Biosensory (analytická biochemie) Petr Skládal Ústav biochemie PřF MU skladal@chemi.muni.cz Biosensory dnes …  hlavně glukosa  běžně v lékárnách, e-shopech, propojení s mobilem IOT a bioanalytika?  diabetes: pumpa (1) dávkující kontinuálně inzulin (2) je na základě dat z biosensoru pro glukosu (3) řízena aplikací ve smartphonu (4), který data posílá na web www.medtronic.com Biosensor je analytický přístroj převodník elektronická (transducer) jednotka biorekogni ční vrstva analyt výstupní signál obsahující citlivý prvek biologického původu, který je buď součástí nebo v těsném kontaktu s fyzikálněchemickým převodníkem. Poskytuje průběžný elektronický signál, který je přímo úměrný koncentraci jedné nebo několika (skupiny) chemických látek ve vzorku . Biorekogniční složka rozpoznává stanovovanou látku, kterou specificky buď:  přeměňuje: enzym, organela, buňka, tkáň, orgán, organismus – analyt je substrátem či inhibitorem  nebo váže: protilátky s antigeny (hapteny) hybridizace nukleových kyselin vazba ligandů na receptory interakce sacharidů s lektiny Fyzikálně-chemický převodník  elektrochemické (potenciometrie, amperometrie, voltametrie)  optické (fotometrie, fluorimetrie, luminometrie, fotonika)  piezoelektrické a akustické  elektromagnetické, kalorimetrické, nanomechanické Glukosa, laktát, …  amperometrické průtočné biosensory – typicky klinická laboratoř  analýza kultivačních směsí, dvě opakované série měření 0 10 20 30 40 50 60 0 100 200 300 i (nA) t (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 70 140 i (nA) t (min) glukosa laktát 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 50 100 150 200 250 300 imax (nA) [lactate] (mM) y = Bx y = A+Bx B=256.70952 (4.3) R=0.985 A=9.86077 (2.8) B=243.05614 (5.5) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 0 200 400 600 800 i (nA) [glucose] (mM) y=Bx y=A+Bx B=496.81497 (5.0) R=0.998 A=4.35007 (6.6) B=492.88271 (7.8) Mikrodialýza  dlouhodobé monitorování SP2 mix biosensor SP1 glucose (1 mM) PB S PB S 2 3 4 1 outvalve PB S cells 1 cells 2 microdial. probe 0 400 800 1200 1600 2000 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 gluc 0.5 mM cells 2 icalib ipeak i (A) t (s) Repeated cycle: 300 OMN_Next cells1 800 OMN_Next PBS 1100 OMN_Next cells2 1600 OMN_Next pbs 1850 SP1_Rate 5 gluc 1 mM 2000 SP1_Rate 0 pbs only iss cells 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0.0 0.1 0.2 0.3 ExpDecay1 y=A*exp(-x/t1 )+y0 y0 =0.15665 ± 0.0028 A=0.10879 ± 0.0026 t1 =4.45962 ± 0.36 2 /DoF=5.99E-6 R 2 =0.994 i (A) t (h) ( ) Stability of GOD biosensor (response to 0.5 mM glucose)not used 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10 12 [gluc] (mM) t (h) Glucose at cultivation cells 1 2 constant sensitivity cells 1 2 corrected sensitivity Inhibice cholinesterasy  enzym účinkuje v nervové soustavě při přenosu vzruchů  organofosfáty pesticidy (insekticidy dichlorvos, actelic, …) bojové otravné látky (sarin, soman, tabun, novičok) R alkyl, aryl; R’ alkyloxy, aryloxy, subst. amin; X odcházející skupina - CN, F, p-nitrofenyl, fosfodiester; Z = O nebo S  karbamáty pesticidy (carbofuran, carbaryl, aldicarb, …) R,R’ H, alkyl, aryl; X