vhodného kmene pro identifikaci pomocí ENTEROtestu 16. Úvodní slovo Základním předpokladem správné identifikace je práce s čistou kulturou a její základní kultivace pro pomnožení vzorku. U některých vzorků kultivace na diagnostických půdách napovídá, o kterou taxonomickou skupinu se jedná. Identifikace neznámých vzorků bakterií spočívá krok za krokem v hodnocení jejich morfologie (makroskopické a mikroskopické znaky, charakter růstu kolonií, identifikační barvení - Gra-movo, acidorezistentní, tvorba endospor, tvorba pouzdra aj.), fyziologických (vztah ke kyslíku, teplota růstu, rezistence a tolerance k NaCl, žlučovým solím, antibiotikům, typ metabolizmu aj.) a biochemických vlastností (zdroje uhlíku, redukce nitrátů, tvorba indolu aj.). Pokud tyto testy nevedou k úspěšně identifikaci, použijí se doplňující testy, např. serotypizace, fagotypizace, imuno-chemické reakce, chemická analýza buněčné stěny, produkce toxinu, průkaz specifických antigénu, aglutinace nebo genotypizace - PCR reakce, sekvenace 16S rRNA, ribotypizace, hybridizace aj. Testy je možno dělit na několik skupin: sklíčkové (KOH test, katalázový test), zkumav-kové (OF test, TSI test), papírkové (ONPG test, oxidázový test), mikrotesty (ENTEROtest). Destičkové mikrotesty oproti zkumavkovým (jeden test = jedna zkumavka) šetří materiál, energii, čas, prostor a jsou snadno proveditelné. Souprava zpravidla obsahuje reprezentativní soubor 10 až 20 biochemických testů. Mikrotesty pomáhají odstraňovat nesrovnalosti dané individuálními rozdíly v přípravě médií, provedení i hodnocení. K hodnocení se používají diagnostické tabulky a počítačové programy. Testy mají dostatečně dlouhou skladovací dobu. Pro identifikaci se u nás často využívají Mikro-LA-Testy (Erba-Lachema); pro identifikaci gramnegativních fermentujících tyček (čeleď Enterobacteriaceae) se využívá ENTEROtest a ENTERO Rapid, pro identifikaci anaerobů ANAEROtest 23, pro stafylokoky a mikrokoky STAPHYtest 24, pro rozlišení streptokoků a enterokoků STREPTOtest 24, pro identifikaci gramnegativních nefermentujících tyček NEFERMtest 24N. Příklad identifikace neznámého vzorku 1. KOH test - odlišení grampozitivních a gramnegativních buněk 2. Kultivace na MPA a krevním agaru, porovnání vzhledu kolonií a různé teploty kultivace 3. Gramovo barvení, mikroskopie 4. U grampozitivních buněk se hodnotí tvar buněk a další vlastnosti (a) tyčky - po barvení endospor - sporulující (dle vzhledu určíme rod Bacillus), nesporu-lující (Lactobacillus) (b) koky - dle morfologie shluků, hrozníčků (Staphylococcus) dvojic, čtveřic (Micrococcus), balíčků, sarcin (Sporosarcina), řetízků (streptokoky). 108 Uvod do identifikace bakterií, biochemické testy a standardizované identifikační systémy (c) katalázový test - pozitivní např. u rodu Staphylococcus 5. U gramnegativních buněk se hodnotí tvar buněk (gramnegativní koky jsou méně časté, většinou jde o patogeny) a další vlastnosti (a) OF test - bakterie fermentující (fakultativně anaerobní metabolizmus, např. enterobak-terie); bakterie s respiratorním metabolizmem (např. pseudomonády). (b) Oxidázový test slouží k odlišení bakterií s respiratorním a fermentatorním metabolizmem. Čeleď Enterobacteriaceae je klinicky nej důležitější početná čeleď (cca 150 druhů) gramnegativních tyčinek (1-6um dlouhé a 0,3-1 um široké), která je