Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cell – ESC) Embryonální zárodečné buňky (Embryonic germ cell – EGC) Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cell – ECC) Kmenové buňky epiblastu (Epiblast stem cell – EpiSC) Early-primitive ectoderm-like – EPL Indukované pluripotentní kmenové buňky (Induced pluripotent stem cell – iPSC (Multipotentní dospělé zárodečné kmenové buňky – maGSC) Pluripotentní, odvozené kmenové buňky ESC ECC EGC (EPL) EpiSC iPSC maGSC looklike Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cell) ESC - jsou odvozené z vnitřní buněčné masy blastocysty - fenotypem odpovídají přibližně buňkám vnitřní buněčné masy (mESC, ICM – inner cell mass) nebo epiblastu (hESC, EpiSC) - jsou pluripotentní - přirozeně neexistují, pouze in vitro - jsou nesmrtelné - mají schopnost si udržet stabilní genotyp (!?) - po injikaci do imunitně tolerantního organismu tvoří teratomy (důkaz pluripotence) - po injikaci do blastocysty mají schopnost tvořit kompletní chiméry (známo jen u mESC (ale také u mECC, mEGC a miPSC), důkaz pluripotence) DBiologystr242 finito Gilbert 1997 / Bílek 2004 Ontogeneze a diferenciační potenciál buněk vnitřní buněčné masy mouseBl-1 ICM Linie ES buněk na feederu MEF 4-5 dní Fibroblastová výživná vrstva „feeder“- tvořená MEF TE Odstranění PEF Homogenní populace ES buněk Esd3_nguprav ES-D3-1uprav Vyseknutí a disociace ICM Izolace myších ES buněk Upraveno podle Kroupová 2004 Imuno-chirurgie 6-8 ddnů IVF TERATOM CHIMÉRA Organismus je směsí geneticky odlišných buněk / tkání / orgánů Chimeričtí jedinci vzniklí injikací ES buněk (dárce) do blastocysty (příjemce) jsou směsí geneticky odlišných buněk na ůrovni všech tkání, a tak také vytváří pohlavní buňky s genotypem jak dárce, tak příjemce! view_14 Nádor, který obsahuje buňky více jak jednoho zárodečného listu, většinou všech tří. Tyto buňky mohou být fenotypu od časných stádií až po terminálně diferencované Teratomy jsou typické nádory původem ze zárodečných buněk (ovariální a testikulární teratomy. Teratomy jsou jak benigní, tak maligní (teratokarcinom) Kmenové buňky teratokarcinomu = embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma (EC) cells) Chimera - ES buňky spontáně diferencují, v kultuře je třeba této diferenciaci zabránit - diferenciace je často spojena s apoptózou - vhodnými kultivačními podmínkami, lze diferenciaci inhibovat - faktory inhibující diferenciaci ES buněk se částečně liší u různých druhů, ale existují výjimky i v rámci jednoho druhu! ES cell mezoderm + entoderm ektoderm A B Obecný model inhibice diferenciace ES buněk feeder (výživná vrstva) auto- a parakrinně působící factory ES cell mezoderm + entoderm ektoderm LIF* BMP-4 (BMP-2 /BMP-12 /FCS nebo SR*) LIF – leukemia inhibitory factor BMP-2,4,12 bone morphogenetic protein 2,4,12 FCS – fetal calf serum Model inhibice diferenciace myších ES buněk - existují i linie mES buněk nezávislé na LIF - zdá se, že z LIF závislé linie, lze vyselektovat LIF nezávislou (!?) - mES buňky pěstované bez „feederu“ ztrácí schopnost tvořit chiméry in vivo - některé linie nelze bez „feederu“ pěstovat vůbec Þvlastnosti mES buněk jsou ovlivněny genotypem imbredního kmene myší z kterého byly izolovány! IGF, (FGF-4), Wnt FGF-4 – fibroblast growth factor SR – serum replacement Feeder* *ABSOLUTNÍ OPTIMUM Růst a kultivace ES buněk PROLIFERACE – DIFERENCIACE - APOTÓSA Existence a charakter ES buněk je udržován kombinací účinků vnějších (extrinsic) a vnitřních (intrinsic) faktorů. Vnější faktory si ES buňky částečně syntetizují samy, ale ve větší míře