Úloha A - Analýza izoenzymů APX a aktivity PAL
Jméno a UCO:
Datum:
ÚLOHA A
Analýza izoenzymů askorbát peroxidasy (APX) pomocí nativní PAGE a aktivity Phenylalanin
amoniak-lyasy (PAL)
TEORETICKÝ ÚVOD
V rostlinných buňkách je hlavním detoxikačním systémem peroxidu vodíku askorbát-glutathion cyklus, ve kterém hraje klíčovou roli enzym askorbát peroxidasa (APX) katalyzující přeměnu H2O2 na vodu za použití askorbátu jako specifického donoru elektronů:
2 askorbát + H2O2 ->  2 monodehydroaskorbát + 2 H2O
V odlišných částech buňky, jako jsou chloroplasty, mitochondrie, peroxisomya cytosol, jsou přítomné různé izoformy APX. Exprese jednotlivých genů APX je regulována jak v rámci biotického, tak abiotického stresu a dále poté v rámci vývoje rostlin. Aktivita APX se tak přímo podílí na ochraně rostlinných buněk před nepříznivými environmentálními podmínkami. Vlastní úloha enzymu APX v rámci o branné reakce rostlin je poté podpořena celou řadou výsledků ukazujících narůst nebo naopak její aktivity v rámci infekce rostliny patogenem. Výrazný pokles její aktivity je poté většinou spojen s nekrózou buněk způsobenou převážně oxidačním stresem.
Využití nativní polyalkrylamidové elektroforézy pro stanovování aktivit celé řady enzymů má převážně největší význam při studiu aktivace jednotlivých izoenzymových forem. Sledování aktivity APX je založeno na její schopnosti zabránit askrobát-dependentní redukci nitroblue tetrazolia v přítomnosti H2O2 a N,N,N',N'-tetraethylendiaminu (TEMED) na nerozpustný barevný formazan. Výsledná aktivita APX je tak pozorována na gelu jako achromatický proužek. Tato metoda je velmi citlivá a (detekce méně než 0,01 jednotek APX) a specifická pro měření aktivity APX.
V rostlinné buňce existujítři základní regulačníenzymy účastnící se syntézy fytoalexinů, Phenylalanin amoniak-lyasa (PAL), 5-epiaristolochen syntasa (EAS) a 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductasa (HMGR). Aktivace enzymu PAL (EC: 4.3.1.5) je spojena s akumulací
1
fenylpropanoidních látek a se syntézou důležité signální molekuly, kyseliny salicylové. PAL katalyzuje reakci přeměny aminokyseliny L-phenylalaninu na kyselinu trans-skořicovou:
Aktivita PAL se dá velmi dobře měřit nárůstem absorbance kyseliny trans-skořicové při 290nm.
POSTUP PRÁCE
Infiltrace neznámého vzorku do listu tabáku
Jednotlivé skupiny obdrží roztoky neznámého vzorku pro nasátí skrze listovou petiolu. Pro infiltraci skrze petiolu napipetujte cca 300 u.1 neznámého vzorku do malé 0.2ml eppendorfky a seříznutý list nechte nasát tekutinu z eppendorfky (viz. obrázek 1) po dobu cca 30 minut. Poté přendejte list do vody a inkubujte 24 hodin.
Izolace askorbát peroxidase
1. Odeberte 0,3 g rostlinného pletiva po 24 h inkubaci s neznámým vzorkem a rozdrťte ho v tekutém dusíku.
2. Následně přidejte 0,6 ml izolačního pufru (100 mM fosfátový pufr (pH=7.0), 5 mM askorbát, 1 mM EDTA) a dobře zvortexujte.
