LABORATOŘ MOLEKULÁRNÍ PATOLOGIE Jméno a UČO: Datum: ÚLOHA E Identifikace jednotlivých druhů Václavek ze vzorku půdy TEORETICKÝ ÚVOD V současné době je na světě rozlišováno přes 40 druhů václavek (rod Armillaria), které se vyskytují na všech kontinentech s výjimkou Antarktidy. Poprvé byl rod václavka identifikován v 18. století, ale až v roce 1973 objevení bifaktoriálního sexuálního inkompatibilitního systému umožnilo spolehlivě identifikovat jednotlivé druhy václavek. V Evropě bylo do současnosti identifikováno sedm druhů václavek, Armillaria borealis, cepistipes, ectypa, gallica, mellea, ostoyae a tabescens [2]. Václavky se vyskytují téměř na všech druzích porostů, mezi něž patří především listnaté a jehličnaté lesy, ovocné sady a parky. Výskyt jednotlivých druhů je omezen jednak klimatickými a geografickými podmínkami a na druhé straně výskytem vhodných hostitelů [2]. Václavky se v lese podílejí na rozkladu odumřelé dřevní hmoty, čímž v mnohém připomínají chování mykorhizních hub. V mnoha případech však přechází k nekrotrofnímu parazitizmu, resp. saproparazitizmu, na celé škále dřevin, především pak na smrku, borovici a dubu. Byly však pozorovány i na nahosemenných a krytosemenných rostlinách, na celé řadě bylin, na obilninách nebo na okrasných rostlinách. Každoročně pak způsobují obrovské škody na lesních porostech [1,2]. Některé druhy mohou být obligátními saprotrofy, avšak všechny druhy jsou schopné napadat stresem oslabené hostitele. Některé druhy dále produkují antibiotické látky, které jim pomáhají udržet kontrolu nad infikovaným hostitelem [2]. Jednotlivé druhy václavek se liší jednak svou patogenitou a také spektrem napadaných hostitelů. Proto je z hlediska lesního hospodářství velmi důležité odlišovat od sebe jednotlivé druhy. V současné době jsou k identifikaci jednotlivých druhů václavek nejvíce používané párové testy objevené Hinkitou v roce 1973, avšak v poslední době se k identifikaci začínají používat molekulárně-biologické metody, mezi něž především analýza restrikčních fragmentů ribozomální DNA. Reštrikční analýza Reštrikční endonukleasy jsou enzymy, které rozpoznávají ve dvoušroubovicové DNA specifickou sekvenci složenou obvykle ze 4 až 6 párů bazí a v tomto místě DNA specificky štěpí. Většina rozpoznávaných sekvencí restrikčními enzymy má dokonalou dvojčetnou rotační Pokročilé praktikum z Biochemie (102022) 1 Úloha E - Identifikace jednotlivých druhů Václavek ze vzorku půdy LABORATOŘ MOLEKULÁRNÍ PATOLOGIE symetrii. Tyto sekvence jsou známy jako tzv. palindromy. Celá řada restrikčních enzymů (např. Hinf\, Mbo\) katalyzuje štěpení dvou vláken DNA v polohách symetricky rozmístěných okolo středu palindromové sekvence. Vznikají tak fragmenty s kohezními či lepivými konci. U některých restrikčních enzymů (Alu I) naopak místo štěpení prochází přímo dvojčetnou osou palindromu. Vznikají pak fragmenty se zarovnanými či tupými konci [18]. Polymorfie délky restrikčních fragmentů (RFLP) poté poskytuje cenné informace o rozdílech mezi sekvencemi u jednotlivých druhů organizmů a je v současné době jednou z nejpoužívanějších metod v taxonomii a fylogenezi. Identifikace na základě ribozomální RNA Geny kódující ribozomální RNA jsou z hlediska taxonomického a fylogenetického velmi často používané. ITS oblast rDNA je velmi polymorfní, čímž se stává pro taxonomické a fylogenetické studie velmi výhodnou. Tato oblast leží mezi malou jadernou rDNA a velkou jadernou rDNA a je 5.8S rDNA rozdělena na oblasti ITS 1 a ITS 2 [3]. Pro amplifikaci této oblasti u hub byly navrženy primery ITS 1 a ITS 4 (obrázek 1). ITSl AR1 II lf H 18S rDNA ITSl 5.SS ITS2 23S rDNA li AR2 ITS4 Obrázek 1: Umístění ITS oblasti a primerů ITSl, ITS4, AR1 a