Rostlinná embryologie 2022 Barvení preparátů – ruční a parafínové řezy Barviva: Toluidinová modř (1 % roztok v destilované vodě – 1 g/100 ml) Safranin O (0.5% (w/v) roztok v 50% ethanol – 0,5 g/100ml) Safranin O ve vodě (1% (w/v) – 1 g/100 ml) Safranin/Fast Green – safranin (1 g/l ve vodě), Fast Green (0.1 g v 100 ml 96% ethanolu) Safranin+alciánová modř Safranin: 0.35g safraninu v 35 ml 50% EtOH Alcian Blue: 0.65g Alcian Blue (alciánová modř) v 65 ml destilované vody, Oba roztoky nechat míchat magnetickou míchačkou cca. 1 hodinu, pak slít dohromady, promíchat a zfiltrovat. Označit lahvičku: safranin + alciánová modř, datum výroby. Floroglucinol HCl (2% floroglucinol v 96% ethanolu – 0,2 g/10 ml; 25% HCl – může být i menší koncentrace; roztoky nemÍchat dohromady ) Lugolův roztok (5% (w/v) I[2] 10% (w/v) KI smíchané v destilované vodě) Materiál: Parafínové řezy z předešlé hodiny (odparafinované), řezy z kryotomu Šáchor, stonek (na ruční řezy) Pryšec (kvůli latexu se škrobovými zrny), stonek voděnky (škrobová zrna v chloroplastech) Postupy barvení: Toluidinová modř 1. Žiletkou vytvoříme tenké řezy a ihned je umístíme do kapky vody. 2. Odsajeme pipetou nebo filtračním papírem vodu a ihned zakápneme několika kapkami barvičky. Necháme působit 1-2 minuty. 3. Odsajeme barvičku filtračním papírem a ihned zakápneme vodovodní vodou. Odsajeme vodu se zbytkem barvičky a opakujeme zakápnutí a odsátí vody ještě jednou nebo do té doby, dokud se voda barví modře. 4. Nakonec zakápneme vodou/50% glycerolem, přikryjeme krycím sklem a pozorujeme. Safranin O 1. Žiletkou vytvoříme tenké řezy a ihned je umístíme do kapky vody. 2. Odsajeme pipetou nebo filtračním papírem vodu a ihned zakápneme několika kapkami barvičky. Necháme působit 10 minut. 3. Odsajeme barvičku filtračním papírem a ihned zakápneme destilovanou vodou. Odsajeme vodu se zbytkem barvičky a opakujeme zakápnutí a odsátí vody ještě jednou nebo do té doby, dokud se voda barví červeně (vypláchnutí přebytku safraninu). 4. Nakonec zakápneme vodou/50 % glycerolem, přikryjeme krycím sklem a pozorujeme. Safranin/Fast Green – sukcesivní Roztok Čas* 1 50% ethanol 5 min 2 1 g/l safranin (vodný roztok) 10 min 3 50% ethanol 2x5 min 4 75% ethanol 5 min 5 Fast Green (0,1% v 96% ethanolu) 4 min 6 96% ethanol 5 min** 7 100% ethanol (E) 5 min 8 E:X 1:1 5 min 9 Xylén (X) 5 min 10 Montování do Eukittu *časy barvení jsou orientační, záleží na druhu preparátu, nutno vyzkoušet (preparační mikroskop pro kontrolu) **v tomto bodě stačí opláchnout 96% ethanolem a pak zakápnout 50% glycerolem, přikrýt krycím sklíčkem a pozorovat Safranin+alciánová modř – simultánní Pokud řezy v ethanolu, tak rehydratovat ve vodě po dobu 5 min. Ruční řezy rovnou barvit. 5 min………směs safranin+alciánová modř (viz Barviva) 2x………….opláchnout v destilované vodě Pozorovat nebo trvalý preparát: 2 min……....50% EtOH 2 min……....75% EtOH 2 min……....96% EtOH 1x………….opláchnout v 100% EtOH 1x………….opláchnout v 100% xylenu Namontovat na sklíčko do Eukittu. Lugolův roztok 1. Vytvořte preparát ve vodě a přikryjte krycím sklíčkem. 2. Vedle krycího sklíčka dejte kapku LR 3. Na okraj protější strany krycího sklíčka přiložte filtrační papír – odsátím vody se pod sklíčko vsune LR z kapky vedle sklíčka. 4. Pozorujte pod mikroskopem Floroglucinol HCl 1. Připravte ruční řez do kapky vody. 2. Odsajte filtračním papírem vodu a zakápněte směsí floroglucinol HCl (Wiesnerův roztok). 3. Po 2 minutách odsajte barvičku (při pozorování v barvičce by mohly kyselé výpary poškodit mikroskop) a zakápnětě vodou/50% glycerolem. 4. Ihned pozorujte, barvení postupně mizí (není stálé).