odcházející skupina - CN, F, p-nitrofenyl  používané enzymy: acetylcholinesterasa (AChE, EC 3.1.1.7) a butyrylcholinesterasa (BChE, EC 3.1.1.8); rekombinantní ChE - lepší vlastnosti úpravou aktivního místa  pokud není známý druh pesticidu před vlastní analysou, lze stanovit parametr anticholinesterasová toxicita P X R O R ' Z O C XN R R' AChE biosensor pro armádu 10 20 30 40 100 150 5 10 15 20 0 100 200 Time (hours) I (nA) 30 32 (min) t ( o C) ZOOM Inhibitor Substrate (ve vzduchu)  sarin, soman, novičok – válečné použití, také moderní teroristé  dlouhodobé monitorování ve vzduchu  alarm systém Multikanálový biosensor pro charakterizaci odpadních vod 5x1.2 cm Pt / grafitové pracovní elektrody (7101) • tyrosinasa (Tyr) • peroxidasy (HRP, SBP) • celobiosa dehydrogenasa (CDH) • glukosa oxidasa (GOX) • acetylcholinesterasa (AChE) • butyrylcholinesteasa (BChE) Þ zesíťování glutaraldehydem BChETYR CDH grafit Pt HRP/GOx SBP/GOx AChE - 30 - 20 - 10 0 10 20 30 - 10 - 5 0 5 10 15 20 WAT NO AT AL UN - 30 - 20 - 10 0 10 20 30 - 10 - 5 0 5 10 15 20 PC1 PC2 WATER NORMAL UNTREATED ALARM ALERT Zjednodušená klasifikace kombinace s chemometrií (PCA) zjednodušuje interpretaci komplexních dat pro uživatele inteligentní biosensor -2 -1 0 1 2 3 -2 -1 0 1 2 1wGV 2wrL 3rSL 4wW 5rL 6wPG 7wR 8wP 9rL 10wFV 11wSBN 12wPG 13wGV 14wGV 15wR 16wPG 17wMM 18wMT 19rZ 20wFV 21wPB 22wGV 23wSB 24wGV 25wSB 26wChB 27wPG 28wCh 29wSB 30wPG 31wPG B5 B4 B3 B2 PC2 PC1 B1 medium tannins, oak / vanilla / flovery buquet high tartness, (semi)dry apple taste / flavour higher acidity, high sourness, botrytis bouquet high acidity, apple flavour Bioelektronický jazyk: chuť produktu vzorek „trénink“ (kalibrace) enzymové elektrody chemometrické hodnocení Výstup: dobrý produkt! (bezpečnost, originalita, stáří, falšování, složení, …)multikanálový detektor P. Skladal. Smart bioelectronic tongues for food and drinks control. Trends Anal. Chem. 2020, 127, 115887. Electrochemické imunosensory substrate enzyme product antibody conjugate microbe sensor se zachytávací Ab tracer = druhá Ab v konjugátu s enzymem-značkou Postup: Inkubace se vzorkem, promytí Inkubace s tracerem, promytí Měření odezvy - elektrochemicky  citlivost a jednoduchost  specifita – protilátky (Ab) electrode Živé bu kyň – Francisella tularensis 0 1 2 3 4 5 -2 -1 0 I (mA) t (min) 0 1 2 3 4 5 -1 0 I ( mA) t (min) Specifický kanál, anti-FT Ab Nespecifický kanál anti-albumin Ab kontrola 100 cfu/ml 1000 104 105 SS Impedanční imunosensor - salmonela  EIS – není třeba značit  duální Au sensor  imobilizce Ab na cysteamin, blokace BSA Salmonella a imuno-SPE  Je bakterie opravdu zachycena?  AFM sken povrchu – nalezena buňka Salmonelly  A) error, B) height  (FastScan Bio) AFM mikroskopie atomárních sil Optický biosensor - Salmonella  přímo, bez značení  Biacore 3000 … nejcitlivější systém   A) vazba bakterií  B) kalibrace – AFM skeny měřícího a referenčního kanálu Lepší citlivost – zesílení odezvy  SPR / BioNavis (robustní …)  A) SPR chip s primární protilátkou  B) zachycená Salmonella  C) vazba HRP-Ab2 konjugátu  D) biokatalytická konverze 4-chloro-1-naftolu na nerozpustný benzo-4- chlorocyklohexadienon