METAPLASIE (- TRANSDIFERENCIACE?!) Potenciální možnosti: 1) Přímá přeměna fenotypu buňky jednoho typu v buňku typu jiného - s proliferací (metaplasie) - bez proliferace (pravá transdiferenciace) 2) Prvně směrem zpět v diferenciační řadě a následně diferenciace do jiné diferenciační řady (rediferenciace a následně diferenciace). Za pozorované jevy zřejmě ale odpovídají zbytkové populace progenitorů. - s proliferací - bez proliferace (silně nepravděpodobné) Přístupy: a) Vnějšími faktory b) Exogenní expresí vhodných genů c) Přeprogramováním jádra cytoplasmou jiné buňky (sem patří i terapeutické klonování) d) Kombinací výše zmíněných postupů metaplasie – přeměna kmenové nebo progenitorové buňky jednoho typu tkáně v progenitor tkáně jiné transdiferenciace – přeměna buňky jednoho typu na buňku typu jiného bez průchodu buněčným cyklem transdeterminace – metaplasie v průběhu embryogeneze Rawlins & Hogan (2006) Development 133, 2455-2465 - změny v metylaci DNA / metylačním paternu (CpG a CpA oblasti) tyto modifikace jsou relativně obtížně změnitelné - změny v metylaci / acetylaci / fosforylaci histonů - telomery / telomerázy - změny v PcG proteinech => transkripce jiných genů = jiný fenotyp ? ? ? ? ? ? ? ? ? SC / TA diferencované buňky transdeterminace metaplasie Pleopotence* x reprogramování (změna v determinaci) 80% multipotentní tkáňově specifická buňka terminálně diferencované buňky progenitory * persistující progenitory - původně málá a často sporná účinnost - závislé na buněčném typu, často jen u SCs a TA buněk - pokud je to možné, tak se většinou jedná o malou změnu / krok (!není úplně jasné, jestli je potřeba rediferenciace!) - uplatnitelnost in vitro spíše s některou z dalších metod a zejména pro zachování získaného fenotypu re- / transdeterminovaných buněk (- v současné době obrovská progrese a většina výše uvedeného neplatí?) Příklady: - exokrinní buňky pankreatu -> hepatocyty - epitel hltanu -> střevní epitel (po poškození žaludečními kyselinami, tzv. Barrettova metaplasie) - progenitory glií ??? - pigmentové buňky oka (iris) -> buňky rohovky (u čolka) - některé kultivační experimenty ukazují, že různé progentory / SCs mohou nabývat fenotypu jiné diferenciační řady, např SCs / TA epidermis x nervová tkáń A. Vnějšími faktory (cytokiny, vnější podmínky) - výrazně účinější než působení vnějších faktorů - „vhodné“ geny jsou zejména cytoplasmatické pro-onkogeny / onkogeny a transkripční faktory - epigenetická paměť buněk (zejména metylace DNA), ale nedovoluje úplnou změnu, je potřeba několikateré dělení buněk, pokud je daná změna vůbec možná, vlastní fenotyp se ale mění velice rychle Příklady: - nadbytečná exprese Ras a c-Myc indukuje částečnou rediferenciaci a transformaci - exprese Pdx1 (marker b-buněk pankreatu) navozuje částečný fenotyp b-buněk u hepatocytu a střevních epiteliálních buněk - exogení exprese c-Myc, Klf4, Oct4 a Sox2 navozuje fenotyp ESCs => iPSCs u embryonálních fibroblastů (myš), ale i další buňky - transdeterminace Pax a Hox geny (např. Pax-6 a oči) B. Ektopická/exogenní exprese vhodných genů iPS buňky – indukované pluripotentní buňky (Hochedlinger & Plath 2009) Exogenní(ektopické) transkripční faktory Endogenní transkripční faktory požadovaný fenotyp buňky daný/původní fenotyp buňky Endogenně regulovaný výsledný fenotyp buňky Exogenně dodané transkripční faktory nebývají dostatečně pevně fixovány v genomu - požkození genomu (vlastní vnesení exogenní informace) - destabilizace fenotypu, částečné reprogramování, reverze fenotypu, nežádoucí transformace Related image miRNA jako regulátor fenotypu buněk Image result for small molecules reprogramming table Příklady reprogramování prostřednictvím exogenní exprese příslušných genů Image result for small chemical molecule inhibitors reprogramming Reprogramování prostřednictvím malých molekul, chemických inhibitorů Image result for small molecular inhibitors reprogramming Reprogramování prostřednictvím malých molekul, chemických inhibitorů Image result for small chemical molecule inhibitors reprogramming Li et al., 2013 C. Přeprogramováním jádra cytoplasmou jiné buňky buněčná fůze – spojení cytoplasmy a jader dvou buněk za vzniku buňky jediné heterokaryon – produkt fůze buněk jasně odlišitelnými dvěma nebo i více jádry hybridní buňka – vznikne když heterokaryon projde mitózou za vzniku buňky s jedním jádrem ale s více jak 2n DNA (nemusí obsahovat kompletní jadernou DNA původních buněk) - závislost na momentálním stavu buňky - velice účinné, ale přenos jádra málo úspěšný u savců - fůze buněk je ale relativně běžná Úplné reprogramování terminálně diferencované buňky cytoplasmou oocytu u žab (ale i savci). Myš klonovaná z jádra čichového nervu BMSSCs exprimující b-galaktosidásu pod kontrolou svalově specifického promotoru Heterokaryon Purkiňova neuronu v mozečku a GFP+-BMSSC Regenerace samičích Fah -/- letálních jater (FAH – fumarylaceto- acetate hydroláza) transplantací samčích HSCs Detekce Y chromozomu v játrech po transplantaci (dole) a FAH aktivity vpravo nahoře. Využití Demetylace otcovského, mateřského a reprogra- movaného (jaderný přenos) genomu Reprogramování jádra, metylace DNA a chyby v embryogenezi Analýza exprese Oct4 mRNA u klonovaných a kontrolních blastocyst (in situ hybridizace). Účinek reprogramování jádra diferencované buňky na expresi Oct4-GFP a schopnost růstu ICM. Vývoj klonů a IVF/ICSI embryí exprimujících GFP in vitro.