důležitá i pro neklinická odvětí mikrobiologie. Enterobakterie netvoří endospory ani cysty; jsou to nepohyblivé nebo peritrichální, nenáročné chemoautotrofní bakterie. Rostou v rozmezí 18-40 °C s optimem při 37 °C. Čeleď zahrnuje fakultativně anaerobní druhy, většina žije v prostředí a dále často v trávicím traktu obratlovců jako běžná součást mikroflóry. Většina zástupců je nepatogenních, některé druhy jsou však závažnými původci onemocnění. Mezi nejzávažnější patogeny způsobující celkové infekce patří Yersinia pestis, tzv. antropopatogenní serovary salmonel (serovary Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B a Paratyphi C) a některé kmeny Escherichia coli. Protože se střevní enterobakterie spolu s výkaly dostávají do vnějšího prostředí, jejich přítomnost (např. ve vodě) ukazuje na fekální znečištění. Rody se navzájem rozlišují podle acidifikace cukrů a cukerných alkoholů, redukce nitrátů, tvorby sulfanu, hydrolýzy močoviny, KCN-testu, glycerolového testu, tvorby indolu, testu na pohyblivost aj.. Diagnostická média speciálně pro enterobakterie jsou např. Endův a MacConkey agar, deso-xycholát-citrátový agar, Salmonella-Shigella agar, agar s briliantovou zelení, Simmons-citrát agar. Jsou oxidáza negativní (kromě rodu Plesiomonas), tvoří katalázu, vždy štěpí glukózu a redukují nitráty. Testy použité ve cvičení KOH test slouží k rychlému odlišení grampozitivních a gramnegativních bakterií. Hydroxid draselný naruší tenkou peptidoglykanovou vrstvu buněčné stěny u gramnegativních bakterií. Buněčný lyzát tvoří viskózni suspenzi, která se táhne za kličkou. Nelze použít u bakterií tvořících sliz. Kataláza je enzym rozkládající peroxid vodíku na volný kyslík a vodu. Některé bakterie jsou schopny redukovat kyslík na peroxid vodíku, který je pro buňky toxický. Obranný mechanizmus snižující toto poškození spočívá v rozkladu peroxidu vodíku na vodu a kyslík. Pro OF test, test na oxidaci/fermentaci (aerobní/anaerobní metabolizmus), se používá médium s glukózou a acidobazickým indikátorem bromthymolovou modří. Při štěpení glukózy dochází ke vzniku kyselin a vzniká žluté zbavení (pozitivní reakce), v zásaditém prostředí indikátor modrá alkalizací a při neutrální reakci je barva média zelená. Médium ve 2 zkumavkách (bez parafinu pro aerobní podmínky, s parafinem pro zajištění anaerobních podmínek) je očkováno vpichem, ve sloupci je možno odečíst i pohyb bakterií. Pozitivní oxidaci i fermentaci glukózy (obě zkumavky žluté) mají fakultativně anaerobní mikroorganizmy. Pozitivní oxidací a zároveň negativní fermentací glukózy se vyznačují aerobní nefermentující druhy, např. Pseudomonas. Negativní oxidaci i fermentaci glukózy mají druhy, které glukózu nefermentují a ani aerobně neštěpí. Glukóza vstupuje do buňky a je dále kataboli-zována. Některé mikroorganizmy katabolizují glukózu oxidatívne za tvorby oxidu uhličitého a vody. Většina však katabolizuje glukózu fermentativně bez použití kyslíku, někdy i v přítomnosti kyslíku. Mikroorganizmy jsou schopny kromě glukózy fermentovat další monosacharidy, disacharidy či polysacharidy. Koncovými produkty fermentace jsou malé organické molekuly, obvykle organické kyseliny (např. kyselina mléčná). Některé mikroorganizmy vytvářejí při fermentaci plyny (vodík, oxid uhličitý). Tvorba kyseliny a plynu se testuje pomocí fermentační