H
Obrázek 1: Přímá infiltrace neznámého vzorku skrze petiolu
2
Úloha A - Analýza izoenzymů APX a aktivity PAL
3. Homogenát centrifugujte při 12 000 x g 5 min při 4°C.
4. Supernatant přeneste do nové 1.5 ml zkumavky a opět centrifugujte při 20 000 x g 40 min při 4°C.
5. Odsajte supernatant a uchovávejte ho na ledu. Izolace phenylalaninamoniak lyasy
1. Odeberte 0,3 g rostlinného pletiva po 24 h inkubaci s neznámým vzorkem a rozdrťte ho v tekutém dusíku.
2. Následně přidejte 0,6 ml izolačního pufru (0,1 M Borát (pH= 8.8), 17 mM |3-merkaptoethanol, 1 % PVP) a dobře zvortexujte.
3. Homogenát centrifugujte při 12 000 x g 5 min při 4°C.
4. Supernatant přeneste do nové 1.5 ml zkumavky a opět centrifugujte při 20 000 x g 40 min při 4°C.
5. Odsajte supernatant a uchovávejte ho na ledu. Příprava polvakrylamidového gelu
1. Gel propláchněte vodou, vložte do elektroforetické vany a přilijte elektroforetický pufr obsahující 2 mM askorbát.
2. Spusťte elektroforézu na 30 minut při konstantním proudu 15 mA/gel. Elektroforézu provádějte při 4°C.
Příprava a nanesení vzorků
1. Smíchejte 60 u.1 enzymového izolátu askorbát peroxidasy s 12 u.1 nanášecího pufru (50% Glycerol, 0.05% Bromfenolová modř).
2. Na gel nanášejte 15 u.1 jednotlivých izolátu
3. Elektroforézu provádějte při konstantním proudu 15 mA/gel po dobu 2 hodin při 4 °C. Detekce aktivity askorbát peroxidasy v gelu
Všechny následující kroky budou prováděny při pokojové teplotě.
1. Ekvilibrujte gel 5 minut v 20 ml ekvilibračního pufru I (50 mM fosfátový pufr (pH=7.0), 2mM askorbát).
2. Poté inkubujte gely 10 minut v 20 ml ekvilibračního pufru II, do kterého přidejte 6 u.1 peroxidu vodíku.
3. Poté gel promyjte 1 minutu v 20 ml promývacího pufru (50 mM fosfátový pufr (pH=7.0)) a ponořte ho do detekčního pufru (50 mM fosfátový pufr (pH=7.8), 28 mM TEMED, 2.45 mM NBT). Aktivita askorbát peroxidasy bude detekována jako achromatický proužek na tmavém pozadí.
3
Úloha A - Analýza izoenzymů APX a aktivity PAL
Měření aktivity enzymu phenylalanin amoniak-lyasy
Roztoky:
0,1M Borátový pufr (pH = 8.8) 12 mM L-Phenylalanine
Měření se bude provádět v triplikátu. Do tří 1.5 ml zkumavek napipetujeme jednotlivé složky reakční směsi:
0,1M Borátový pufr (8.8) 150 u.1 12 mM L-Phenylalanin 150 u.1
Jako blank použijeme následující reakční směs: 0,1M Borátový pufr (8.8) 150 u.1 12 mM D-Phenylalanin 150 u.1
Poté přidejte do každé zkumavky 125 u.1 enzymového extraktu a inkubujte 30 minut při 30°C. Následně reakci zastavíme přídavkem 150 u.1 0,1M TCA. Směs důkladně promíchejte na vortexu a do každé zkumavky přidejte 125 u.1 vody a směs centrifugujte 10 minut při 15 000 x g. Odsajte supernatant, přepipetujte ho do UV semi-mikro kyvety a změřte absorbanci při 290 nm oproti blanku (reakční směs s D-phenylalaninem).
VYHODNOCENÍ
Srovnejte změny aktivity askorbát peroxidasy po aplikaci jednotlivých látek v závislosti na čase. Výsledek zdůvodněte.
Spočítejte aktivitu phenylalanin amoniak-lyasy (PAL) v čase 24h po aplikaci neznámého vzorku v pmol/s na mg rostlinného pletiva.
Výsledky vyneste do grafu, kde budou srovnány změny aktivity PAL po aplikaci vašeho neznámého vzorku s kontrolou (voda). Výsledek zdůvodněte.
4