Bezpečnost práce
Organizace cvičení
Měření MO
ÚVOD PODZIM 2022
Bezpečnost práce
 Příchod a odchod z laboratoře
 MYTÍ RUKOU, DEZINFEKCE PLOCHY
 Kahany pouze pokud jsou používány a jste v místnosti
 Nesahat na kultury do misky
 Na stole nádobky – dezinfekce, kelímek na použité špičky, kelímek na použité sirky,…
 Lékárnička, hasicí přístroj, hasicí deka
 Laboratorní sklo a pomůcky (misky, kličky, sklo x umělá hmota)
 KONTAMINACE (sebe i kultur) - snažit se jí předcházet!!!
Pokud by se něco rozbilo či rozlilo (miska/bujon s kulturou), NEJPRVE MÍSTO
DEZINFIKUJEME!!
Zásady bezpečné práce
v mikrobiologické laboratoři
 1. Vstup do laboratoře je povolen pouze osobám vykonávajícím cvičení.
 2. V laboratoři vykonávejte pouze práci stanovenou obsahem cvičení.
 3. V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit.
 4. V laboratoři je nutné používat laboratorní plášť a přezůvky.
 5. V laboratoři je zakázáno otevírat okna. Větrání je zajištěno pomocí větracího zařízení.
 6. Před příchodem do laboratorního cvičení se seznamte s jeho obsahem.
 7. Před započetím a po ukončení práce je třeba desinfikovat pracovní plochu (Incidur).
Zásady bezpečné práce
v mikrobiologické laboratoři
 8. Na pracovní plochu pokládejte co nejméně osobních věcí. Na pracovní ploše může
snadno dojít k jejich kontaminaci. Oblečení, batohy a tašky odkládejte v šatně.
 9. Pracujte pečlivě a opatrně. Zabráníte tím kontaminaci materiálu a náhodnému
potřísnění pracovní plochy a sebe bakteriálními kulturami.
 10. Nedotýkejte se zbytečně rukama obličeje, nenanášejte v laboratoři kosmetiku,
nemanipulujte s kontaktními čočkami.
 11. Při barvení mikroorganismů používejte jednorázové ochranné rukavice a pracujte v
digestoři. Při fixaci preparátů používejte ochranné brýle. Ochranné rukavice není nutné
používat při manipulaci s mikroorganismy, pokud se však budete cítit bezpečněji, použijte
je. Výjimkou je příprava nativního preparátu pro mikroskopii, v tomto případě určitě použijte
rukavice.
Zásady bezpečné práce
v mikrobiologické laboratoři
 12. Kahany nechávejte hořet pouze po dobu, kdy je užíváte.
 13. Použité sklo a zbytky bakteriálních kultur odkládejte na určená místa. V žádném případě
nevylévejte kultury do odpadu! Veškerý kontaminovaný materiál je před likvidací a mytím
nutno desinfikovat nebo sterilizovat (týká se i rozbitého skla), případně vyhodit do koše na
nebezpečný odpad (např. buničitá vata použitá k likvidaci rozlité kultury).
 14. Dojde-li k náhodnému potřísnění pokožky bakteriální kulturou či poranění pokožky, oznamte
tuto skutečnost ihned školiteli. Pokožku je nutno ošetřit vhodným desinfekčním prostředkem
(ajatin, Spitaderm), aby nedošlo k infekci.
Zásady bezpečné práce
v mikrobiologické laboratoři
 15. Stejné zásady jako v bodě 14 platí i v případě znečištění pracovní plochy nebo pracovního
oděvu.
 16. V případě jakékoli nejistoty se informujte o správném postupu u svého školitele.
 17. Označte všechna média a kultury ve zkumavkách, baňkách a Petriho miskách názvem média a
kultury, svým jménem a pracovní skupinou. Misky popisujte na dno! K označení používejte fixy na
sklo.
 18. Všechny pracovní postupy, obzvláště pak použité bakteriální kultury, množství pipetovaných
roztoků a postupy při ředění si pečlivě zaznamenávejte.
 19. Po ukončení práce odneste použité pomůcky na určené místo, ukliďte pracovní plochu a
vydesinfikujte ji desinfekčním roztokem (Incidur ve spreji).
Zásady bezpečné práce
v mikrobiologické laboratoři
 20. Před odchodem ze cvičení si dobře umyjte ruce a vydesinfikujte desinfekčním
prostředkem (Spitaderm). V případě, že potřebujete krátkou přestávku v průběhu cvičení,
umyjte a vydesinfikujte si ruce před opuštěním laboratoře.