musí být dodávány. Významným zdrojem těchto faktorů je výživná vrstva na které se ES buňky kultivují = FEEDER. Vnitřní faktory si ES buňky nesou jako pozůstatek svého embryonálního původu. FEEDER - výživná vrstva = zdroj růstových faktorů (cytokiny, ECM, ..) a vhodný podklad - nejčastěji se používají myší embryonální fibroblasty (13d p.c., MEF (PEF)) - bez „feederu“ z MEF = definované podmínky, ale horší ES buňky - tendence používat druhově identické MEF = sníženi rizika přenosu virů, … - MEF lze nahradit i jinými typy fibroblastů případně jinými buňkami - MEF lze částečně nahradit komponenty ECM, specifickými cytokiny a přídavky, matrigelem,…, obecně definovanějšími preparáty Důležitou komponentou kultivačního média pro ES jsou také nedefinované faktory séra, které lze nahradit dodáváním specifických růstových faktorů. Často se také používá tzv. Serum-replacement = lépe definovaná náhražka séra (patentované složení). ES cell mezoderm + entoderm ektoderm FGF-2 Activin/Nodal Noggin Wnt FCS? Model inhibice diferenciace lidských ES buněk + MEF (feeder) nebo matrigel/vitronectin/atd.. IGF, ?, Wnt, FGF-2 ? FCS – obsahuje jak difereciaci indukující, tak diferenciaci inhibující faktory. Kvalitu FCS také ovlivňuje titr protilátek a složek koplementu. FCS se liší mezi jednotlivými šaržemi = je třeba je testovat. Lépe je používat náhrady FCS se sníženou koncentrací negativně působících látek na kultivaci ES buněk, např. Serum-Replacement ( fy. Invitrogene-Gibco) OPTIMUM??? Základní vnitřní faktory charakterizující / regulující ES buňky (pluripotentní embryonální buňky) Oct-4 (Oct-3/4, Oct-3, Pou5f1 – master of pluripotency) - transkripční faktor, homeoprotein - exprimuje se již u 2/4 (myš – aktivace transkripce) buněčného embrya - ve stádiu moruly je jeho exprese výrazně zvýšena - ve stádiu blastocysty je pouze v buňkách ICM - později jeho exprese vymizí, zachovává se pouze v PGC (a později v zárodečných buňkách) - (nebyl nalezen u kuřat) - reguluje expresi FGF-4 (Oct-4/Sox-2), PDGFa, …. - v průběhu diferenciace za snížení jeho exprese odpovídá GCNF( germ cell nuclear factor, RA (retinoic acid),… - v primitivním ektodermu je exprese Oct-4 podporována LRH-1 (liver receptor homologue 1) - speciální varianta vzniklá alternativním sestřihem, se ale exprimuje i u MF Sox2-20674-HMG_box-1gt0D Nanog - transkripční faktor, homeoprotein - jeho exprese vede k udržení vysoké hladiny Oct-4 - objevuje se již ve vnitřních buňkách moruly - později se zdá být nezbytný zejména pro specifikaci PGC! - (výskyt i u některých progersivních nádorů (?!)) Sox-2 - Transkripční faktor Sry-rodiny (sex-determining region Y protein) - Kooperuje s Oct-4 na vlastní expresi - V průběhu indukce neurální diferenciace se jeho exprese zvyšuje Nanog-Homeobox-Protein-(NANOG)-98992 Boiani & Scholer 2005 Potencionální mechanismus účinků LIF u mES buněk LIF/gp130/LIFR Jak2/STAT3 PI3K/Akt + Erk Nanog Klf4 Sox2 Tbx3 Oct4 Niwa 2009 090708 An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is 1741-7007-8-125-1.jpg Krüppel-like transcription factors and control of pluripotency. Bourillot PY, Savatier P. BMC Biol. 2010 Sep 27;8:125 a)standard protocol b)3i/LIF protocol c)2i/LIF protocol LIF (indukce STAT3) SU5402 (inhibice FGF-R) PD0325901 / PD184352 (inhibice Erk signalizace) CHIR99021 (inhibice GSK3, aktivace Wnt signalizace) Alternativní kultivace mES protocol 2i/LIF, 3i/LIF (A. Smith laboratory) Wnt a mES Niwa 2011 Pan2006 Boyer2005 Regulace transkripce faktory Oct-4, Nanog a Sox-2 Předpokládaný model vzájemné regulace exprese FoxD3, Nanog