Bi9393 Analytická cytometrie Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Karel Souček, Ph.D. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Flow cytometry most common applications Viability assays (propidium iodid, Calcein AM, …) Proliferation (BrdU, EdU, mitosis - pH3) DNA damage ( yH2AX,…) Cell Death analysis (AnnexinV, Cleaved Caspase3, …) Cell Cycle (DNA content, Cell cycle modulation after treatment) Immunophenotype characterisation of the cells (CSCs markers, differentiation, …) Detekce počtu buněčného dělení http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/en/images/ics-organized/applications /cell-tissue-analysis/data-chart/180-wide.par.32782.image.-1.-1.1.gif http://www.appliedbiosystems.com/etc/medialib/appliedbio-media-library/images/application-and-techn ology/flow-cytometry/data-images.Par.85351.Image.gif?direct=1 Applied Biosystems The Nobel Prize in Chemistry 2008 n"for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP" Nobel Prize® medal - registered trademark of the Nobel Foundation http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/ Fluorescenční proteiny nbioluminescence resonance energy transfer (BRET) –Aequorea victoria - medúza žijící ve vodách na pobřeží Severní Ameriky. –je schopna modře světélkovat (bioluminescence). Ca2+ interaguje s fotoproteinem aequorinem. –modré světlo excituje green fluorescent protein. –Renilla reniformis – korál žijící ve vodách na severním pobřeží Floridy. –luminescence vzniká degradací coelenterazinu za katalytického působení luciferázy. –modré světlo excituje green fluorescent protein. – – Renilla reniformis "Sea Pansy" http://www.mbayaq.org/efc/living_species/default.asp?hOri=1&inhab=440 Aequorea victoria “Crystal jelly “ http://www.whitney.ufl.edu/species/seapansy.htm Fluorescenční proteiny n Osamu Shimomura –1961 objevil GFP a aequorin n http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm nScience. 1994 Feb 11;263(5148): nGreen fluorescent protein as a marker for gene expression. nChalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. n nDepartment of Biological Sciences, Columbia University, New York, NY 10027. n n A complementary DNA for the Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) produces a fluorescent product when expressed in prokaryotic (Escherichia coli) or eukaryotic (Caenorhabditis elegans) cells. Because exogenous substrates and cofactors are not required for this fluorescence, GFP expression can be used to monitor gene expression and protein localization in living organisms. Fluorescenční proteiny nDouglas Prasher nMartin Chalfie mice_400x300 [USEMAP] Fluorescenční proteiny http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm in vivo molekulární vizualizace Hasegawa, S., Yang, M., Chishima, T., Miyagi, Y., Shimada, H., Moossa, A. R., and Hoffman, R. M. In vivo tumor delivery of the green fluorescent protein gene to report future occurrence of metastasis. Cancer Gene Ther, 7: 1336-1340, 2000. KODAK X-SIGHT 640 LSS Dyes in vivo with x-ray overlay KODAK X-SIGHT 650 and 761 Nanospheres, KODAK In-Vivo Multispectral Imaging System Fluorescenční proteiny nSergey A. Lukyanov –Objevil „GFP-like“ proteiny u nesvětélkujících korálů n Roger Tsien n~ 2002 – mutace FP = barevné spektrum nhttp://www.tsienlab.ucsd.edu/ http://www.tsienlab.ucsd.edu/HTML/Images/IMAGE%20-%20PLATE%20-%20Beach.jpg The image “http://www.tsienlab.ucsd.edu/HTML/Images/IMAGE%20-%20Rendered%20GFP%20-%20640.jpg” cannot be displayed, because it contains errors. Roger Y. Tsien Detekce buněk v synchronizovaném buněčném cyklu Licensing control by Cdt1 and geminin http://jcs.biologists.org/content/joces/125/10/2436/F9.