AR2 na rDNA [3,4] Detekce václavek na základě RFLP analýzy ITS oblasti Pro specifikou detekci václavek poté byly navrženy primery AR1 a AR2 ležící na okrajích oblastí ITSl a ITS2 (obrázek 1). Tyto primery se používají pro specifickou amplifikaci všech sedmi evropkých druhů václavek. Pro dosažení velmi vysoké citlivosti metody pro identifikaci václavek se vzorků půdy se využívá tzv. nested PCR, při které dochází k amplifikaci požadované oblasti pomocí dvou párů primerů. První pár, tzv. externí, se většinou vyznačuje nižší specifitou a slouží k před-množení požadované oblasti. Druhý pár, tzv. interní, je poté vysoce specifický a používá se k namnožení požadované oblasti z již před-množeného vzorku. Při identifikaci václavek ze vzorků půdy lze využit jako externí pár primerů primery ITSl a ITS4 a jako interní pár primery AR1 a AR2 [4]. Pro určení konkrétního druhu václavky se poté využívá RFLP analýza oblasti namnožené pomocí primerů AR1 a AR2 využívající reštrikční endonukleázy Hinf\ a Alu\ [4]. Délky restrikčních fragmentů pro jednotlivé druhy václavek jsou uvedeny v tabulce níže. Pokročilé praktikum z Biochemie (102022) 2 Úloha E - Identifikace jednotlivých druhů Václavek ze vzorku půdy LABORATOŘ MOLEKULÁRNÍ PATOLOGIE Tabulka 1: Délky amplikonů a restrikčních fragmentů pro jednotlivé druhy václavek Izolát Délka amplikonů (bp) ITS/AR Reštrikční fragmenty Hinfl (bp) Reštrikční fragmenty Alu\ (bp) A. borealis Ala 868/711 293, 172, 56, 31, 75, 68 41, 97, 180, 222, 323 A. cepistipes 204b 868/711 293, 227, 43, 132 41, 97, 180, 222, 323 A. gallica 147b 868/711 294, 227, 43, 63, 69 41, 97, 180, 222, 323 A. mellea 184b 882/724 148, 159, 401 40, 47, 97, 149, 214, 325 A. ostoyae C23 870/713 294, 228, 31, 75, 69 41, 97, 180, 222, 323 A. tabescens T33 847/690 295, 125, 93, 32, 129 35, 70, 96, 138, 181, 327 Literatura 1. Jankovský L. 1997. Biologie Václavek, Dizertační práce MZLU, Brno. 2. Shaw C.G., Kile, G.A. 1991. ARillaria Root Disease, Agriculture Handbook 691, Department of Agriculture. Washington D.C., United States 3. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications: 315-322, Academic Press, Inc. 4. Lochman J, Sery O, Mikes V. 2004. The rapid identification of European Armillaria species from soil samples by nested PCR. FEMS Microbiol Lett. 1;237(1):105-10. POSTUP PRÁCE Izolace DNA z půdy pomocí kitu Quick-DNA™ Fecal/Soil Microbe Microprep Kit 1. Do ZR BashingBead™ zkumavky navažte přibližně 250 mg vzorku půdy. 2. Přidejte 750 u.1 BashingBead™ pufru a zkumavku dobře uzavřete. 3. Umístěte rozbíječi zkumavky vodorovně a vortexujte maximální rychlostí 10 miut. 4. Centrifugujte 1 minutu při 10 000 g. 5. Přeneste až 400 u.1 supernatantu do Zymo-Spin™ lll-F kolonky ve sběrné zkumavce. Poznámka: Směs může stále obsahovat určité množství půdních částic. 6. Centrifugujte 1 minutu při 8 000 g. 7. Ponechte si filtrát a zlikvidujte Zymo-Spin™ lll-F kolonku. 8. Přidejte 1 200 u.1 Genomického lyzačního pufru k filtrátu ve sběrné zkumavce z kroku 7. Dobře promíchejte. 9. Přeneste 800 u.1 směsi z kroku 8 do Zymo-Spin™ IC kolonky ve sběrné zkumavce. 10. Centrifugujte 1 minutu při 10 000 g. 11. Ponechte si kolonku a zlikvidujte protečený filtrát. 12. Opakujte kroky 9 a 10. 13. Vložte Zymo-Spin™ IC kolonku do nové sběrné zkumavky. Pokročilé praktikum z Biochemie (102022) 3 LABORATOŘ MOLEKULÁRNÍ PATOLOGIE 14. Přidejte 200 u.1 DNA Pre-Wash pufru na Zymo-Spin™ IC kolonku. 15. Centrifugujte 1 minutu při 10 000 g. 16. Přidejte 500 u.1 g-DNA Wash pufru na Zymo-Spin™ IC kolonku. 17. Centrifugujte 1 minutu při 10 000 g. 18. Přeneste Zymo-Spin™ IC kolonku do čisté l,5ml mikrozkumavky a přidejte 20 u.1 DNA Elučního pufru přímo do středu kolonky. 