a Oct-4 u mES. FOxD3 není exprimován u hES. Model vzájemné regulace Oct-4, Nanog a Sox-2 a některé jimi řízené geny u hES. Promotory genů Proteiny Vzájemná regulace Oct-4 a Nanog není dosud plně objasněna. Je však již jasné, že Oct-4 řídí transkripci Nanog přímou vazbou v jeho promotoru (společně se Sox-2), jak u mES tak hES. Pro self-renewal ES buněk je klíčové zachovat rovnováhu v hladinách Oct-4 a Nanog (viz. níže). Promotorové sekvence rozpoznávané Oct-4, Nanog a Sox-2 u hES. Figs2 Příklady vývojově významných genů pod kontrolou heterodimeru Oct4/Sox2 Zhou et al., 2007 Oct4/Sox2/Nanog zprostředkované regulace u mES buněk Ztráta pluripotence u ES buněk v důsledku deregulace rovnováhy mezi hladinou Oct-4 a Nanog Chamber, 2004 Johnson 2006 ES BUŇKY a)myší ES (mES) x b) lidské ES (hES) (LIF / gp130* / STAT3 dependent) (LIF / gp130* / STAT3 independent) Toto rozdělení je pravděpodobně dáno možností některých živočišných druhů mít skrytou březost ve stádiu blastocysty (embryonální diapauza). Rao, 2004 mESC PGC (h/m) EGC (h/m) gp130 signalling dependent / STAT3 somatické SC ?? pluripotent multipotent a méně embryonální diapauza (myš / lasicovití) hESC/mEpiSC mouse Signální dráha gp130 ->-> STAT3 ve vztahu k pluripotentním buňkám u člověka a myši Současné studie ukazují, že za regulaci diapauzy je odpovědná zejména matka => u každé blastocysty lze navodit diapauzu !? (G.E. Ptak et al., PLOS One 2012) Některé charakteristické znaky myších a lidských ES buněk mESxhES kopie ‡Glykolipidy, § Keratan chondroitin sulfát proteoglycan, ITetraspannin transmembránové proteiny, AP – alkalická fosfatáza, EB – embryoidní tělísko, ESC – embryonální kmenové buňky, SSEA – vývojově specifický embryonální antigen (stage-specific embryonic antigen), TRA – antigen odmítnutí nádoru (tumor-rejection antigen), NR – nestudováno (not reported) 773ÔÇô89_05_0001 + mES - hES / mEpiSC - mES + hES / mEpiSC Signální dráha TGFbeta / BMPs u ES buněk Kmenové buňky epiblastu – EpiSC (Epiblast stem cell) Brons, 2007 & Tesar, 2007 Kmenové buňky epiblastu – EpiSC (Epiblast stem cell) Brons, 2007 & Tesar, 2007 EpiSC - neintegrují se do moruly a blastocysty => rozdíl s mES - netvoří kompletní chiméry - nebyla detekována aktivní alkalická fosfatáza (AP) (mES, hES, EC, EG, PGC, mají aktivní AP) - EpiSC částečně vysvětlují rozdíly mezi mES a hES Kmenové buňky epiblastu – EpiSC (Epiblast stem cell) Brons, 2007 & Tesar, 2007 Gadue 2005 mES je možno reverzibilně převést na buňky připomínající buňky primitivního ektodermu tzv. EPL (early-primitive ectoderm-like) buňky. Tyto buňky již nemají podobně jako buňky primitivního ektodrmu schopnost tvořit buňky parietálního entodermu. Také některé jejich další schopnosti diferencovat, jsou oproti ES buňkám pozměněny (Pelton 2002) . EPL (+ FGF-5*) ES (- FGF-5*) +LIF - LIF + HepG2 buňkami kondiciované médium *EPL buňky jsou podobně jako buňky primitivního ektodermu exprimují FGF-5 na rozdíl od ES buněk, které exprimují zejména FGF-4 (platí pro myš) Metylace DNA a kondenzace chromatinu u ES buněk Meshorer & Misteli 2006 j Epigenetika ES buněk Proliferace ES buněk Stránky z sc S laskavým nedovolením z katalogu Santa Cruz Biotechnology, Inc. sejmout0006 sejmout0005 - ES buňky relativně intenzivně proliferují (podobné nádorovým buňkám) - G1 fáze buněčného cyklu je krátká (u mES ~ 1.5 h), zdá se, že chybí G1-checkpoint* - velké procento buněk je v S fázi buněčného cyklu (mES > 60%, hES > 50%) - doubling time mES ~ 10-12h, hES ~ 18-20h - specifická charakteristika regulace buněčného cyklu (odolnost k p16, nízká