Stanovení ALT (Alaninaminotransferáza) v séru člověka Teorie: Aminotransferázy jsou enzymy usnadňující přeměnu jedné aminokyseliny v jinou. Tím pomáhají udržovat vyvážený přísun aminokyselinových jednotek potřebných pro syntézu bílkovin. Zvýšená aktivita alaninaminotransferázy je významným indikátorem aktivity jater, srdce a kosterního svalstva. V praxi jsou transaminázy látky tělu vlastní, které se obvykle nacházejí v buňkách. ALT transamináza je obsažena převážně v buňkách jater, srdce, kosterních svalů, ledvin, mozku a v červených krvinkách Po jejich rozpadu přecházejí do krevního séra. Zvýšená hodnota ALT znamená tedy zvýšený rozpad buněk v těchto oblastech. Norma: 0,06 – 0,14 ukat/l Hraniční hodnota: 0,42 ukat/l Úkol: Stanovit ALT v séru člověka Pomůcky: stojánek na eppenndorfky nastavitelné pipety termolázeň na 37^oC ELISA-reader s filtrem o vlnové délce 340 nm Princip metody: alaninaminotransferáza (L-alanin: 2-oxoglutarátaminotransferasa E.C.2.6.1.2) katalyzuje reakci mezi L-alaninem a 2-oxoglutarátem, které převádí na L-glutamát a pyrohroznan, Stanovení je založeno na měření absorbance hydrazonů kysein 2-oxoglutarové a pyrohroznové v alkalickém prostředí. Hydrazon kyseliny pyrohroznové má vyšší absorbanci. L-alanin + oxoglutarát ® pyruvát + L-glutamát Pyruvát + NADH + H^+ ® laktát + NAD^+ Katalytická koncentrace ALT je úměrná poklesu absorbance při 340 nm. Činidla R1. Pufr: Tris pufr pH=7,5, L-alanin, LD LD ³ 2,5 mkat NADH ³ 21,6 mmol/lahvičku R2. Startér NADH, 2-oxoglutarát 180 mmol/l Azid sodný 0,1 % Aktivátor Pyridoxal-5-fosfát 6 mmol/tabletu Kalibrace BIO-LA-TEST LYONORM KALIBRÁTOR, kat. č. ..(1,40 mkat/l), 3204,3206 Příprava pracovního roztoku Původně obsah flaštičky s činidlem 1 se rozpustí ve 100ml činidla 3. Po rozpuštění se přidají 2 tablety činidla 4. Upraveno na: 25% hmotnosti obsahu lahvičky s činidlem 1 se rozpustí v 25ml roztoku činidla 3. Po rozpuštění se přidá půl tablety činidla 4. Postup analýzy Vzorky: nehemolytické sérum, heparinizovaná nebo EDTA plazma Vlnová délka: 340 nm ELISA destička Teplota: 37 °C Druh vzorku Pracovní roztok 10min inkubace Činidlo 2 Vzorek séra 2x ředěný 10 µl 100 µl 10 µl Blank (Fyz. roztok) 10 µl 100 µl 10 µl Standard 2x ředěný 10 ml 100 µl 10 µl Standard koncentrovaný 10 ml 100 µl 10 µl Použije se blank, použije se Lyonorm (biochemický) jako standard Promíchá se a inkubuje 10 minuty při 37 °C Přidá se činidlo 2 v množství 10µl Promíchá se, inkubuje se 2 a minuty při 37 °C měří se absorbance v 1 minutových intervalech nejméně po dobu 3 minut. Vypočte se průměrná změna absorbance za 1 min (δA). δA= průměr (A1+A2+A3)