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1 J Cell Sci 2012 125: 2436-2445; doi: 10.1242/jcs.100883 Fucci (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator) cells Ubiquitin E3 ligase complexes G1 - APCCdh1 substrate: Geminin, inhibitor of DNA replication inhibits Cdt1 S, G2, M- SCFSkp2 substrate: DNA replication factor Cdt1 – key licensing factor Fucci sensors - 1st generation, coral FP monomeric Kusabira orange 2 – hCdt1 (30/120) Monomeric Azami-Green – hGeminin (1/110) Fucci sensors – 2nd generation, Aequorea FP red monomeric fluorescent protein - mCherry -hCdt1 (30/120) yellowish green monomeric variant of GFP –mVenus – hGeminin (1/110) Image result Fucci http://www.amalgaam.co.jp/products/advanced/img/fucci/E3.jpg http://cfds.brain.riken.jp/Fucci.html CONTROL SCH900776 MU380 …lot of questions, but how to answer them? nHow many times cells divided? nWhat is a length of cell cycle phases? nIs there a difference in time between first and second division? nHow it is all affected by my drugs? Branches (dvisions) analysis 02_02_01_01 Median 14 hours 02_02_01_01 Vitální analýza buněčných funkcí nPrůtoková cytometrie umožňuje vícebarevnou vitální analýzu buněk –intracelulární koncentrace iontů, –pH, –produkce reaktivních skupin, –životnost n Detekce viability njedna z nejjednodušších analýz nfunguje na principu: –detekce membránové integrity - neprůchodnosti některých fluorescenčních značek cytoplazmatickou membránou živých buněk – propidium iodide, ethidium bromide, 7-amino actinomycin D – –detekce fyziologického stavu buněk – použití fluorescenčních značek barvících pouze živé buňky - Rhodamine-123, Calcein-AM – nethidium monoazide – lze jím obarvit mrtvé buňky a následně fixovat nPomocí LDS-751 (laser dye styryl-751) je možné odlišit mrtvé buňky i po fixaci nLIVE/DEAD® Fixable Dead Cell Stain Kits n Detekce viability VIABILITY using LIVE/DEAD fixable stains Principle: reaction of a fluorescent reactive dye with cellular amines, in necrotic cells react with free amines both in the interior and on the cell = intense staining, live cells stained on surface only = dim signal Pros: simple, wide spectrum of dyes, fixable, The ArC™ Amine Reactive Compensation Bead Kit Cons: live cells have signal, stain only in buffers w/o BSA or serum, Tris or azide Image result for live/dead fixable Přenos signálu pomocí Ca2+ •Cytosol (koncentrace - „klidová“ 100 nM vs. 1-10 mM aktivovaná) •[Ca2+]c aktivuje proteinkinázu C •interaguje s „Ca2+ - binding proteins“ Alberts, B. et.al. Essential Cell Biology, 1998 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Ca 2+ influx - Fura-2 - Fluo-3 - Indo-1 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie ionophor ionophor Zajištění vhodných podmínek pro detekci [Ca2+]i •standardizace barvení a kalibrace - zlepšení rozpustnosti AM estery modifikovaných indikátorů (BSA, Pluronic ® -127) - inhibice aktivního vylučování indikátoru buňkou (Probecid) - pro kalibraci vhodné AM estery modifikované chelátory (BAPTA-AM) •temperace vzorku po celou dobu měření •standardizace způsobu přidávání induktoru K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Burns, J. M. et.al. (1997). "Improved measurement of calcium mobilization by flow cytometry." Biotechniques 23(6): 1022-4, 1026. http://www.cytekdev.com K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Kalibrace (pro jednu vlnovou délku) Fluo-3 (Kd ~ 400nM, 22°C; 864 nM, 37°C) Fmin = 1.25 x FMnCl2 - 0.25 x Fmax K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie - pro ziska Fmax - přidání ionoforu = A23187-Br, ionomycin - Fmin - 2mM MgCl2, Fluo-3 vytváří fluorescenční komplex i s Mg2+ (ale 5x méně intenzinví fluo nez s Ca2+ Detekce intracelulárního pH nFluorescenční značky měnící intenzitu fluorescence v závislosti na pH nSNARF-1, BCECF Detekce intracelulárního pH nNutná kalibrace pomocí draslíkových pufrů a ionoforu (nigericin) Detekce reaktivních kyslíkových skupin nReaktivní kyslíkové skupiny hrají klíčovou roli v celé řadě biologických procesů –posttranslační modifikace proteinů –regulace transkripce –regulace struktury chromatinu –přenos signálu –funkce imunitního systému –fyzický a metabolický stres –neurodegenerace, stárnutí n n O2• – O2 H2O2 • OH H2O 4 e– reduction to water e– e– e– e– Not so terribly reactive with most biomolecules Maintained at very low concentration Catalases, peroxidases, GSH, etc… Actually a chemical reductant Not so terribly reactive with most biomolecules Mitochondrial superoxide the major source of active oxygen Maintained at very low concentration Superoxide dismutases Reacts with virtually any molecule at diffusion-limited rates The molecule that makes ionizing radiation toxic Unreactive at STP, but a great electron acceptor Biological activation via radicals, transition metals Generally, radical intermediates are enzyme-bound © Simon Melov Potential