hladina cyklinů D, vysoká hladina cyklinu E, není potřeba proteinů rodiny Rb) - inhibice proliferace, prodloužení G1 fáze (suboptimální podmínky) vede k diferenciaci a apoptóse, diferenciace a apoptósa ES buněk, však nemusí vést ke snížení proliferace jako takové *tzv. kontrolní bod R, o průchodu tímto bodem rozhodují zejména mechanismy rozpoznávající itegritu/neporušenost genomu, buňky s požkozenou DNA jsou za normálních okolností v tomto bodě zastaveny. Porucha tohoto kontrolního mechanismu je typická pro nádorové buňky. A short G1 phase is an intrinsic determinant of naïve embryonic stem cell pluripotency. Coronado D, Godet M, Bourillot PY, Tapponnier Y, Bernat A, Petit M, Afanassieff M, Markossian S, Malashicheva A, Iacone R, Anastassiadis K, Savatier P. Stem Cell Res. 2013 Jan;10(1):118-31 Zpomalení proliferace a prodloužení G1 fáze vede k diferenciaci ES buněk Rozdílné proporce v jednotlivých fázích cyklu u časných embryonálních buněk Chromosomální stabilita a ES buňky Draper, 2004; Hanson, 2005 - dlouhodobá kultivace ES buněk vede k selekci odolnejších klonů a subpopulací - menší responzivnost na vnější signály, rychlejší proliferace, menší nároky na kultivaci, klíčové znaky často zachovány (Oct-4, Nanog, příslušné SSEA,...) - u myší snížena schopnost tvorby chimér a zéjména germline u těchto chimér - často spojeno s genetickou manipulací (knock-out, -in ES linie) - nestabilita chromosómů, polyploidie, trizomie, zlomy a přeskupování genů => adaptace na in vitro podmínky - hES, primární je trizomie chromozomu 12 nebo 17, vzácněji chromosomu 14 a 20 - často dochází i ke zdvojení dlouhého raménka chromosomu 17 a k translokaci této kopie na dlouhé raménko chromosomu 6 => posílení exprese genů na chromosomu 17 (Survivin – proti apoptóse, STAT3 – self-renewal mES a nadbytek u většiny nádorů, GRB2 a 7 (growth factor receptor bound protein, viz. signální transdukce)) - na chromosomu 12 je lokalizován nanog (Nanog) - časté i změny malých oblastí na chromosomech 1, 8, 18 a 20 - u mES se jedná o změny zejména chromosomů 8 a 11 (myší chromosom 11 je z části ekvivalentní k lidskému chromosomu 17) Apoptická kontrola nestability karyotypu a ES buňky Checkpoint-apoptosis.... of karyotipic instability. Mantel, 2007 - u zdravých somatických buněk při poruchách mitotického aparátu během jejich dělení a tak vznikající chyby v mitóse vedou k jejich přechodu do senescentního stavu nebo k indukci apoptósy - ES buňky mají zvýšenou toleranci k poruchám mitózy, menší citlivost tzv. SAC (SAC – splindle assembly checkpoint) => akumulace aneuploidních a polyploidních buněk v populaci - indukcí diferenciace lze tyto buňky částečně eliminovat (apoptósa) - tetraploidní buňky (blastomery) mohou tvořit jen trofoblast => G1 MTA/tetraploidity checkpoint => využití při tvorbě embryí plně ES původu Příklad nárůstu apoptósy s diferenciací a požkozeným mitotickým aparátem ES – embryonální kmenové buňky EB – ES diferencovanou formou embryoidních tělísek Noc/NOC – nocodazol PAC - paclitaxel Jak vypadá správná ES buňka? Jsou všechny ES buňky v kultuře stejné? Davey2006_40_0001 Davey, 2006 Fortunel, 2003 LIF -> STAT3 aktivita u mES buněk Microarray analýza exprese „stemness“ genů pokračování pokračování Model narůstající heterogenity v rostoucí kolonii ES buněk za dodržení známých optimálních kultivačních podmínek růst kolonie ES buněk Buňky odpovídající buňkám ICM/epiblastu Časného neuroektodermu Buňky primitivního entodermu (morphologicky navíc tvoří také malá granula) 30<* 50<* 100<* *orientační počet buněk v kolonii