Úloha C - Klonování PCR produktu do plasmidu
Jméno a učo:
Datum:
ÚLOHA C
Klonování PCR produktu do plasmidu
TEORETICKÝ ÚVOD
Při klonování PCR produktů do plasmidu se využívá vlastnosti Taq polymerasy, a jiných non-proofreading polymeras, přidávat na konec nově syntetizovaného řetězce jednu bázi (adenin) navíc. Klonovací vektor je poté v lineárníformě, kdy na každém konci nese jednu bázi (thymin nebo uracil) navíc. Za optimálních podmínek poté dochází k hybridizaci a ligaci PCR fragmentu do vektoru (Obrázek 1). PCR fragment hybridizuje do tzv. MCS (multicloning site) místa, které poté umožňuje použití širokého spektra restriktáz pro jeho případné vyštěpeníz vektoru a re-klonování do jiného vektoru. MCS místo se nachází uvnitř genu lacZ kódujícího galaktosidasu, takže úspěšné včlenění PCR produktu do vektoru má za následek ztrátu aktivity, která tak může být využita pro selekci úspěšných transformantů pomocí barevného substrátu X-gal. Vektor rovněž nese rezistenci na jedno nebo dvě antibiotika (obvykle na ampicilin) a obsahuje T7 a SP6 promotor pro případnou produkci klonovaného PCR produktu.
Obr. 1: Schéma klonovacího vektoru pGEM-T Easy (Promega)
Před vlastním klonováním je většinou nutné PCR produkt přečistit pomocí agarózové elektroforézy, abychom se vyhnuli klonování případných vedlejších produktů PCR reakce
1
Úloha C - Klonování PCR produktu do plasmidu
(dimery primem, nespecifické produkty). Množství PCR produktu (ng) při ligaci se poté spočítá na základě vzorce:
Množství vektoru (ng) x délka PCR produktu (kb) inzert
-—---——- x molární poměr —--
délka vektoru (kb) vektor
Ligační reakce většinou poté probíhá při pokojové teplotě po dobu 15 - 60 minut nebo při 4 °C přes noc. Poté dochází ke vložení ligovaného vektoru do kompetentních buněk. V našem případě budou použity termo-kompetentní buňky E. Coli HB101.
Kompetentní buňky jsou skladovány při -70 °C a využívá se jejich schopnosti po rozmrazení a vystavení krátkému teplotnímu šoku přijmout DNA. Po teplotním šoku je k buňkám obvykle přidáno SOC médium a jsou 2 hodiny inkubovány při 37 °C. Poté jsou vyočkovány na misku s příslušným selekčním antibiotikem a následující den je pozorován počet úspěšných transformantů.
PCR produkt pMiniT2.0 vektor Ligační směs
20 min inkubovat při 4 °C
Teplotní šok (42 °C) SOC médium
Ko mpeTentnNĎunky
Kultivace na miskách, screening kolonií
Obrázek 2: Schéma transformace buněk E. Coli HB101
Protože může docházet i k ligaci vektoru bez vloženého PCR produktu, musíme být schopni nějakým způsobem odlišit kolonie bakterií obsahující vektor s vloženým inzertem od kolonií s prázdným vektorem. Typicky se využívá genu lacZ, kdy úspěšné včlenění PCR produktu do vektoru má za následek ztrátu jeho aktivity, která tak může být využita pro selekci úspěšných transformátů pomocí barevného substrátu X-gal. V případě ligace samotného vektoru dochází k růstu modrých kolonií (enzym galaktosidasa je aktivní) a v případě úspěšné ligace PCR produktu do vektoru k růstu bílých kolonií (enzym galaktosidasa je inaktivován vloženým PCR produktem).
