Úloha č. 6
RealTime PCR diagnostika celiakie
ÚVOD
Diagnostika bude prováděna komerční soupravou, která slouží ke genotypizaci HLA-DQ2
(DQA1*05/DQB1*02), HLA-DQ8 (DQA1*03/DQB1*0302) a HLA-DR4 (DRB1*04) genů z
izolované DNA. Diagnostická souprava je založena na principu RealTime PCR. Pro detekci alel
DQ2, DQ8 a DR4 a interní kontroly jsou použity primery a značené sondy (FAM a JOE).
Celiakie patři mezi jedno z nejčastějších entero-patogenních onemocnění a je
charakterizovaná celoživotní přecitlivělostí k lepku, proteinu obsaženém v pšenici, žitě, ovsu a
ječmeni. Celiakie nepatří mezi alergická onemocnění, ale je charakterizovaná intolerancí ke
gliadinu tvořícím část lepku. Imunologická nesnášenlivost k lepku vede v raném dětství ke
chronické zánětlivé odpovědi u sliznice tenkého střeva s následnou špatnou absorpcí
vyznačující se chronickým průjmem, tukovitou stolicí a špatným růstem. Celá řada dospělých
pacientů poté může pociťovat jiné atypické příznaky jako nadýmání, hubnutí, únavu, problémy
s pokožkou a klouby nebo migrény. Naopak celá řada lidí nemusí pociťovat vůbec žádné
příznaky. Neléčená celiakie poté zvyšuje riziko NHL (non-Hodgkinovského lymfomu) a zřejmě
i riziko rakoviny tenkého střeva.
Do dnešní doby byla celiakie vnímána jako relativně vzácné onemocnění s mírou prevalence
1:1000 až 1:4000. Avšak nově dostupnost sérologických testů vedla k pozorování, že celiakie
je daleko častější onemocnění, než bylo dříve předpokládáno, postihující v Evropě zhruba 1 ze
100-400 osob. Většina diagnostikovaných pacientů vykazovala minimální klinické příznaky.
Poslední výsledky navíc ukazují na silnou genetickou vazbu ve spojení s rozvojem celiakie.
Celiakie je multifaktoriální onemocnění asociované s alelami HLA-DQ2 (DQA1*05/DQB1*02)
nebo DQ8 (DQA1*0301/DQB1*0302), která je asociována v haplotypu s alelou HLA-DR4
(DRB1*04). HLA DQ2 alela je exprimována u většiny osob trpících celiakií (> 90 %), DQ8 alela
poté asi u 8 %. Exprese zmíněných alel je nezbytná, ne však dostatečná, k propuknutí celiakie.
V současné době se předpokládá asi 50% vliv genetické složky na vznik celiakie. U osob trpících
celiakií je výskyt HLA-DQ2 alely asi 95%, zatímco u běžné populace je výskyt této alely pouze
20%. Z malé skupiny osob trpících celiakií a negativních pro HLA-DQ2 (DQA1*05/DQB1*02)
alelu, je drtivá většina pozitivní na HLA-DQ8 alelu. Z tohoto pohledu je absence zmíněných alel
velmi dobře využitelná pro vyloučení celiakie.
Souprava detekuje alely HLA-DQ2 (DQA1*05, DQB1*02), HLA-DQ8 (DQA1*03, DQB1*0302) a
HLA-DR4 (DRB1*04). Jako vnitřní kontrola je použit lidský gen SYPL2 (synaptophysin-like 2)
• Pro detekci DQA1*05, DRB1*04 a DQB1*0302 alel je použita sonda značená FAM
barvou (exc. 494 nm – em. 518 nm)
• Pro detekci DQA1*03, DQB1*02 a SYPL2 (interní kontrola) alel je použita sonda
značená JOE barvou (exc. 520 nm – emise 548 nm)
• Reakční Mix obsahuje pasivní referenční barvu High-ROX pro normalizaci signálu
PRACOVNÍ POSTUP
Upozornění:
Při práci vždy používejte rukavice. Veškerý materiál v laboratoři je nutno považovat za
potenciálně infekční. Vyhněte se kontaktu reagencií s kůží. V případě kontaktu, potřísněné
místo omyjte důkladně vodou. Vyvarujte se požití součástí kitu. Reagencie označené jako
hořlavé musejí být drženy v dostatečné vzdálenosti od otevřeného plamene nebo ohně.
I. Příprava reakčního Mixu (MasterMixu):
Materiál: pipety, špičky, PCR destičky, izolát DNA z 1. úlohy, voda pro molekulární biologii,
kit EliGene® Coeliac RT
• Detekce: Vezměte jednu zkumavku s CELI-DQ2 Mixem, jednu zkumavku s CELI-DQ8
Mixem a jednu zkumavku s CELI-DR4 Mixem. Po rozmrazení, promíchání a krátkém
stočení pipetujte do tří sad amplifikačních zkumavek po 17,5 µl každého mixu a
přidejte 2,5 µl izolované DNA.