epiblast ICM blastocoel blastocoel trofoectoderm Myší ES Lidské ES vývoj blastocysty 674 1389 475 332 343 204 637 Ramalho-Santos Fortunel Ivanova 356 275 2 6 23 1 201 ESC x NPC + RPC/HSC ESC Fortunel, 2003 10 58 685 286 30 157 792 ESC + NPC 798 1744 337 238 54 267 1341 NPC Variabilita v analýze transkripčního profilu u ES buněk (ESC), neurálních progenitorů (NPC), progenitorů retiny (RPC) a hematopoetických kmenových buněk (HSC) u myši. Tři pracovní skupiny, jedna metoda. Existují geny kmenovosti, tzv. „stemness geny“ ? Vývojově specifické geny => potenciál buněk Příslušné signální dráhy, specifický patern jejich aktivit => regulace diferenciace, proliferace, sebeobnovy + VYUŽITÍ ES BUNĚK 1.Biologický a biomedicínský výzkum -Příprava geneticky modifikovaných organismů -Studium mechanismů časné embryogeneze / diferenciace -Studium mechanismů kancerogeneze -Studium embryotoxicity -Testování farmak 2. Lékařství - Buněčné a tkáňové terapie - Příprava biologicky aktivních preparátů - Nosiče biologicky aktivních látek (pathotaxe) Pro vytvoření linie GMO je potřeba, aby požadovaná genetická modifikace byly obsažena i v pohlavních buňkách. Tuto modifikaci je tedy potřeba provést na buňkách toti- nebo pluripotentních. •Náhodným nebo cíleným(?) vložením požadované DNA do zygoty •Náhodným nebo cíleným vložením požadované DNA do ES buněk Příprava geneticky modifikovaných organismů - GMO - Díky prakticky neomezené možnosti kultivace ES buněk, lze mít prováděnou genetickou modifikace plně pod kontrolou, a také ji můžeme velice přesně naplánovat!!! - ES buňky jsou pluripotentní, po zpětné injikaci do blastocysty a vložení této blastocysty do dělohy pseudo-pregnantní myši, blastocysta pokračuje ve vývoji a vzniklý jedinec je chimérou buněk původni ICM a injikovaných ES na ůrovni všech tkání, tedy i zárodečné. Příprava KO/I myší ivf scnt ES buňky v buněčné terapii Model regenerace poškozené hematopoesy v důsledku mutace Rag2-/- s použitím ES buněk, genetických manipulací a jaderného reprogramování Rideout, 2002 Diferenciace ES buněk a) In vivo - teratomy: injikace suspenze ES buněk do vaskularizované tkáně imunitně tolerantního zvířete, popřípadě do zvířete s farmakologicky potlačenou imunitní odpovědí - chiméry: injikace ES buněk do blastocysty, navrácení takové blastocysty do pseudo-pregnantní myši = vznik chimerického jedince b) In vitro - metodiky korespondující s ontogenezí - metodiky získané empiricky (kopírující ontogenezi?) Musí buňka diferencující z ES buňky vždy kopírovat ontogenezi aby dosáhla určitého stavu? In vitro diferenciace ES buněk a)Embryoidní tělíska (Embryoid bodies - EB) + jednoduché, více buněčných typů + tolerující genotyp - špatně definované podmínky - b)V monovrstvě + dobře definovné podmínky + velká efektivita - může být silně závislé na genotypu kultivace selekce indukce Rathjen 1998 / Bílek 2004 Loebel, 2003 Úloha specifických růstových faktorů v ontogenezi myši Loebel, 2003 Příklady diferenciace myších ES buněk kombinací typu jejich kultivace a specifických růstových faktorů s porovnáním úlohy těchto faktorů v myší ontogenezi pokračování Schuldiner, 2000 Příklad účinků jednotlivých specifických růstových faktorů na indukci diferenciace u lidských ES buněk v kombinaci s tvorbou embryoidních tělísek Guasch, 2005 Barberi 2003 Příklad difernciace ES buněk do různých typů neurálních buněk NSC – neural stem cell, DA/Ser/GABA – dopaminergní/serotonergní/gabanergní neurony, MN - motoneurony Příklady diferenciace lidských pluripotentních buněk do kardiomyocytů esc SOUČASNÉ PROBLÉMY S VYUŽITÍM