Normal vs. “zvýrazn ný” mikrobě  3D reprezentace AFM skenů A) nativní a B) pokryté precipitátem buňky Salmonelly  C) řezy bakterií Kalibrace  Odezvy po vzniku precipitátu  40× lepší citlivost  Limit detekce LOD 102 CFU/ml Bioaerosoly PBS tracer H2O2 +acetate iodide+acetate RS232/TC-IP SASS 2300 ImmunoSMART router immunosensor mixing holding mixing coil waste flow cell AIR cyclone fan pp pp pp1 .. pp4 PC SASS 2300 (Research International) LAN  (nebezpečné) bakterie ve vzduchu Polní testy Testy v aerosolové komo eř Electrode with immobilized Ab3: purified Ig E. coli disseminated 100 nA 2 min iodide no dissemination POZITIVNÍ DETEKCE! Měřící postup: - cyclon – vzorkování vzduchu (5 min) - inkubace vzorku s imunosensorem (10 min) - H2O2 – substrát pro peroxidasu - přídavek jodidu (2 min) - odezva Reference measurements  slit samplers - rotating agar plates, air stream passing through a narrow slit to the plate, cultivation count of viable microbial particles 13:52 13:55 13:58 0 50 100 Living E. coli cells per liter Time Slit sampler data samling t = 8 s dissemination interval cyclone ON Total particles some 10 4 l -1 (dust, dead E. coli, other microbes, ...) Buňky a biosensory  buňky jako biorekogniční element  studium vlastností buněk pomocí biosensorových technologií Buněčný systém - komplexnost vstupní signály růstové faktory, antigeny/protilátky, hormony, adhezní faktory, teplota, pH, … výstupní signály pH, ionty (Na+ , K+ , Ca2+ , Cl), regulační látky (NO, glutamát, ...), obranné (ROS - peroxid vodíku, superoxid. radikál), adheze, morfologie, CO2, membr. potenciál, … receptory modulátory metabolismus pH pH- regulace vesikulární transport O, glukosa, léčiva2 adheze a morfologie proliferace enzymové kaskády cytostatika Mikroskopie ...  měření síly mezi hrotem a vzorkem, hrot je na konci pružného nosníku (cantilever)  vznikající síly vedou k prohnutí nosníku (deflection)  na základě znalosti jeho tuhosti pak lze vyhodnotit velikosti působících sil AFM = mikroskopie atomárních sil (atomic force microscopy) „osaháváme vzorek“ v nativním prostředí síla čas léčivo rychlost tepů AFM hlava CMs Nano-biosensing s kardiomyocyty (CM)  sledování tepání kardiomyocytů je snadné (mikroskop, video)  nanomechanický převodník – kantilevr z AFM – síla tepů - mechanokardiogram  efekty testovaných látek v reálném čase  klinický buněčný model – studium srdečních poruch: Duchennova svalová dystrofie, arytmie, Fabryho nemoc, … Biosensors and Bioelectronics 85 (2016) 751–757; 124-5 (2019) 129-135 Výchylka kantilevru v čase pro různé testované látky kontrola (medium) isoproterenol (aktivátor) metoprolol (betablokátor) kofein ‘heart on chip’ Síla a elektrický potenciál  CMs zachyceny na povrchu pole mikroelektrod  synchronní záznam síly tepu a iniciace změnou el. potenciálu Biosensory ...  bioanalytické použití – koncentrace látek, detekce mikrobů, …  věda - studium biochemických a biologických procesů  spojení s nanobiotechnologiemi – zlepšení funkce, miniaturizace  malé a levné  rychlé, citlivé a specifické  uživatelsky přívětivé  nejzajímavějších je 10% těch zcela neočekávaných výsledků New Scientist, 2020