sites of intervention Oxidative Stress Neurodegeneration Cancer Vascular Tone Cardiac Output Sensory Acuity Skin Thickness Bone Density Endocrine Function Immune Function DNA Damage Oncogenesis Mitochondrial Damage Energy Crisis Cell Death © Simon Melov Hydroethidine HE EB N CH2CH3 NH2 H2N H Br- N CH2CH3 NH2 H2N + O2- Phagocytic Vacuole SOD H2O2 NADPH NADP O2 NADPH Oxidase OH- O2- DCF HE O2- H2O2 DCF Example: Neutrophil Oxidative Burst © J. P. Robinson, Purdue University DCFH-DA DCFH DCF COOH H Cl O O-C-CH3 O CH3-C-O Cl O COOH H Cl OH HO Cl O COOH H Cl O HO Cl O Fluorescent Hydrolysis Oxidation 2’,7’-dichlorofluorescin 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate 2’,7’-dichlorofluorescein Cellular Esterases H2O2 DCFH-DA DCFH-DA DCFH DCF H O 2 2 Lymphocytes Monocytes Neutrophils log FITC Fluorescence .1 1000 100 10 1 0 20 40 60 PMA-stimulated PMN Control 80 © J. P. Robinson, Purdue University - DCFH-DA - DHR-123 - HE Oxidative Burst K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescenční proteiny nbioluminescence resonance energy transfer (BRET) –Aequorea victoria - medúza žijící ve vodách na pobřeží Severní Ameriky. –je schopna modře světélkovat (bioluminescence). Ca2+ interaguje s fotoproteinem aequorinem. –modré světlo excituje green fluorescent protein. –Renilla reniformis – korál žijící ve vodách na severním pobřeží Floridy. –luminescence vzniká degradací coelenterazinu za katalytického působení luciferázy. –modré světlo excituje green fluorescent protein. – – Renilla reniformis "Sea Pansy" http://www.mbayaq.org/efc/living_species/default.asp?hOri=1&inhab=440 Aequorea victoria “Crystal jelly “ http://www.whitney.ufl.edu/species/seapansy.htm Fluorescenční proteiny http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm Fluorescent sensors for detection of H2O2 Variants & fusions npHyPer-cyto vector npHyPer-dMito vector –Duplicated mitochondrial targeting sequence (MTS) is fused to the HyPer N-terminus. MTS was derived from the subunit VIII of human cytochrome C oxidase [Rizzuto et al., 1989; Rizzuto et al., 1995]. npHyPer-nuc vector –Three copies of the nuclear localization signal (NLS) fused to the HyPer C-terminus provide for efficient translocation of HyPer to the nuclei of mammalian cells [Fischer-Fantuzzi and Vesco, 1988] n n n Analýza a sortrování chromozómů Analýza a sortrování chromozómů nsynchronizace buněk – zisk metafázních chromozómů (colcemid, hydroxyurea) nizolace chromozómů nznačení DAPI nebo Hoechst vs. chromomycin A3 (CA3) nebo mithramycin n= celková DNA vs. G/C-bohaté oblasti n NCBI PubChem logo http://www.scienceclarified.com/Ca-Ch/Chromosome.html http://www.nccr-oncology.ch/scripts/page9243.html Analýza a sortrování chromozómů e-bang „Flow karyotype“ http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/ ♂ ♀ Karcinom močového měchýře Sortrování chromozómů Pisum sativum Sortrování chromozómů Vicia faba Cover image expansion Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii nekologie npotravinářství http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/micrflow/ Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii nviabilita nmetabolické funkce nsortrování nanalýza aerosolů (Fluorescence Aerodynamic Particle Sizer (Flaps)) n Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii nSortrování –EPICS + Autoclone® modul n Průtoková cytometrie kvasinek nbuněčné dělení nviabilita nmembránový potenciál nrespirace nprodukce H2O2 ncitlivost k antibiotikům nseparace n Saccharomyces cerevisiae http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Budding_yeast_Lifecycle.png http://www.sbs.utexas.edu/mycology/sza_images_SEM.htm Průtoková cytometrie kvasinek Průtoková cytometrie v hydrobiologii nstudium pico- a nano-fytoplanktonu (< 20 mM) nanalýza metabolických funkcí planktonu nstudium pigmentace (analýza chlorofylu a fykoeritrinu) Průtoková cytometrie v hydrobiologii Průtoková cytometrie v hydrobiologii nanalýza DNA http://planktonnet.awi.de/portal.php?pagetitle=assetfactsheet&asset_id=15127 http://www.soes.soton.ac.uk/staff/tt/ [USEMAP] Průtoková cytometrie v hydrobiologii http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/micrflow/sieracki/sierack2.htm Absorption Spectrum Emission Spectrum http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/chlorophyll-a(MeOH).html