ES BUNĚK V TERAPII - pluripotentní SC se nedaří dlouhodobě kultivovat beze změn v genotypu / fenotypu - - dlouhodobá kultivace za sub-optimálních podmínek vede k dosud neznámým, epigenetickým změnám snižujícím schopnost pluripotence (ireverzibilními i pro cytoplasmu zygoty, Amano 2006) - dosud není spolehlivě vyřešen potencionální vznik teratomů - - biologie a diferenciační potenciál pluripotentních SC nejsou dosud dobře prozkoumány - kultivace pluripotentních SC je stále závislá na nedefinovaných faktorech Částečně vyřešeno za využití iPSC: - - vliv pohlaví, inaktivace X chromosomu x aktivace genů na Y chromosomu (variabilita v odpovědí na stimuly diferenciace, stabilitu vlastností..) - etika získávání nových lidských ES linií (různé státy, různé pohledy na věc) - finance, přes velice atraktivní potenciál, který v sobě pluripotentní SC mají, není jisté, jestli současná společnost bude mít dost prostředků na jejich využití např. v buněčné terapii Primordiální zárodečné buňky – PGC (primordial germ cell) - PGC se u myši objevují již 6 dpc, pravděpodobně je jejich vznik indukovaný v průběhu gastrulace, a to vnějšími signály, zejména BMP (na rozdíl od žab, Drosophily a C. elegans). - 6 – 7.5 dpc migrují vně vlastní embryo, později (8.5 dpc <) migrují podél zadního střeva embrya do vytvořené zárodečné lišty. - PGC zanikají po usazení v zárodečné liště (10-13 dpc u myši), stávají se z nich zárodečné buňky. Prodělají ještě 2-3 mitózy a u samců vznikají prospermatogonie zastavené v G0/G1 fázi mitózy. U samic vstupují do meiotické profáze (obojí > 12.5 dpc). - Podobně jako ICM a ES buňky mají vysokou hladinu alkalické fosfatázy (ale ne TNAP, ale GCAP/TNAP), také exprimují Oct4, Nanog, .. - Významné (pro specifikaci) jsou zdá se zejména Stella, Fragilis, Nanog,…. - PGC nejsou pluripotentní, jsou unipotentní! - PGC mají omezený počet dělení, u myši napočítáno kolem 1000 buněk, rozdíly v závislosti na imbrední lini (případně metodě J) Další klíčové geny ve specifikaci PGC Stella (DPPA – developmental pluripotent associated 3) Od oocytu (maternalní) po epiblast, později jen u PGC, podílí se na udržení jejich fenotypu, po jejich usazení v zárodečné liště jeho exprese vymizí. Také u ES buněk a některých nádorů. Represor transkripce. PCG protein, regulace methylace genomu. Fragilis (IFITM3 – Interferon induced transmembrane protein 3) Z rodiny IFN indukovaných genů, je silně exprimován při formování PGC, s jejich migrací jeho exprese klesá. Transmembránový protein, narušuje intracelulární metabolismus cholesterolu a tím modifikuje vlastnosti buněčných membrán. Pages from Pesce1998-Oct4development_Page_1_Image_0001 Cyklus zárodečných buněk u myši PGCs Exprese Fragilis mezi 6 – 7 dpc Exprese Oct-4 v PGC usazených v zárodečné liště PGC primordiální zárodečné buňky Hayashi-1 Hayashi, 2007 Mechanismus vzniku PGC Hayashi-2 Hayashi, 2007 Blimp1 – represor transkripce; Prmt5 - metyltransferáza Embryonální zárodečné buňky – EGC (Embryonic germ cells) - EGC jsou odvozeny z primordiálních zárodečných buněk (PGC – primordial germ cell). -Podobně jako ES buňky je lze expandovat in vitro, a jsou pluripotentní, jak dokazuje jejich schopnost diferencovat do buněk všech tří zárodečných listů jak in vitro (EB), tak in vivo (chiméry a teratomy). - Z epigenetického pohledu (DNA metylace) jsou však více podobné PGC než ES buňkám - Rozdíly v metylaci DNA se týkají zejména imprintovaných genů v závislosti na pohlaví, u EGC izolovaných z pozdějších embryonálních stádií se tento rozdíl zmenšuje. Tyto „imprinting-free“ PGC, však