 21. Práce v mikrobiologické laboratoři je zakázána těhotným ženám. Posluchačka je povinna
vedoucímu cvičení oznámit graviditu.
 22. Připojování přístrojů do elektrické sítě je nutno provádět pod dohledem. Provádění
jakýchkoliv změn na elektrickém zařízení není dovoleno. Opravovat elektrické instalace smějí
jen osoby tím zvláště pověřené, s příslušnou kvalifikací. Závady v instalaci (voda, plyn,
elektřina) ihned hlaste.
Pokyny k zápočtu
 Zápočet
 docházka, protokoly, zápočtový test
 Protokoly
 pozn.: závěr = stručné shrnutí, úvaha nad výsledky pokusu, případně odpovědi na otázky
 protokoly odevzdávat průběžně – od druhého neodevzdaného protokolu v předem
oznámeném termínu záporný bod – zvýšené požadavky k zápočtovému testu
 Docházka
 povinná účast
S sebou do laboratoře PLÁŠŤ, PŘEZŮVKY, PERMANENTNÍ FIX NA SKLO
Sylabus
Mikrobiologie - cvičení Bi5710c PODZIMNÍ SEMESTR 2022
Cvičení Týden Úloha
1 12. 9. - 16. 9. 2022 Úvod. Bezpečnost práce. Organizace cvičení. Seznámení s mikroskopem. Mikroskopie. Měření MO.
2 19. 9. - 23. 9. 2022
Metody sterilní práce. Očkování a uchovávání mikroorganismů. Živná média pro růst mikroorganismů. Technika křížového roztěru.
Očkování do tekutého media a na pevné medium.
3 26. 9. - 30. 9. 2022 Výuka neprobíhá – platí pro všechny skupiny kvůli jednotné výuce pro všechny studenty (ve st 28. 9. 2022 je svátek)
4 3. 10. - 7. 10. 2022
Makro - a mikroskopické pozorování mikroorganismů (kultury z předchozího cvičení). Gramovo barvení. Demonstrační pokus
nativního preparátu
5 10. 10. - 14. 10. 2022 Přímé stanovení počtu buněk v Bürkerově komůrce. Vitální test. Kvasinky.
6 17. 10. - 21. 10. 2022 Nepřímé stanovení počtu životaschopných bakterií plotnovou metodou. Malování.
7 24. 10. - 28. 10. 2022 Bakterie ve vodě - základní mikrobiologický rozbor vody.
8 31. 10. - 4. 11. 2022 Vyhodnocení vody. Průkaz a izolace některých půdních mikroorganismů.
9 7. 11. - 11. 11. 2022
Hodnocení zastoupení některých mikroorganismů v půdě. Pozorování bakteriálních spor rodu Bacillus - fázový kontrast - nativní
preparát. Negativní barvení rodu Bacillus, negativní barvení pouzder rodu Azotobacter.
10 14. 11. - 18. 11. 2022 Stanovení citlivosti bakterií k antibiotikům. Stanovení koncentrace antibiotik.
11 21. 11. - 25. 11. 2022 Fyzikální a chemické prostředky kontroly růstu.
12 28. 11. - 2. 12. 2022
Úvod do identifikace bakterií - biochemické testy a standardizované identifikační systémy (zkumavkové testy, papírkové testy a
mikrotesty).
13 5. 12. - 9. 12. 2022 Vyhodnocení biochemických testů. Odevzdání protokolů. Test
14 12. 12. - 16. 12. 2022 Termín pro případné konzultace k protokolům, opravný termín testu
Laboratorní pomůcky
Seznámení
s mikroskopem,
měření MO
MIKROSKOP – ZÁKLADNÍ
CHARAKTERISTIKY
 původ slova - z řeckého slova mikros - malý a skopein - pozorovat
 první použitelný mikroskop (1590) - Hans a Zacharias Jansennovi
 Anthony van Leeuwenhoek (1632 - 1723) zkonstruoval jednočočkový mikroskop
zvětšující asi 270x
 nejvýznamnější vynálezci a vědci v oblasti optiky 19. století –
 Ernst Abbe (teoretická studie optických principů), Otto Schott (výzkum optického
skla), August Köhler (osvětlení mikroskopů) a Carl Zeiss (zahájení výroby
mikroskopů v roce 1847)
MIKROSKOP - ZÁKLADNÍ
CHARAKTERISTIKY
 části mikroskopu
 mechanické části tvořené stativem s podstavcem, stolkem se svorkami
na upnutí preparátu, mikrometrickým a makrometrickým šroubem
 optické části tvořené okuláry, binokulární hlavicí, objektivy a
kondenzorem
Školní mikroskop
Olympus CX31
MIKROSKOP -
ZÁKLADNÍ
CHARAKTERISTIKY
MIKROSKOP - ZÁKLADNÍ
CHARAKTERISTIKY
 Celkové zvětšení mikroskopu (CZM)
 je to zvětšení, jehož jsme schopni dosáhnout při dané sestavě
optiky mikroskopu; lze jej vypočítat pro každý objektiv
 vypočítáme ho podle vzorce:
 CZM = zvětšení okuláru . zvětšení binokulární hlavice .
