Aplikace průtokové cytometrie v klinické imunologii a hematologii Lukáš Kubala kubalal(a>ibp.cz Imunologie - Stanovení stavu imunitního systému • Vrozené nebo získané imunodeficience - monitorování HIV positivních pacientů a stanovení efektivity terapie - monitorování efektivity imunosupresivní terapie u transplantovaných pacientů • Monitorování autoimunitních onemocnění a efektivity terapie Hematologie • Diagnóza maligních onemocnění • Stanovení funkčních vlastností trombocytů Metodologické přístupy • Imunofenotypizace Stanovení zastoupení jednotlivých subpopulací leukocytu (obecně krevních elementů v krvi, kostní dřeni nebo mozkomíšním moku) • Funkční testy Aktivace lymfocytů Změna exprese vybraných povrchových markrů (většinou receptory nezbytné pro funkci daného lymfocytu) Indukce proliferace (stanovení buněčného cyklu) Produkce cytokinů Stanovení cytotoxicity N K buněk a cytotoxických lymfocytů Aktivace fagocytů (mikrobicidní aktivita) Produkce volných radikálů fagocyty Fagocytární aktivita - Stanovení funkčních vlastností trombocytů Imunofenotypizace Stanovení zastoupení jednotlivých subpopulací buněk (primárně leukocytu) na základě exprese vybraných povrchových antigénu případně v kombinaci s intracelulární produkcí cytokinů a expresí intracelulárních antigénu • Na základě rozptylu světla jsou leukocytární populace rozděleny podle velikosti a granularity • Specifické monoklonální protilátky označené různými fluorochromy proti vybraným CD antigenům umožňující rozdělení buněk do populací CD Antigény • Systém označení povrchových molekul leukocytu (buněk) mající stejný epitop, identifikovatelný stejnou protilátkou umožňující rozpoznávání buněčných populací při imunofenotypizaci • Většina má alternativní názvy vztahující se k jejich funkci nebo struktuře buňky - pattern gnition Rs (CD35) CR3 (CDllb/CD18) CD Antigény • Dodnes definovány CD1 přes CD300 • Některá CD jsou skupinami příbuzných molekul, a jednotlivé molekuly se označují písmeny (např. CD62L, CD62P, CD62E) • Zdroj informací o CD nomeklatuře - učebnice imunologie, www např. PROW www.Ncbi.nlm.nih.gov/prow/ Exprese vybraných povrchových znaků během vývoje B lymfocytů Vývojové štádium Exprese vybraných povrchových znaků Kmeňová bunka CD34 Časný pro-B lymf. CD34; CD45R; IL-7R; CD10; CD19; CD38 Pozdní pro-B lymf. CD45R; IL-7R; CD10; CD19; CD38; CD20; CD40 Velký pre-B lymf. CD45R; IL-7R; CD19;CD38;CD20;CD25 (rec. IL-2); CD40 Malý pre-B lymf. CD45R;CD19;CD38; CD20; CD40 Vývojové stádium Exprese vybraných povrchových znaků Nezralý B lymf. CD45R; CD19; CD20; CD40 Zralý naivní B lymf. CD45R; CD19; CD20; CD21; CD40 Lymfoblast CD45R; CD19; CD20; CD21; CD40 Paměťová buňka CD45R; CD19; CD20; CD21; CD40 Plasmatická buňka CD135; CD38 Nezralé CD3-(95% a:p+CD3+ 4+8+ malé klidové dvakrát-pozitivní tymocyty a:P+CD3+4+8" a:P+CD3+48+ malé jedenkrát-pozitivní tymocyty O O Export do periferie A detailed analysis of thymocytes shows a number of discrete subsets that differ in their expression of CD4 and CD8 CD4 CD8 The different subsets represent different development stages of thymocytes. In the first step, CD4"CD8"(DN) thymocytes give rise to CD4+CD8+(DP) thymocytes The DP thymocytes mature further, to become CD4|0CD8S(> The division of thymocytes into two lineages occurs, with the ceils first becoming CD4hiCD8l0; some of the cells then become CD4,0CD8hi The mature CD4+CD8" or CD4CD8+ (SP) subsets then mature. These cells are exported from the thymus to the peripheral circulation CD4 CD8 Figure 7-31 Immunobiology,6/e. (© Garland Science 2005) Možné rozdělení jednotlivých subpopulací lymfocytů podle exprese vybraných povrchových antigénu Ly m p h ocy tes i n BI ood B cells CD 5+ CD5- ^CD23+ CD23- tCD45RB+ CD45RB- TH (CD 4+) Naive M emory I— CD11a+< CD11a- CD45RA+ NK cells M emory CD 60+ CD60- CD60+ CD60- CD57+ CD57- \— CD11a+< CD 60+ CD 60- CD11a- ^CD60+ ^CD60- < CD45RA + CD 57+ CD57- CD16+CD56-CD16+CD 56+ CD16-CD56+ CD8dim CD 4+ CD4r- yôT cells tVô2 VÔ1 Vy9+ Vy9- Vybrané povrchové molekuly charakteristické pro různé typy leukocytu ("markery" jednotlivých typů) Bunečný typ Charakteristické povrchové molekuly Leukocyty (všechny) CD53, CD45, CD43 Hematopoetické prekurz. CD34, CD117, CD137 T lymfocyty CD2, CD3, CD5, CD6, CD7, CD27, CD28, CD96, TCR T pomocné 1. (Th) CD4 T cytotoxické 1. (Tc) CD8 B lymfocyty CD19, CD20, CD22, CD37, CD39, CD40, CD79, BCR Pre-B lymfocyty CD9, CD10, CD138 Plasmatické bunky CD28, CD138 N K lymfocyty CD2, CD11b, CD16b, CD56, CD57, Cd94, CD158 Neutrofilní granulocyty CD11b, CD15, CD87 Monocyty CD14, CD33, CD64, CD87, CD89 Dendritické bunky CD83, Cd86, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209 Příklad výběru detekovaných antigenů pro určení zastoupení a počtu jednotlivých subpopulací lymfocytů v periferní krvi Izotypová kontrola Monoklonální protilátky stejné třídy proti irelevatním antigenům CD45 Všechny leukocyty lymfocyty silněji CD14 Monocyty CD3 Všechny T lymfocyty CD19 Všechny B lymfocyty CD4 Pomocný T lymfocyt CD8 Cytotoxický T lymfocyt CD56 N K lymfocyt Príklad kombinace jednotlivých protilátek při použití dvojího značení Zkumavka FITC PE Stanovení 1 CD45 CD14 %lymfocytů v ohraničení (gate) pro lymfocyty 2 Iz.kont. Iz. kont. Nespecifická vazba -autofluorescence 3 CD3 CD4 Pomocné (Th) lymfocyty 4 CD3 CD8 Cytotoxické (Tc) lymfocyty 5 CD3 CD19 Celkové B- lymfocyty 6 CD3 CD56 NK buňky SS a FS leukocytu získaných z plné krve po lyzaci erytrocytu Neutrofily Monocyty Lymfocyty 0 200 400 600 800 1000 Forward Light Scatter Kontrola "čistoty" lymfocytárního ohraničení na základě FS a SS CC CD CD H—' CG O cn CD "D Lij Lfi r-j 255 Forward Scatter (linear) O) o LU CL Q O CD45 FITC (log) R1=monocyty (CD14+) R2=lymphocyty (CD45>monocyty) R3=granulocyty (CD45<; ,=,.m CD3 Q1 CD3-CD84-02 CD34 CD8+ Q3 CD3- CDS-Q4 CD3+ CD8» Subset Name Total T (CD3+) Lymphocytes T Cytotoxic (CD3+.CD8+) Lymphs Conv 4 29 20 47 Conv %L 76 29 OK OK Operator defined markers