již netvoří zdravé chimerické jedince. - U myší lze EGC izolovat z PGC mezi 8.5 – 12.5 dpc, později to již nelze - PGC a následně EGC lze izolovat in vitro z ES buněk (lidských i myších) -m/hEGC jsou závislé na LIF, během časné kultivace i na FGF2 a Stem cell faktoru (SCF; + feeder & FCS/SR). - Exprimují podobné markery jako ES buňky, lidské EGC jsou fenotypem více podobné mES než hES (morfologie + exprese SSEA-1!; u hES se SSEA-1 exprimuje až s jejich diferenciací) Vznik EGC z PGC (Durcova-Hills 2008) Porovnání transktiptomů mES, mPGC a některých tkání R1, E14tg2a, TMA5 – linie mES buněk TMA55G (male), TMA58G (female) – EGC GS – germ stem cell (derived from spermatogonia) (Mise et al., 2008) GTC_1211_f2 blue – ES specifický patern red – PGC specifický patern purple - ES/PGC specifický patern green – nevýznamné pro specifikaci ES/PGC Analýza hlavních komponent expresních profilů GTC_1211_f1 Donovan, 2003 Schema předpokládaného zapojení FGF, LIF a KL (c-Kit ligand = Steel factor (SF)/ stem cell factor (SCF) v regulaci sel-renewal EG buněk Donovan, 2003 Vztahy mezi pluripotentními buňkami a některé klíčové regulační komponenty těchto buněk Sl – Steel locus, Ter – Teratoma locus, pgct1 – primordial germ cell tumor susceptibility locus, PTEN – Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10, mTR (mTOR) - serine-threonine kinase mammalian target of rapamycin Není původ ES buněk v PGC ??? Zwaka, 2005 Není původ ES buněk v PGC ??? M- myš; H –člověk; N/D – netestováno; ES – embryonální kmenové buňky; EGC – časné primordiální zárodečné buňky (!); LGC – pozdní primordiální zárodečné buňky; ICM – vnitřní buněčná masa; PE – primitivní ectoderm/epiblast Zwaka, 2005 Nature. 2013 Oct 30. doi: 10.1038/nature12745. [Epub ahead of print] Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Gafni O, Weinberger L, Mansour AA, Manor YS, Chomsky E, Ben-Yosef D, Kalma Y, Viukov S, Maza I, Zviran A, Rais Y, Shipony Z,Mukamel Z, Krupalnik V, Zerbib M, Geula S, Caspi I, Schneir D, Shwartz T, Gilad S, Amann-Zalcenstein D, Benjamin S, Amit I, Tanay A,Massarwa R, Novershtern N, Hanna JH. Source 1] The Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science, Rehovot 76100, Israel [2]. Abstract Mouse embryonic stem (ES) cells are isolated from the inner cell mass of blastocysts, and can be preserved in vitro in a naive inner-cell-mass-like configuration by providing exogenous stimulation with leukaemia inhibitory factor (LIF) and small molecule inhibition of ERK1/ERK2 and GSK3β signalling (termed 2i/LIF conditions). Hallmarks of naive pluripotency include driving Oct4(also known as Pou5f1) transcription by its distal enhancer, retaining a pre-inactivation X chromosome state, and global reduction in DNA methylation and in H3K27me3 repressive chromatin mark deposition on developmental regulatory gene promoters. Upon withdrawal of 2i/LIF, naive mouse ES cells can drift towards a primed pluripotent state resembling that of the post-implantation epiblast. Although human ES cells share several molecular features with naive mouse ES cells, they also share a variety of epigenetic properties with primed murine epiblast stem cells (EpiSCs). These include predominant use of the proximal enhancer element to maintain OCT4 expression, pronounced tendency for X chromosome inactivation in most female human ES cells, increase in DNA methylation and prominent deposition of H3K27me3 and bivalent domain acquisition on lineage regulatory genes. The feasibility of establishing human ground state naive pluripotency in vitro with