2
Úloha C - Klonování PCR produktu do plasmidu
POSTUP PRACE
Amplifikace vybraného genu (PRI nebo PR2 nebo PR5 nebo EFla)
Připravte reakční směs dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
FW+REV Primer(5 uM) 2 ul
RedTaq Mix 2x kone 10 u.1
PCR voda_6_yJ
Templát (cDNA) 2 u.1
Reakční směs jemně promíchejte a krátce stočte a vložte do cycleru. Na cycleru nastavte následující program:
95°C 2:30 min 95°C 30 s "
60°C 20 s -45x
72°C 30 s -
72°C 5:00 min
Analýza PCR produktu a jeho přečištění pomocí Monarch® DNA Gel Extraction Kit (NEB)
1. Připravte 1.5% agarózový gel.
2. Na gel naneste 20 u.1 PCR produktu smíchaného s 3 u.1 DNA nanášecího pufru do jedné jamky a 2.5 u.1 délkového markeru (50 bp) do druhé jamky.
3. Spusťte elektroforézu: 150 V, 20 minut.
4. Po skončení elektroforézy vynulujte váhu na 1,5 ml zkumavku.
5. Dejte gel na transiluminátor a vyřežte PCR produkt (poznamenejte si jeho velikost).
6. Proužek přeneste do 1,5 ml zkumavky a zvažte.
7. Do zkumavky přidejte Gel Dissolving pufru v poměru 400 u.1 roztoku na 100 mg gelu.
8. Inkubujte směs 10 minut při 50°C, kdy průběžně zkumavku vortexujte, abyste urychlili rozpuštění gelu.
9. Poté přeneste celou směs na kolonku.
11. Stočte kolonku 1 min při 14 000 x g.
12. Vylijte protekly roztok a přidejte na kolonku 200 u.1 DNA Wash pufru.
13. Centrifugujte 1 min při 14 000 x g.
14. Zopakujte krok 12 a 13.
15. Vyhoďte zkumavku, kolonku přeneste do nové 1,5 ml zkumavky, na její střed napipetujte 12 u.1 DNA Elution pufru a inkubujte 1 min při pokojové teplotě.
18.     Centrifugujte 1 min při 14 000 x g, PCR produkt je přečištěn, změřte jeho koncentraci na NanoFotometru a Qubitu.
3
Úloha C - Klonování PCR produktu do plasmidu
Klonování PCR produktu do plasmidu pGEM-TEasy a jeho následná transformace do buněk E. coli HB101
1. Rozmrazte 2x Ligation Master Mix, pGEM-TEasy klonovací vektor a PCR vodu.
2. Připravte ligační směs:
pGEM-T Easy klonovací vektor PCR produkt Ligation buffer, 2x T4 DNA Ligasa PCR voda
lul
1-4 ul (vypočtěte na základě vzorce) 5 ul lul do 10 jíl
3. Jemně ligační směs promíchejte, krátce stočte a inkubujte 1 hodinu při pokojové teplotě.
4. Rozmrazte potřebný počet alikvotů kompetentních buněk HB101 na ledě a předehřejte SOC medium na pokojovou teplotu.
5. Do zkumavky s kompetentními buňkami přidejte 2 u.1 ligační směsi, opatrně promíchejte a inkubujte 20 minut na ledě.
6. Poté umístěte zkumavku do termostatu na 42 °C přesně na 30 s a poté ji vraťte na 2 minuty do ledu.
7. Přidejte 450 ul SOC media a inkubujte za třepání (1000 rpm) 1 hodinu.
8. Od tohoto bodu provádějte všechny činnosti v laminárním boxu a sterilně.
9. Poté si připravte nalitou LB misku s ampicilinem (100 ug/ml)
10. Napipetujte na připravenou misku 100 u.1 SOC media s kompetentními buňkami a důkladně medium rozetřete bakteriologickou hokejkou.
13. Nechte z misek odpařit zbytek rozetřeného média, misky zavřete a umístěte dnem vzhůru do termostatu na 37 °C.
14. Následující den popište výsledek.
Zaočkovaní kolonie pro izolaci plasmidu
Ze selekční misky vyberte jednu kolonii nesoucí plasmid s inzertem a pomocí malé špičky ji přeneste do 2 ml LB média s ampicilinem (100 ug/ml) a inkubujte na třepačce při 37°C 12-16 hodin.