are in effect. Imunofenotypizace v programu Simulset Krok 6 - Stanoveni NK-lymfocytu FITCCD3 PECD56 Events acquired: 14000 Data set:[l] Gated Evsnts:2077 8 Means: 151 28 Ff.1 Ff.2 Marker 76 73 CD3/CD56 q WITypp- ■ ■ja«? ■ ■ M M CD3 Q1 CD3- CD56+ Q2 CD3+ CD56+ Q3 CD3- CD5e-Q4 CD3+ CD56- Subset Name Total T (CD3+) Lymphocytes Total NK (CD56+)Lymphocytes Conv 12 6 12 70 Conv %L 76 12 OK OK Operator defined markers are in effect. Příklad panelu antigénu stanovovaných při detekci plasmatických buněk CD138 Plasma cells CD38 Plasma cells, Activated T-cells CD56 Natural Killer Cells CD45 Human Leukocytes cKappa Cytoplasmic light chain cLambda Cytoplasmic light chain Více barevná imunofenotypizace Vizualizace jednotlivých populací FL4 FL4 FL1 FL2 FL3 FL3 FL1 FL2 FL1 barvy barvy Tří barevná imunofenotypizace pro stanovení CD4 a CD8 lymfocytů Kombinace tří protilátek označených třemi různými fluorochromy např. FITC, PE, Per CP Kombinace grafů - tří barevná imunofenotypizace CD3, CD4, CD8 TTnflT^^ I I I llll| I I I I lili | I I I 111111 I I ITTTTTp~l~ITTrTTTl~~rTTTTTTT| -^^^f^jflp^^^flp^^^ CD3 CD8 CD3 CD3-CD4- CD3-CD8+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ Tc lymf CD3+CD4- Čtyř barevná imunofenotypizace CD3, CD4, CD8, CD56 v jedné zkumavce CD3 CD56 ■■■■ ■- ■ ■ - z * CD3 Q i i i i i 1111 i i i i 11111 i i i i i 11 li i i i i 111 li ■ ■ " ■ ■■ ■ -yo".H .. CD56 i—i i i i lil-1—i i i i in-1—i—i i i in-1—i i i li li Q I I I I III I I I I I III ■ CD3 CD8 Čtyřbarevná imunofenotypizace v klinice (př. BD kity a HW/SW) 1. Zkumavka CD3FITC, CD45PerCP, CD4APC, CD8PE Specificity Clone Format Isotype CD4 SK3 {also known as I_eu3a) APC IgGi, k CD3 SK7 (also known as Leu-4) FITC IgGi, k CD8 SKI PE CD45 2D1 PerCP IgGi.k 2. Zkumavka CD3FITC, CD45PerCP, CD19APC, CD16+56PE Specificity Clone Format Isotype CD19 SI25C1 (also known as SJ25-C1) APC IgGi, K CD3 SK7 (also known as Leu-4) FITC IgGi. k CD16 (FcyRIII) B73.1 PE IgGi.K CD56 (NCAM-1) NCAM16.2 (also known as NCAM 16) PE IgG2b, K CD45 2D1 PerCP IgG^ K Čtyřbarevná imunofenotypizace v klinice (př. BD kit a HW/SW) 1. Zkumavka CD3FITC, CD45PerCP, CD4APC, CD8PE 2. Zkumavka CD3FITC, CD45PerCP, CD19APC, CD16+56PE < g-o *~ CD CD g Lymphocyte, j -MÉ rmni]—i i illlll| I l llini|—i i nini|—r 102 103 1o" 1DS CD45 PerCP-A < ó co CD cd3- cd3+ CD3 FITC-A CD3+ Biexponential display (FACSDiva SW) CD3- K0VACIK-CD3/CD8/CD45/CD4 o *~ o. < :d4+ cd4-8- 1 1 I II I 1 1 cd4+8+ cd3+ -320 rmni]—m 103 10* CDS PE-A 10 KOVACÍ K-CD3/CD1 6+56/CD4Í o ~- Q_ < Q =-o _ -3S0 B...-:- q3 q2 NK 'III L........I 1 0 1D3 10 CD16+56 PE-A 10 Population z CD 3+ z Lymphogate CD4+ CD4+8+ CD4-S-CD8+ 46.8 0.3 7.2 45.8 24.4 0.1 3.7 23.9 Population zCD3- z Lymphogate [X]B 39.3 17.9 IXlNK 59.6 27.2 CD3+ Logarithmic display (FACSCanto SW) CD3- KOVACIK-CD3/CD8/CD45/CD4 o ~-< Q =- o CD4+ CD4+8+ CD4-8- CD8 + 10 10 10 CDS PE-A 10 KOVACÍ K-CD3/CD1 6+56/CD4Í Ó s- Q. < o 02 í Q3 11 r.....1 i imr NK n—i i ii um .........