• Pozitivní kontrola: Vezměte jednu zkumavku s CELI-DQ2 Mixem, jednu zkumavku s
CELI-DQ8 Mixem a jednu zkumavku s CELI-DR4 Mixem. Po rozmrazení, promíchání a
krátkém stočení pipetujte do tří sad amplifikačních zkumavek po 17,5 µl každého Mixu
a přidejte 2,5 µl pozitivní kontroly DNA (PC CELI).
II. Spuštění RealTime PCR - LightCycler® 480 (Roche):
Pro reakci používejte pouze bílé destičky. Použití průhledných destiček může vést k poklesu
citlivosti kitu. Nepoužívejte destičky opakovaně; při manipulaci s destičkou může dojít ke
kontaminaci laboratoře PCR produkty.
V možnosti Detection format zvolte “Dual Color Hydrolysis probe”.
Nastavte následující teplotní profil:
95°C 3 min
95°C
40x 58°C
40°C
15 sek (denaturace)
40 sek (annealing)
1 min
III. Interpretace výsledků:
HLA-DQ2 (DQA1*05/DQB1*02) pozitivní
Pokud je pozorován před cyklem 35 nárůst emisního spektra u CELI-DQ2 Mixu v obou kanálech
FAM (DQA1*05) a JOE (DQB1*02) a zároveň rozdíl Ct hodnot mezi signálem v kanálu FAM
(DQA1*05) a kanálu JOE (DQB1*02) není vyšší než 4.
HLA-DQ2 (DQA1*05/DQB1*02) negativní
Pokud není pozorován před cyklem 35 nárůst emisního spektra u CELI-DQ2 Mixu v obou
kanálech FAM (DQA1*05) a JOE (DQB1*02) nebo rozdíl Ct hodnot mezi signálem v kanálu FAM
(DQA1*05) a kanálu JOE (DQB1*02) je vyšší než 4. Signál pro vnitřní kontrolu (SYPL2) v JOE
kanálu u CELI-DR4 Mixu však musí být pozitivní.
Důležitá poznámka: Pro HLA-DQ2 pozitivní výsledek je nutné mít pozitivní výsledek pro obě
alely, DQA1*05 a DQB1*02. Pokud je pozitivní pouze jedna z alel, pacient není HLA-DQ2
pozitivní.
HLA-DQ8 (DQA1*03/DQB1*0302) pozitivní
Pokud je pozorován před cyklem 35 nárůst emisního spektra u CELIDQ8 Mixu v obou kanálech
FAM (DQB1*0302) a JOE (DQA1*03) a zároveň rozdíl Ct hodnot mezi signálem v kanálu FAM
(DQB1*0302) a kanálu JOE (DQA1*03) není vyšší než 4.
HLA-DQ8 (DQA1*03/DQB1*0302) negativní
Pokud není pozorován před cyklem 35 nárůst emisního spektra u CELIDQ8 Mixu v obou
kanálech FAM (DQB1*0302) a JOE (DQA1*03) nebo rozdíl Ct hodnot mezi signálem v kanálu
FAM (DQB1*0302) a kanálu JOE (DQA1*03) je vyšší než 4. Signál pro vnitřní kontrolu (SYPL2)
v JOE kanálu u CELI-DR4 Mixu však musí být pozitivní.
Důležitá poznámka: Pro HLA-DQ8 pozitivní výsledek je nutné mít pozitivní výsledek pro obě
alely, DQA1*03 a DQB1*0302. Pokud je pozitivní pouze jedna z alel, pacient není HLA-DQ8
pozitivní.
HLA-DR4 pozitivní
Pokud je pozorován před cyklem 35 nárůst emisního spektra u CELI-DR4 Mixu v kanálu FAM
(DRB1*04) je vzorek HLA-DR4 pozitivní.
Důležitá poznámka: Vzhledem k tomu, že se DR4 alela vyskytuje v haplotypu s DQ8 alelou, je
při detekované pozitivitě DQ8 alely detekována i pozitivita v DR4 alele.
HLA-DR4 negativní
Pokud není pozorován před cyklem 35 nárůst emisního spektra u CELI-DR4 Mixu v kanálu FAM
(DRB1*04) je vzorek HLA-DRB1*04 negativní. Signál pro vnitřní kontrolu (SYPL2) v JOE kanálu
u CELI-DR4 Mixu však musí být pozitivní
Pozitivní výsledek
DQ2, DQ8 a/nebo DR4 alela byly zjištěny ve vzorku
Inhibovaný vzorek
V případě, že nedojde k nárůstu amplifikačního signálu u CELI-DR4 Mixu v kanálu JOE je nutné
analýzu zopakovat nejlépe s nově izolovanými vzorky DNA.
Následující tabulka shrnuje výsledky popisující genetickou predispozici pro celiakii