zvětšení objektivu
MIKROSKOP - ZÁKLADNÍ
CHARAKTERISTIKY
 Maximální užitečné zvětšení (MUZ)
 je to ideální zvětšení pro pozorování objektů v mikroskopu pro daný objektiv; může
se lišit od celkového zvětšení
 vypočteme podle vzorce: MUZ = 1000 × A
 numerická apertura (A) (apertura = otvor), rozlišovací schopnost objektivu, je dána
vzorcem:
 A = n . sin
𝛼
2
 kde n = index lomu prostředí mezi objektivem a preparátem
 𝛼 (alfa) = úhel svíraný optickou osou mikroskopu a pláštěm kužele, v němž se nacházejí paprsky,
které z daného místa preparátu mohou vstoupit do objektivu a podílet se na zobrazení
MIKROSKOP - ZÁKLADNÍ
CHARAKTERISTIKY
 Nejmenší rozlišitelná struktura
 jde o vlastnost objektivů rozlišit dva od sebe nepatrně vzdálené body
ještě jako dva samostatné body
 vypočte se podle vzorce: 𝑹=𝛌 . 𝑨 [ μm ]
 kde A = numerická apertura
 λ (lambda) = vlnová délka použitého světla
 čím větší je numerická apertura a čím kratší je vlnová délka, tím je
lepší rozlišení (tj. menší minimální vzdálenost mezi dvěma body)
MĚŘENÍ MIKROORGANISMŮ
 buňky měříme okulárovým mikrometrem
 jeho stupnice se musí proměřit pro každé zvětšení
objektivovým mikrometrem, aby se stanovila relativní
hodnota dílku okulárového mikrometru
 objektivový mikrometr je podložní sklíčko se stupnicí
uprostřed vodícího obrazce (kruh nebo čtverec).
 stupnice je dlouhá 1 mm a je rozdělena na dílky, z nichž
každý má hodnotu 10 μm.
MĚŘENÍ MIKROORGANISMŮ
 Hodnota dílku okulárového mikrometru
 stupnice obou mikrometrů se seřídí v zorném poli rovnoběžně vedle sebe a počátky
se ztotožní, aby se mohlo zjistit, kolik dílků objektivového mikrometru odpovídá dílkům
okulárového mikrometru
 H = dílky objektivové/ dílky okulárové . 10 [μm ] (např.: 30/45 . 10)
odpovídající dílky
se musí přesně krýt
MĚŘENÍ MIKROORGANISMŮ
 Výpočet plochy zorného pole
 použijeme objektivový mikrometr - po zaostření stupnice nastavíme
počáteční dílek na levý okraj zorného pole a odečteme, kolik dílků činí
průměr zorného pole
 hodnotu v dílcích vynásobíme hodnotou dílku (10 μm); z průměru
vypočteme poloměr a dosadíme do vzorce: π . r2 pro výpočet plochy
kruhu
 plochu je potřeba vypočítat pro jednotlivé objektivy
MĚŘENÍ MIKROORGANISMŮ
 Měření bakterií
 objektiv 100x zvětšení (imerzní olej)
 preparáty
 vlastní měření provádíme již pouze
okulárovým mikrometrem
 zjištěné hodnoty (délky a šířky) v počtech
dílků pak vynásobíme zjištěnou hodnotou
dílku pro příslušný objektiv
MĚŘENÍ MIKROORGANISMŮ
Objektiv Průměr zorného pole [μm]
10 -
20 1000
40 500
100 200
MĚŘENÍ MIKROORGANISMŮ
Objektiv 1 dílek v okuláru [μm]]
10 10
20 5
40 2,5
100 1