19. Centrifugujte 30 sekund při 10 000 g. 20. Umístěte Zymo-Spin™ 11-u.HRC kolonku do čisté sběrné zkumavky a přidejte 600 u.1 roztoku Prep Solution. 21. Centrifugujte 3 minuty při 8 000 g. 22. Přeneste Zymo-Spin™ 11-u.HRC kolonku do čisté l,5ml mikrozkumavky. 23. Přeneste eluovanou DNA z kroku 18 a 19 na připravenou Zymo-Spin™ 11-u.HRC kolonku a centrifugujte 3 minuty při 16 000 g. 24. DNA ve zkumavce je nyní připravena pro další použití. Měření čistoty izolované DNA pomocí přístroje Nano-fotometr 1. Na fotometru nastavte měření koncentrace dsDNA. 2. Na čočku měřící kyvety nepipetujte 2,5 u.1 PCR vody a zakryjte vrškem s faktorem 10 3. Zmáčkněte tlačítko pro měření Blanku (BLANK). 4. Čočku a vršek otřete tampónem a poté na čočku napipetujte 2,5 u.1 vzorku DNA. 5. Zakryjte čočku vrškem s faktorem 10 a zmáčkněte tlačítko pro měření vzorku (SAMPLE) 6. Vytisknete hodnoty čistoty A260/280, A230/260 a naměřené spektrum. Měření koncentrace izolované DNA pomocí přístroje Qubit 1. Smíchejte v 0,5 ml zkumavce 195 u.1 lx dsDNA HS Working Solution roztoku s 5 u.1 izolované DNA a změřte na přístroji Qubit 4.0 koncentraci DNA. Příprava 1. Reakční směsi nested-PCR Připravte reakční směs dle uvedené tabulky do PCR zkumavky: Primery ITS1+ITS4 (1 uM) 1,5 ul RedTaq Mix 2x konc 15 u.1 PCR voda_11,5 ul DNA 2 ul Pokročilé praktikum z Biochemie (102022) 4 Úloha E - Identifikace jednotlivých druhů Václavek ze vzorku půdy LABORATOŘ MOLEKULÁRNÍ PATOLOGIE Reakční směs jemně promíchejte a krátce stočte a vložte do cycleru. Na cycleru nastavte následující program: 95 °C 95 °C 55 °C 72 °C 2,5min 30 s 30 s 35x 20 s Příprava 2. Reakční směsi nested-PCR Připravte reakční směs dle uvedené tabulky do PCR zkumavky: Primer AR1+AR2 (5 uM) 4,0 u.1 RedTaq Mix 2x konc 25 u.1 PCR voda_16,0 u.1 1 PCR reakce 5,0 u.1 Reakční směs jemně promíchejte a krátce stočte a vložte do cycleru. Na cycleru nastavte následující program: 95 °C 2,5min 95 °C 30s 60 °C 30s 45x 72 °C 20s Reštrikční analýza PCR produktu Připravte reakční směs dle uvedené tabulky do PCR zkumavky: PCR reakční směs 20,5 u.1 10x Green Reakční pufr 2,5 u.1 Enzym Hinf\ 2,0 u.1 Reakční směs jemně promíchejte, krátce stočte a inkubujte lh při 37 °C. Analýza restrikčních fragmentů pomocí agarózové elektroforézy Připravte 2% agarozový gel - navažte 1,6 g agarozy, přidejte 80 ml lx LAB pufru a agarozu důkladně rozvařte v mikrovlně troubě. Poté zchlaďte agarozu na cca. 70 °C, přidejte 2 u.1 MidoriGreen, promíchejte a nalijte do připravené vaničky s hřebínkem. Nechte asi 15 minut tuhnout. Pokročilé praktikum z Biochemie (102022) 5 LABORATOŘ MOLEKULÁRNÍ PATOLOGIE Poté vložte nalitý gel do elektroforetické vaničky s lx LAB pufrem a vyndejte hřebínek. K restrikčním směsím a ke zbytku PCR reakce přidejte 2 u.1 Nanášecího pufru. Naneste vzorky na gel v následujícím pořadí: Délkový marker - PCR produkt - RA Hinfl Analýza restrikčních fragmentů pomocí Fragment Analyzeru Do destičky připravte směs 22 u.1 Diluent Markeru a 2 u.1 vzorku. Do poslední jamky každého řádku připravte směs 22 u.1 Diluent Markeru a 2 u.1 žebříčku. Do jamek beze vzorku či žebříčku přidejte 24 u.1 roztoku Blank Solution. A. Uveďte koncentraci a na základě naměřených dat zhodnoťte čistotu izolované DNA. B. Na základě délky amplifikátu a výsledku reštrikční analýzy určete, jaký druh václavky obsahoval váš vzorek půdy, a výsledek zdůvodněte. C. Porovnejte separaci DNA fragmentů pomocí agarozové elektroforézy a Fragment Analyzeru. D. Na základě sekvencí jednotlivých druhů václavek z NCBI databáze zkuste navrhnout dvojice specifických primerů a TaqMan sondu pro detekci Vámi identifikovaného druhu václavky. VYHODNOCENÍ Pokročilé praktikum z Biochemie (102022) 6