Izolace plasmidu z kultury E. coli pomocí kitu Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega)
1. Přeneste 2.0 ml bakteriální kultury do 2.0 ml zkumavky a centrifugujte 30s při 14 000 x g.
2. Odstraňte veškerý supernatant, do zkumavky opět přeneste 2.0 ml bakteriální kultury a centrifugujte 30 s při 14 000 x g.
3. Odstraňte veškerý supernatant a přidejte 250 u.1 Cell Resuspension roztoku a resuspendujte pelet na vortexu.
4. Přidejte  250  ul  Cell  Lysis  roztoku  a  opatrně  promíchejte převracením. Nevortexujte!
4
Úloha C - Klonování PCR produktu do plasmidu
5. Přidejte 10 u.1 Alkaline Protease roztoku a převracením (4x) směs ve zkumavce pořádně promíchejte. Nevortexujte! Inkubujte 5 min. na stole.
6. Přidejte 350 u.1 Neutralizačního roztoku a převracením (4x) směs ve zkumavce pořádně promíchejte. Nevortexujte!
7. Centrifugujte 10 min při 14 000 x g.
8. Supernatant opatrně přeneste na kolonku umístěnou ve zkumavce.
9. Centrifugujte 1 min při 14 000 x g.
10. Odstraňte protekly roztok a na kolonku napipetujte 700 u.1 Promývacího roztoku.
11. Centrifugujte 1 min při 14 000 x g.
12. Odstraňte protekly roztok a na kolonku napipetujte 250 u.1 Promývacího roztoku.
13. Centrifugujte 2 min při 14 000 x g.
14. Odstraňte protekly roztok a na kolonku a znovu centrifugujte 1 min při 14 000 x g.
15. Přeneste kolonku do nové zkumavky, přidejte 50 u.1 Elučního pufru a nechte 1 min inkubovat na stole.
16. Centrifugujte 1 min při 14 000 x g.
17. Plasmidová DNA je připravena k použití, změřte její koncentraci a čistotu na NanoFotometru.
Měření koncentrace a čistoty izolované DNA pomocí Nano-fotometru
1. Na fotometru nastavte měření koncentrace dsDNA.
2. Na čočku měřící kyvety napipetujte 3 u.1 PCR vody a zakryjte vrškem s faktorem 10.
3. Zmáčkněte tlačítko pro měření Blanku (BLANK).
4. Čočku a vršek otřete tampónem a poté na čočku napipetujte 3 u.1 vzorku DNA.
5. Zakryjte čočku vrškem s faktorem 10 a zmáčkněte tlačítko pro měření vzorku (SAMPLE).
Vytisknete hodnoty čistoty A260/280, A230/260 a naměřené spektrum.
Příprava plasmidu o definované koncentraci
1. Na základě znalosti velikosti plasmidu s PCR produktem (přibližně 3200 bp) a střední molekulové hmotnosti 1 páru bazí DNA (650 g/mol) vypočítejte koncentraci plasmidové DNA při následujícím počtu kopií:
10 000 kopií/u.1 ....................
100 000 kopií/u.1 ....................
1 000 000 kopií/u.1 ....................
10 000 OOOkopií/ul ....................
2. Na základě vypočtených hodnot zřeďte plasmidovou DNA PCR vodou na požadovanou koncentraci v celkovém objemu 100 u.1.
5
Úloha C - Klonování PCR produktu do plasmidu
VYHODNOCENÍ
Uveďte celkový počet kolonií po transformaci.
Uveďte kvantitu a čistotu vyizolované plasmidové DNA.
Uveďte vypočítané hodnoty koncentrací plasmidové DNA pro jednotlivý počet
kopií/u.1.
6