—ť CD16+56 PE-A Výsledný report /in :■■>.......■ ■ - ■ ■■_ LyniťiiH l>:l[tfCnc m.- ■ Pi_j: jiTĺ i-' 4 • Vŕtal twte llľťa? t P* í D* ■ 1 • - cdljcir4- 1 e ikdh ---- 1 ŕ* í 'V* 1-1 ■ Tl±í= 2 Lymph Cvtati <57l ■LÍ.U- ^ L h1 ■ 11_- ■ t .■.■.-■r D H.gi ito 1DÖ11 Parameter "Lie 1 Tlíc 2 _yi;:l Lv»"L jjl-j -ivi '.J,- *LYT|j L. CCG-ř Aba Cnt D 33.91 ■ ._^-R"_Jit- .r-:^ Lit 0 ■>1.30 Q \J t ^ - :.-:LYT|J ■ isa : jLi-hO>n-:ja+ Ah* o* Q Q r. D 1.31 ■.j:::-:.l>..- %Lhniurc i____— r-lji. i: r. i L ,-i i i: CD2% LifTcrcncť bt D.Ú3 % T-Surťi 1173 LvTrphmjm IK &ľ. 7* -tfS ratio t 1.3i Cnecx morcrciiifc drv oJatle ľk dLdrm ranye. Cammtnti Výsledný report Příklad osmi barevná imunofenotypizace 8-color Antigen-Specific Im mu nop he no ty pi ng Ab Conjugate Laser CD28 PerCP-Cy5.5 438 CD45RA PE-Cy7 438 CD27 APC 633 Surface CD8 APC-Cy7 633 staining CD3 Pacific Blue 405 C04 AmCyan 4Q5 Anti-IFNy FITC 438 Intracell Anti-IL-2 PE 438 staining Příklad 17 barevná imunofenotypizace Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system CD4Tcells CD11a CD27 CD45RA Dim J3 Bright Stephen R Rerjetto, Pratip K, Chattopadhyay and Mario Roederer 42 *1 CCR7 20 16 + + n In Ik In D IL-2+IFN-y" □ IL-2iFN-v+ □ IL-2+IFN-y+ Figure 6 | Visualization of polychromatic data using hierarchical trees. The data shewn in this hierarchical tree were obtained from peripheral-blood mononuclear cells stimulated with staphylococcal enterotoxin B (for 6 hours in the presence of brefeldin A). The cells were subsequently permeabilized and stained for various eel I-surface markers and intracellular cytokines, Branches of the tree segregate based on the expression level (for example, positive versus negative or bright versus dim) of a particular marker, and each terminal branch represents one fully gated subset, So, reading from the top, the branch below arrow 1 represents cells that are CD3+CD4+CD11adimCD27+GD45RA+CC-chemokine receptor 7 (GCR7)+. The frequency histogram below the tree indicates the relative proportion of cells in each subset that express interleukin-2 (IL-2) (blue bars), interferon-Y(IFN--j) (green bars) or both (red bars). So, the CD 11 adimCD27+CD45RA+GCR7+ cell population indicated by arrow 1 expresses only IL-2, which is consistent with a naive phenotype, Interestingly, IL-2 is expressed by a greater fraction of a naive-like subset (CD11atJimCD27-CD45RA+CCR7+ cells), in which cells have lost expression of CD27 but not other markers (arrow 2). In contrast, high expression of IFN-y is mainly observed in CD11 abri9htGD27" cells (arrow 3), a phenotype previously associated with effector memory T cells. Graphical representations such as this offer many options for data exploration, especially when the hierarchy can be rearranged to bring patterns into view, Lase r excitation wavelength FITC PE TRPE CV5PE Cy5.5PE CV7PE E APC 0 as Alexa - Fluor 680 1 i Cy7APC AmCyan ODÓ05 QD855 488 D 532 a33 407 m«-i m _ n 1 1. . 1 1 1 1.