Průtoková cytometrie bezobratlých nlze aplikovat běžné metodické přístupy a fluorescenční značky n nPříklady aplikací: –buněčný cyklus –cytotoxicita –apoptóza Long Tongue Tachinid Fly 240px-Miesmuscheln_Mytilus_2 Invertebrate Survival Journal [USEMAP] http://www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/uses/insects/index.html nFigure 5. Representative flow-cytometry scatter plot of hemocytes from 25 oysters. Rebelo MdF, Figueiredo EdS, Mariante RM, Nóbrega A, et al. (2013) New Insights from the Oyster Crassostrea rhizophorae on Bivalve Circulating Hemocytes. PLoS ONE 8(2): e57384. doi:10.1371/journal.pone.0057384 http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0057384 nFigure 6. Proposed model for hemocyte maturation, as seen by flow cytometry. Rebelo MdF, Figueiredo EdS, Mariante RM, Nóbrega A, et al. (2013) New Insights from the Oyster Crassostrea rhizophorae on Bivalve Circulating Hemocytes. PLoS ONE 8(2): e57384. doi:10.1371/journal.pone.0057384 http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0057384 Union Biometrica product overview https://www.unionbio.com/copas/ Dispensed Object Images and Corresponding Object Profiles Suraj Kannan. Circulation Research. Large Particle Fluorescence-Activated Cell Sorting Enables High-Quality Single-Cell RNA Sequencing and Functional Analysis of Adult Cardiomyocytes, Volume: 125, Issue: 5, Pages: 567-569, DOI: (10.1161/CIRCRESAHA.119.315493) © 2019 American Heart Association, Inc. „High Throughput Flow Cytometry“ nautomatizace + robotizace = urychlení a efektivita sběru dat (měření desítky vzorků za hodinu s minimálním zásahem operátora ) nvyužití principu vícebarevné analýzy K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Automatizované systémy měření vzorků Automatický karusel (autosampler) Adaptér pro nasávání vzorků z mikrotitrační desky logo_becton%20dickinson Automatizovaný „microsampler“ systém cytek K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Universal Loader - Lab Image https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSG6MDDEyKW2lrEy-4pYcbhalq94g7mws3iCujkWC8szVo IZvRtvw https://www.youtube.com/watch?v=L1UgdoP2aeg https://www.youtube.com/watch?v=7MFmbtIb8xA [USEMAP] [USEMAP] [USEMAP] CompuGene https://www.synbiobeta.com/read/one-lab-in-germany-is-using-robots-to-advance-computer-aided-synthe tic-biology https://www.youtube.com/watch?v=ERDtmYddNkQ Incorporating Automation into a Flow Cytometry Workflow for Antibody Discovery The steps in a high-throughput fluorescence-microscopy experiment. Analysis [USEMAP] http://www.stanford.edu/group/nolan/ Garry Nolan Peter Krutzik „Fluorescent cell barcoding“ Fig 1 full size Krutzik PO, Nolan Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 2006 May;3(5):361-8. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie > Fig 3 full size Krutzik PO, Nolan Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 2006 May;3(5):361-8. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Get the best out of your model FACS-based surface screen: •validated antibodies in 96w plates •several comercially available possibilities, we have gone for… - LEGENDScreen HUMAN 332 PE conjugated antibodies + ISOs - LEGENDScreen MOUSE 252 PE conjugated antibodies + ISOs • • -there are XY vials in LN -price of kit ≈ 1000 € (27k Kc) How to get the best of it all? Final workflow The optimal concentation issue nHOW TO TEST IT: n10x serial dilution n n nREQUIREMENTS: n noptimal resolution ncompatibility w/ PE n n Sample results nEpCAM n- marker of epithelial cells n- commonly lost during EMT Sample result Cytometric bead array (CBA) nMultiplexed Bead-Based Immunoassays nflow cytometry application that allows users to quantify multiple proteins simultaneously Multiplex microsphere‐based flow cytometric platforms for protein analysis and their application in clinical proteomics – from assays to results ELECTROPHORESIS Volume 30, Issue 23, pages 4008-4019, 3 DEC 2009 DOI: 10.1002/elps.200900211 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/elps.200900211/full#fig1 Microspheres can be immobilized with capture molecules and immunoassays can be performed. (A) Coupling reactions for microspheres: Microspheres with functional groups (carboxyl‐, thiol‐) can be used for immobilizing peptides, proteins, or amino group‐functionalized molecules; alternatively, streptavidin‐functionalized microspheres can be applied for biotin‐labeled capture molecules. (B) Standard capture sandwich assay: An individual assay involving an optically encoded microsphere immobilized with a specific capture molecule (antibody) is being carried out on the particle. After sample incubation, another analyte‐specific antibody (a so‐called detection antibody, which is biotinylated and usually recognizes epitopes that are different from that of the capture antibodies) is then applied to the reaction. The presence and quantity of the reporter tag (e.g. strepavidin‐phycoerythrin) allows the precise quantification of the reactions that occur. © This slide is made available for non-commercial use only. Please note that permission may be required for re-use of images in which the copyright is owned by a third party. CBA CBA nmultiplexing capabilities nspeed nincorporation of multiple assay formats nrapid assay development and reasonable cost nautomation ex vivo flow cytometrie - limitace nOvlivnění některých vlastností buněk (morfologie, exprese znaků); nneumožnuje dlouhodobější studie buněčného metabolismu a buněčných interakcí (komunikace, adheze) v přirozeném tkáňovém mikroprostředí; ndalší: –nízká citlivost pro detekci vzácných buněčných subpopulací (1-10 buněk/ml ~ 5000 – 50000 buněk v 5 litrech krve dospělého člověka); –časově náročná příprava vzorku (hodiny, dny); –diskontinuita odebíraných vzorků. Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry – základní principy nZobrazení buněk přímo v krevním nebo lymfatickém řečišti. nVizualizace pomocí CCD nebo CMOS kamery po ozáření konvenční mikroskopickou lampou nebo lasery. nDetekce absorbce, fluorescence, Ramanova spektra, fototermálních nebo fotoakustických signálů. n Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry – bez značení nNahrávka videa pomocí vysokorychlostní CCD nebo CMOS kamery s vysokým rozlišením v režimu propustnosti nebo odrazu. nPříklad: high-speed transmittance digital microscopy (TDM) nLimity: hloubka tkáně. nTDM může sloužit k navedení zdrojů záření pro další analýzu do určené oblasti. n n Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 photoacoustic and photothermal imaging nThe photoacoustic effect was first discovered by Alexander Graham Bell in his search for a means of wireless communication.1 Bell succeeded in transmitting sound with an invention he called the “photophone,” which carried a vocal signal with a beam of sunlight that was reflected by a vocally modulated mirror. The sound could be recovered with an ordinary telephone receiver connected to a selenium cell illuminated by the light. Bell published the results in a presentation to the American Association for the Advancement of Science in 1880. The Photoacoustic Effect Benjamin T. Spike Physics 325 April 21, 2006 Schematic illustration of photoacoustic imaging Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 ACS Nano 2010 4 (8), 4559-4564 In vivo flow cytometrie – detekce specifických signálů nDetekce fotoakustických a fototermálních jevů Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry - aplikace Shrnutí přednášky nPříklady funkčních analýz n„High-throughput“ průtoková cytometrie … n … a uplatnění vícebarevné detekce a beads array n sortrování chromozómů n aplikace v mikrobiologii, hydrobiologii a studiu bezobratlých nin vivo průtoková cytometrie Na konci dnešní přednášky byste měli: 1. 1.vědět jakým způsoben je možné analyzovat buněčný cyklus. 2. umět navrhnout další parametr kombinovatelný s DNA analýzou. 3. znát příklady buněčných funkcí které je možné analyzovat na průtokovém cytometru. 4.vědět co jsou to fluorescenční proteiny a jaké jsou výhody jejich využití v buněčné biologii. 5.vědět co je to „high-throughput„ průtoká cytometrie …a jak se v ní může uplatnit princip vícebarevného značení. 6.znát základní principy měření a sortrování chromozómů pomocí průtokového cytometru; 7.mít představu o možných aplikacích průtokové cytometrie v mikrobiologii, hydrobiologii a studiu bezobratlých; 8.rozumět limitům a principům in vivo průtokové cytometrie. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie