Protilátky 1 5 Ab model se dvěma těžkými (určují třídu a izotyp Ig) a 2 lehkými polypeptidickýmiřetězci (kappa, lambda) spojené interakcí disulfidických můstků, N terminální zbytky Nejdůležitější Vlastnosti: Patří do gama frakce krevních bílkovin (gamaglobuliny), přítomnost některých úseků na bílkovinném řetězci-immunoglobulinové domény – konstantní a variabilní (110AK zbytků), je prototypem rozsáhlé imunologické rodiny molekul (800 důležitých molekul) variabilní úseky mají odlišné AK složení u různých plazmatických buněk, konstatní úseky-primární struktura je obdobná u různých molekul Ig, tvar molekuly Y odpovídá schopnosti vázat se na Ag struktury, pantovou oblastí (disulfidické můstky) se přizpůsobuje tvar vazebného místa molekule Ag (zodpovědné za prostorové uspořádání, řetězce Ig jsou glykosylovány, a to umožňuje biologické vlastnosti Ab 1 5 2 Působením proteolytických enzymů je štěpena Ab pod (pepsin) nebo nad (papain) disulfidickými můstky Vzniklé proteolytické fragmenty ukazují divalenci (váží se se dvěma Ag) pepsinu a univalenci papainu. pFc reprezentuje C-terminální konec Fc oblasti a je tvořen nekovalentními vazbami 3 4 Variabilní a konstantní domény spolu asociují a vytváří globulární struktury, např Y Trimer s Fc fragmenty Zvětš. 1.000.000x Dinitrofenol - Hapten s králičími Ab vytváří A)dimery B) trimery C) Tetramery D) pentamery Obr. A flexibilita v pantové oblasti Obr. E Fc fragmenty byly natráveny pepsinem, nelze je zde pozorovat jako u obr. A-D v každém rohu 6 Idealizovaná dvojrozměrná struktura Ag a) Vazbové místo tvoří peptidické smyčky, které tvoří hypervariabilní úseky na lehkém i těžkém řetězci (číslo znamená počet zbytků AK) a G cukerné zbytky. Cukerné zbytky jsou důležité pro zpětné poskládání peptidických řetězců a tvorbu beta struktury skládaného listu. Ta umožňuje, aby hypervarib. úseky ležely těsně u sebe. Díky vazbě k různým kombinacím hypervariab. úsekům a různým zbytkům uvnitř každé z této oblasti, každá z Ab může tvořit komplex s různými antigenními determinanty. b) Simulované kombinační místo tvoření třemi prsty každé ruky Každý prst představuje hypervariabilní smyčky sejmout Obr. Pantová oblast se přizpůsobuje tvarem vazebného místa na Ag konkrétní Ag struktuře. Část Ab molekuly se a) rozvírá b) otáčí Obr. Naznačuje možnosti změn prostorového uspořádání částí molekul Ab sejmout0001 Obr. Počet konstantních domén je různý pro různé typy těžkých řetězců, úroveň glykosylace, počet a umístnění disulfidických můstků u různých Ig tříd sejmout0002 3 Obr. Multimerní Ab Monomery jsou spojeny polypept. řetězcem J, produkovaný plazmatickou b., disulfidické můstky: spojuje řetězec monomerů a těžké řetězce Obr. Slabé vazebné interakce Hydrofobní síly pro mnohé vazby nejdůležitější, u Ab s podílem aromatických AK se uplatňují zejména van der Wallsovy síly, hydrofobní interakce, H můstky. Vazby působí jen na krátkou vzdálenost. Sila vazby mezi vazebným místem Ab a Ag determinantnou označujeme afinita, celková síla mezi všemi vazebnými místy komplexní Ag struktury - avidita protilátky Afinita •Je vyjádřená asociační konstantou K •Je poměr mezi koncentrací komplexu Ag-Ab a koncentrací volného Ag v násobku s koncentrací volné Ab •Platí pro monoklonální Ab •Polyklonální Ab jsou ve své afinitě heterogenní. Afinita se vyjadřuje jako rovnovážná konstanta reakce Ab a Ag v definovaných podmínkách pro definované reaktanty •Praxe: afinita při infekčním onemocnění viz dynamika protilátkové odpovědi. V počáteční fázi infekčního onemocnění: spec. Ab k Ag infekčního agens – není pevná vazba, afinita, avidita nízká Průběh infekce - avidita narůstá Stanovení afinity a avidity v kllinické praxi – určení fáze různých onemocnění sejmout0004 Obr. Izotypové rozdíly - rozdíly v AK složení konstantích částí řetězců (příslušnost k třídě) Alotypové – odlišnosti v konstantní části těžkých řetězců podmíněné genet. Polymorfismem Idiotypové – odlišnosti ve variabilní části molekul Ig podmíněné přeskupením genových segmentů – unikátní vazebné vlastnosti každé Ab sejmout0005 Charakteristika vlastností tříd a podtříd Ig sejmout0006 Obr. Ig v ontogenezi: přes placentu pasivně IgG do porodu, v pozdních fázích těhotenství tvorba vlastních IgM, IgA pasivně v kolostru a mléku, ostatní či zvýšené hladiny značí intrauterinní infekce (od matky, poškození plodu) sejmout0007 Dynamika primární a sekundární protilátkové odpovědi Obr. Primární odpověď 1. Tvorba Ab ve třídě IgM, potom další třídy a podtřídy (IgG, IgA..) 2. Postupné zvyšování afinity Ab podle procesu somatické mutace Sekundární odpověď 1. rychlejší a intenzivnější tvorba tříd IgG, IgA, nižší tvorba IgM 2. Vyšší afinita a množství Ab expanzí paměťových buněk, které již prodělaly proces somatické mutace Experimentální imunizace Průběh imunitní odpovědi, aplikace po třech týdnech 1.Zjištění dynamiky a výše hladiny tvorby Ig u pokusných zvířat 2.Zjištění koncentrace proteinů očkovací látky 3.Aplikace dávky: při spodní hranici hodnoty množství očkovací látky 4.Aplikace po třech týdnech dle schématu 5.Izolace séra s vytvořenými Ab z pokusných zvířat Experimentální imunizace •Literatura udává jako optimální očkovací dávku rozmezí hodnot 5 – 50 mg nerozpustných proteinů v bakteriální suspenzi. Toto množství lze aplikovat: a)intraperitoneálně b)subkutálně •nejběžnější metoda-intraperitoneální očkování, použití: pro vpravení většího množství Ag do myší (Harlow, Lane 1988). •K očkování se dá použít spodní hranici hodnot Ag: •možnost sledování dynamiky protilátkové odpovědi: Závisí: • na množství Ag •na jeho specifitě •na organismu, který očkujeme. Stanovení Ab u infekčních chorob •