zkumavky. Pro zkvašování cukrů platí následující pravidla: pokud kultura nekvasí glukózu, nekvasí ani jiný cukr. Úvodní slovo 109 TSI test (tripple-sugar iron) slouží pro stanovení využití laktózy, glukózy, sacharózy a produkci H2S pomocí indikátoru železa podle Hajný či jiných plynů. Jako indikátor okyselování cukrů se využívá acidobazická bromkrezolová červeň, indikátor produkce H2S je železo. Některé bakterie uvolňují sirovodík z aminokyselin obsahujících síru. Některé enterobakterie tvoří sirovodík redukcí kyslíkatých sirných sloučenin. Produkce sirovodíku je detekována pomocí síranu železnatého (vytváří se černý, nerozpustný sulfid železnatý). Při produkci plynu kvašením glukózy dole ve zkumavce vznikají bubliny. Médium je očkováno vpichem a po šikmé části agaru tzv. hádkem. Využití glukózy jako zdroje uhlíku a energie se posuzuje ve sloupci, využití laktózy a sacharózy v šikmé části agaru. Oxidázový test identifikuje organizmy, které vytvářejí enzym cytochrom c oxidázu (poslední enzym dýchacího řetězce) účastnící se přenosu elektronů v elektronovém transportním řetězci aerobních bakterií na kyslík. Oxidázové činidlo obsahuje chromogenní oxidačně-redukční činidlo, které oxidací mění barvu do modré až tmavě fialové. Test se používá k diferenciaci druhů rodu Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium. Oxidáza pozitivní jsou např. Pseudomonas ae-ruginosa, P. putida, P. fluorescens, Plesiomonas atd. ONPG test slouží k důkazu produkce fi-galaktozidázy, která štěpí laktózu. K provedení testu je používán bezbarvý o-nitrofenyl-fi-D-galaktopyranozid, který je v pozitivním případě hyd-rolyzován na žlutý ortho-nitrofenol. ENTEROtest 16 se využívá pro identifikaci fermentujících (pozitivní test fermentace, negativní oxidázový test) zástupců čeledi Enterobacteriaceae izolovaných např. na Endově agaru. Jedná se o komerční systém 16 jamkových testů ve 2 řádcích. Na jedné destičce je možno zpracovávat 6 kmenů. Test je doplněn papírkovým testem pro přítomnost oxidázy. Potvrzení čeledi se provádí testem na fermentaci glukózy. Pro odlišení od čeledi Vibrionaceae se provádí oxidázový test, vibria či aeromonády jsou oxidáza pozitivní. Nejčastější příčiny neúspěšné identifikace jsou kontaminace vzorku, jiná hustota nebo objem suspenze, kápnutí inokula do sousední řady nebo činidla do jiného sloupce, druh nebo atypický kmen, jehož údaje nejsou uvedeny v tabulce. Testy v jamkách: produkce sirovodíku (H2S), dekarboxylace lysinu (LYS), produkce indolu (IND), dekarboxylace ornithinu (ORN), rozklad močoviny (URE), deaminace fenylalaninu (PHE), hydrolýza eskulinu (ESC), utilizace citrátu (SCI), utilizace malonátu (MAL), produkce kyseliny z inositolu (INO), adonitu (ADO), celobiózy (CEL), sacharózy (SUC), sorbitolu (SOR), trehalózy (TRE), mannitolu (MAN). Protože se v prostředí běžně vyskytují bakterie s vnitrodruhovou variabilitou fenotypových znaků, přechází se od identifikačních klíčů, které uváděly pouze pozitivní či negativní reakce, k tabulkám, které obsahují procento kmenů daného druhu, u něhož je test pozitivní. Při vyhodnocení se výsledky (+ či —) zapisují pod příslušné reakce (obr. 56), případně se využije automatizovaného readeru pro odečet s následným vyhodnocením pomocí příslušného softwaru. Každá reakce má pod svým označením uvedenu číslici, která slouží pro výpočet číselného kódu. Pokud je reakce pozitivní, hodnotu číslice přičteme. Pokud je reakce negativní, číslici nebereme v potaz, tzn. neodečítáme. Číselné kódy slouží ke snadnějšímu vyhodnocení a orientaci v tabulkách. 