—. ■ ■ n__ 1 1 m 1 1 — _ ■ ■ nil n 1 1 _l lr—1 1—1 n www, n a t u re, c o m / rev i ews/i m n u 11 ol Hematologie Použití imunofenoptypizace pro detekci hematologických onemocnění • Stanovení zastoupení jednotlivých buněčných inu • Stanovení stupně diferenciace • Stanovení monoklonální populace (B-lymfocyty) Haematopoeza Unconnmitted stem cell gives rise to connm rtted cells proerythroblast m eg a ka ryo b I ast myeloblast monoblast lymphoblasr: erythrocyte platelets neutrophil basophil eosinophil^ monocyte lymphocyte V granulocytes Příklad identifikace buněk myeloidních linií proerythroblast CD34+ CD13-(CD36+) monoblast CD34+ CD13+ CD115+ Uncommitted stem cell gives rise to committed cells myeloblast CD34+ CD13+ CD115- T C 58.7 CO 7.4 15.3:,Vt , 10°' ' id1 CD36 SSl8.6 103 104 erythroid monoblasts myeloblasts FSC Příklad panelu CD antigénu stanovovaných při detekci lymfomů CD45 Human Leukocytes CD3 Pan T Lymphocytes CD5 Pan T Lymphocytes CD7 Pan T Lymphocytes CD4 T-helper Lymphocytes CD8 T-suppressor/cytotoxic Lymphocytes CD10 B-cells CD19 Pan B-cells CD20 Mature B-cells FMC7 Activated B-cells CD23 Activated B-cells CD38 Plasma cells, activated T-cells CD103 T and B Lymphocytes CD11c T and B cells, NK cells, monocytes CD25 Activated B-cells CD22 B-cells Kappa Light chains Lambda Light chains Příklad panelu CD antigénu stanovovaných při detekci leukémií CD45 Human Leukocytes CD5 Pan T Lymphocytes CD10 B Lymphocytes CD19 Pan B Lymphocytes CD20 Mature B Lymphocytes HLA-DR (13) Activated T and B Lymphocytes CD34 Progenitor Cell CD117 Progenitor Cell CD15 Monocytes/Granulocytes CD33 Myelocyte/Monocyte CD56 Natural Killer Cells CD14 Monocyte CD13 Myelocyte/Monocyte CD64 Monocytes cMPO Myeloperoxidase c79a B Cells C3 Cytoplasmic CD3T Cells cTDT Immature Lymphocytes/thymocytes Detekce intracelulární produkce cytokinů - Charakterizace různých subpopulací leukocytů, které lze rozlišit na základě rozdílné produkce cytokinů - Charakterizace funkčních vlastností buněk odpověď na vybraný stimul Diferenciace pomocných T-lymfocytů (CD4+ T-lymfocyty; Th lymfocyty) Receptor Naivní pomocný T-lynntocyt {CD3+CD4+) IL-4 IL-12 IF N - y TGF-ffi IL-2 3 Receptor IL-23 B-lymfocyty (Eosinofily Ba30fily) Makro ragy NK-lyrnfocyty NeiJtrofilní granul ocyty Neutralizační protilátky Obrana proti hlemintům Alergie,astma Obrana proti intracelulámím patogenůrn Obrana proti extracelulámim baktériím Autoimunitní onemocněni TGF-111 IL-10 Imunosuprese BD Fastlmmune™ Cytokine Flow Cytometry Protocol 1. Stimulate whole blood or PBMC 2. Lyse/Fix 3. Permeabilize 4. Stain 1 111 6 h (°| Wash Q Wash g / + Brefeldin A Wash 5. Flow cytometry anti-IFNy FITC Pokračování druhé části přednášky Příklady aplikace průtokové cytometrie v klinické imunologii a hematologii Funkční testy Změna exprese vybraných povrchových markrů (většinou receptory nezbytné pro funkci daného lymfocytu) Produkce volných radikálů fagocyty Detekce oxidu dusnatého Fagocytární aktivita Stanovení funkčních vlastností trombocytů