equivalent molecular and functional features to those characterized in mouse ES cells remains to be defined. Here we establish defined conditions that facilitate the derivation of genetically unmodified human naive pluripotent stem cells from already established primed human ES cells, from somatic cells through induced pluripotent stem (iPS) cell reprogramming or directly from blastocysts. The novel naive pluripotent cells validated herein retain molecular characteristics and functional properties that are highly similar to mouse naive ES cells, and distinct from conventional primed human pluripotent cells. This includes competence in the generation of cross-species chimaeric mouse embryos that underwent organogenesis following microinjection of human naive iPS cells into mouse morulas. Collectively, our findings establish new avenues for regenerative medicine, patient-specific iPS cell disease modelling and the study of early human development in vitro and in vivo. Capturing the ground state of human naive pluripotency. Lidské „naivní“ pluripotentní kmenové buňky (human naive hESC = ekvivalent mESC Dospělé multipotentní zárodečné kmenové buňky (AMGDSC Adult multipotent germ-derived stem cell) - odvozeno ze spermatogonií - fenotyp velmi podobný ES buňkám - oproti ES buňkám snížená schopnost pluripotence – jen chiméry - pluripotence také in vitro Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis. Guan K, Nayernia K, Maier LS, Wagner S, Dressel R, Lee JH, Nolte J, Wolf F, Li M, Engel W, Hasenfuss G. Nature. 2006 Apr 27;440(7088):1199-203. Condition II & IV + LIF Concise review: challenging the pluripotency of human testis-derived ESC-like cells. Tapia N, Araúzo-Bravo MJ, Ko K, Schöler HR. Stem Cells. 2011 Aug;29(8):1165-9. V současnosti ale pochybnosti Kmenové buňky teratomu / teratokarcinomu - ECC Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cells) - Izolované rozkultivováním a klonální selekcí buněk teratomu / teratokarcinomu - Lidské spontálně, myší indukované transplantací časných embryonálních buněk do dobře vyživované tkáně (varlata, ledviná kapsa, břišní dutina,…), musí být imunotolerance - Podobné vlastnosti jako ES buňky, ale méně závislé na specifických růstových faktorech (+) - Tvoří také chiméry, ale nedokonalé, většinou hynou v průběhu embryogeneze (-) - Většinou snížená schopnost pluripotence jak in vivo, tak in vitro (-) - Obecně nestabilní genotyp a časté aneuploidie (-) - - Modelové studie genetické nestability a diferenciace, vzniku teratomů - Levnější alternativa k ES buňkám, lepší stabilita v experimentálních systémech jak ES (+) Neurální lišta a kmenové buňky neurální lišty 22 gr1 Neural crest stem cell - NCSC Sebeobnova Růstové faktory - FGF2, Notch, Wnt Transkripční factory – Slug (Snai2), Sox10 Fenotyp - blízký NSC – exprese Nestinu (protein intermediálních filament) Experiment potvrzujicí multi(/pluri)potenci buněk neurální lišty DBiologystr242 finito ESC iPSC ECC EGC maGSC ? EPLC epiSC Schopnost pluripotence – tvorba chimér a teratomů hESC hEGC(?) hiPSC(?) neural crest (? všechny) hECC Kmenové buňky extraembryonálních tkání A)Kmenové buňky trofektodermu (trofoblastu) FGF-dependent (FGF4, FGFR2); Cdx2, Eomes, Errb B)Kmenové buňky primitivního entodermu (hypoblastu) XEN – buňky extraembryonálního entodermu blastomery ICM trofektoderm linie trofoblastu primitivní entoderm primitivní ektoderm zárodečný epiblast / embryoblast allantois amnion mezoderm žloutkového vaku viscerální entoderm parietální entoderm Regulace kmenových buněk trofoblastu signály z epiblastu