110 Uvod do identifikace bakterií, biochemické testy a standardizované identifikační systémy MIKRCH&TES7* ENTEROtest 16 ErUa Lactiorna mo. Karásek 1d 621 33 Brno, CZ ENTERQle&l 16 ľ ..r nono a ířlp/Crprtři 1 ftao*h,'RiÄdok'S:rip c'í»i 2 h HjS : G LVS 4 F IND E OfW D URE 4 c PHE 1 B 2 A SCI M UAL 1 G INO 2 P M» J CEL 0 suc SOS p TRE 2 ÔXI ■ - - .-■ -■ 4- + — - - - - -f - — 1 0 4. O MIKRO©TEST* ENTEROtest 16 r^ijiiTimn.irwiri^i i Eľba Lagherna ;r« KarÉMfc Id 621 33 Bmo. CZ ŕi ŕ Sírni h- V*, Ať ENTEFtOtEst 16 ■ : ■ Pum k . rp««fi i Oonocta N 0 F E D c B H G F E a c B ■■■■ DNF H,S LYS ■NO om URE PKE •Cl UAL INO MX> CEL suc SOR TRE MAN 1 2 .1 1 í 4 1 2 1 2 4 ■ a 4 1 2 r -r + - — +■ © J. Kopecká, G. Rotková Obr. 56: Vyhodnocení ENTEROtestu 16 (archiv autorek) Pro vyhodnocení lze využít program TNW, který u vybraného výsledku vypočte identifikační skóre a T index. Identifikační skóre je míra výlučnosti identifikace, procento pravděpodobnosti, že kmen náleží právě k tomuto taxonu (druhu) a žádnému jinému: > 99 % je výborné odlišení; 96-99 % značí velmi dobré odlišení; 90-96 % kmen je odlišen a < 90% značí neodlišený kmen. T index určuje typičnost identifikovaného kmene vzhledem k vypsanému taxonu. Čím vyšší T index, tím podobnější je daný kmen obecné charakteristice daného taxonu: > 75 typický kmen; 0,5--7, 75 méně typický kmen; 0,25-0,5 netypický kmen; < 0, 25 zcela netypický kmen. Pro atypický kmen program TNW doporučí další rozlišující testy, případně ukáže nestandardní výsledky. Jako kontrola kvality použitých chemikálií a kontrola interpretace barevných reakcí se používají kontrolní kmeny bakterií, které dávají standardní výsledky. Kontrolní kmeny jsou dodávány Českou sbírkou mikroorganizmů v lyofilizovaném stavu nebo na želatínových discích. Závěrem je třeba zdůraznit, že neznámý izolát je vždy nutné posuzovat komplexně, tzn. přihlédnout k charakteru růstu kolonií, optimálním kultivačním teplotám, původu vzorku, druhu materiálu a nakládání se vzorkem. Seznam přístrojů a mikroorganizmů 111 Seznam přístrojů a mikroorganizmů Pomůcky a chemikálie • Sterilní destilovaná voda, fyziologický roztok • Očkovací kličky, podložní sklíčka, automatické pipety • Mikrotest ENTEROtest 16 • Oxidázové a ONPG proužky • 3 % peroxid vodíku, 3% KOH Mikroorganizmy • Neznámý bakteriální kmen Postup Ve cvičení se používá kombinace testů, některé jsou pouze demonstrační pro odečtení výsledků. KOH test • Do kapky 3% KOH na podložním sklíčku nanést kulturu. • Pokud kultura po rozmíchání kličkou tvoří viskózni suspenzi, která se táhne se za kličkou (lyže stěny a vylití obsahu buňky), je kultura gramnegativní (obr. 57). Obr. 57: Provedení KOH testu u gramnegativní kultury (viskózní suspenze táhnoucí se za kličkou) (archiv autorek) 112 Uvod do identifikace bakterií, biochemické testy a standardizované identifikační systémy Katalázový test • Do kapky 3% H2O2 na podložním sklíčku nanést kulturu. • Pozitivní test se ihned projeví uvolňováním bublinek kyslíku (obr. 58) Obr. 58: Provedení katalázového testu (archiv A. Vávrové) OF test, test na oxidaci/fermentaci glukózy (aerobní/anaerobní metabolizmus) • Test je demonstrační pouze pro odečet výsledků. Pro každý kmen jsou připraveny 2 zkumavky, jedna s parafinem (anaerobní prostředí pro zkvašování glukózy) a jedna bez parafinu (aerobní prostředí pro oxidatívni využívání glukózy). • Žluté zbavení média značí pozitivní reakci; modrá a zelená barva média značí negativní reakci (obr. 59). Ve sloupci je možno odečíst i pohyb bakterií. Obr. 59: Vyhodnocení OF testu. Obě reakce pozitivní (žluté) - kmen využívá glukózu jak aerobně, tak anaerobně; pozitivní aerobní reakce, negativní anaerobní reakce - kmen je schopen glukózu využívat pouze aerobně; obě reakce negativní (zelené až modré) - kmen nevyužívá glukózu jak aerobně, tak ani anaerobně (archiv autorek) TSI test (tripple-sugar iron) • Test je demonstrační pouze pro odečet výsledků. • Médium ve zkumavce je očkováno vpichem a vzápětí rovně šroubovitým roztěrem po šikmém agaru v jediné zkumavce. Postup 113 • Sleduje se zabarvení média a roztrhaní agaru (obr. 60). Zkvašuje-li kultura pouze glukózu, zežloutne pouze sloupec a šikmá plocha zůstane červená (např. salmonely). Pokud bakteriální kultura zkvašuje současně s glukózou laktózu nebo sacharózu, zežloutne sloupec i šikmá část agaru. Produkce H2S se projeví zčernáním média ve sloupci (pozor na odečet fermentace glukózy, kdy černá barva překryje žlutou!). Potrhání agaru či jeho nadzvednutí značí tvorbu plynu (CO2) z glukózy. Obr. 60: TSI test (archiv autorek) Oxidázový test • Na detekční zónu proužkového testu plastovou kličkou (NE kovovou!) nanést 24hodinovou kulturu nebo papírek přímo zatlačit do kultury. • Médium, ze kterého se kultura odebírá, nesmí obsahovat glukózu nebo nitráty. • Pokud reakční plocha do 30 sekund intenzivně modrá, je reakce pozitivní; pokud zmodrá do 2 minut, je reakce opožděně pozitivní. Pokud zůstane barva beze změny nebo se objeví reakce po 2 minutách, reakce je negativní (obr. 61). Obr. 61: Oxidázový test (archiv autorek) 114 Uvod do identifikace bakterií, biochemické testy a standardizované identifikační systémy ENTEROtest 16 • Pro ENTEROtest je důležité vybrat vhodný kmen, tzn. kmen, který pravděpodobně patří do čeledi Enterobacteriaceae (gramnegativní, kataláza pozitivní, fermentuje i oxiduje glukózu, oxidáza negativní). • Z 24 hodinové kultury připravit suspenzi buněk ve 3 ml fyziologického roztoku se zákalem o hodnotě 1 podle stupnice McFarlanda. • Destičku orientovat na výšku, odříznout krycí folii a označit destičku číslem kmene. • Pipetovat 100 ul důkladně protřepané suspenze do každé jamky příslušného řádku. • Některé testy probíhají v anaerobních podmínkách, příslušné jamky zakápnout dvěma kapkami sterilního parafinového oleje: test pro sirovodík (H2S), lysin (LYS), indol (IND), ornitin (ORN), ureáza (URE), arginin (ARG). • Testy před kultivací uložit do sáčku, aby jamky nevysychaly. • Kultivace probíhá při 37 °C po dobu 18 až 24 hodin. • Při hodnocení zakápnout jamku (IND) činidlem pro indol, jamku (PHE) činidlem pro feny-lalanin a jamku (VPT) činidlem pro acetoin dle návodu. • Odečíst všechny reakce ENTEROtestu (obr. 62), fenylalanin do 3 minut, protože po této době pozitivní reakce mizí. Orientovat se dle interpretační tabulky (obr. 63) přiložené k soupravě (případně dle barevné srovnávací stupnice). I O ~n m o o m j> • Jat *° fc- • H,S JEgj IND