POKROČILÉ PRAKTIKUM Z BIOCHEMIE JMÉNO UČO Miroslava Velecká 499670 Jan Šimoník 473766 Úloha D: Identifikace neznámého elicitinu na základě jeho aktivity · Na základe Real-time PCR vypočítejte metodami absolutní nebo relativní kvantifikace za použití ΔΔCt metody, zdali dochází po přidání neznámého vzorku ve sledovaném časovém intervalu (24h) ke zvýšení transkriptů vybraných genů a o jak velké zvýšení se jedná: Náš vzorek je kontrolní, proto pro kvantifikaci jsme si vybrali vzorek B skupina gen ct skupina gen ct D PR1a 22,03 B PR1a 12,21 19,77 11,67 19,95 13,01 PR2 24,24 PR2 12,48 19,1 12,69 18,93 14,5 PR5 16,71 PR5 18,85 16,39 17,61 29,61 19,14 EF1a 19,82 EF1a 17,74 17,52 17,19 17,6 17,08 Tabulka 1: Data Tabulka 2: kalibrační křivky GEN Cp průměr SD PR1 23,44 23,225 0,215 23,01 26,94 26,725 0,215 26,51 30,85 30,795 0,055 30,74 33,69 33,655 0,035 33,62 PR2 23,16 23,085 0,075 23,01 26,66 26,585 0,075 26,51 31,06 32,20333 0,015 31,03 34,52 34,35 0,17 34,18 PR5 22,56 22,57 0,01 22,58 25,97 26,065 0,095 26,16 29,41 29,56 0,15 29,71 33,03 32,94 0,09 32,85 EF1a 23,56 23,565 0,005 23,57 27,06 27,065 0,005 27,07 31,06 31,045 0,015 31,03 34,95 35,14 0,19 35,33 RT-PCR: Relativní kvantifikace: skupina gen ct Průměr SD dCt SD ddCt SD R log2R SD PR1a-kontrola 22,03 19,86 0,09 1,546667 0,098489 0,098489 1 0 0,098489 D PR1a 19,77 PR1vsEF1a PR1a 19,95 PR1a 12,21 11,94 0,27 -5,39667 0,395292 -6,94333 0,284605 123,0698 6,943333 0,284605 B PR1a 11,67 PR1a 13,01 skupina gen ct Průměr SD dCt SD ddCt SD R log2R SD EF1a-kontrola 19,82 18,31333 0,04 -0,70167 0,093941 0,093941 1 0 0,093941 D EF1a 17,52 EF1avsPR2 EF1a 17,6 EF1a 17,74 17,33667 0,288714 4,751667 0,307214 5,453333 0,291471 0,022824 -5,45333 0,291471 B EF1a 17,19 EF1a 17,08 skupina gen ct Průměr SD dCt SD ddCt SD R log2R SD PR2-kontrola 24,24 19,015 0,085 2,465 0,181177 0,181177 1 0 0,181177 D PR2 19,1 PR2vsPR5 PR2 18,93 PR2 12,48 12,585 0,105 -6,41 0,179025 -8,875 0,135093 469,5061 8,875 0,135093 B PR2 12,69 PR2 14,5 skupina gen ct Průměr SD dCt SD ddCt SD R log2R SD PR5-kontrola 16,71 16,55 0,16 -3,31 0,183576 0,183576 1 0 0,183576 D PR5 16,39 PR5vsPR1 PR5 29,61 PR5 18,85 18,995 0,145 7,055 0,306472 10,365 0,215928 0,000758 -10,365 0,215928 B PR5 17,61 PR5 19,14 [JL1] Absolutní kvantifikace: skupina gen ct Kopie Průměr SD Poměr G/HG SD R SD log2R SD PR1a 22,03 228050,839 938566,1161 54943,2043 0,29099162 0,0245416 1 0,024542 0 0,010437 D PR1a 19,77 993509,32 PR1vsEF1a PR1a 19,95 883622,912 PR1a 12,21 136515196 165278639,2 28763443,64 47,70271474 14,24703882 163,9316 68,56889 7,35695 -61,0917 B PR1a 11,67 194042083 PR1a 13,01 skupina gen ct Kopie Průměr SD Poměr G/HG SD R SD log2R SD EF1a 19,82 840538,384 3225406,001 76738,09857 4,229251991 8,539088247 1 8,539088 0 -5,28524 D EF1a 17,52 3302144,1 EF1avsPR2 EF1a 17,6 3148667,9 EF1a 17,74 2897048,86 3735222,358 602972,8872 0,100648491 0,099102666 0,023798 -0,07015 -5,39301 B EF1a 17,19 4018429,22 EF1a 17,08 4290188,99 skupina gen ct Kopie Průměr SD Poměr G/HG SD R SD log2R SD PR2 24,24 52728,5739 762642,1901 504022,5075 0,135969133 0,116654416 1 0,116654 0 0,042528 D PR2 19,1 1062146,09 PR2vsPR5 PR2 18,93 1173051,91 PR2 12,48 50796419,5 37111558,39 15393560,27 33,69863644 19,05160763 247,8403 2483,25 7,953267 -2475,19 B PR2 12,69 44931528,1 PR2 14,5 15606727,6 skupina gen ct Kopie Průměr SD Poměr G/HG SD R SD log2R SD PR5 16,71 5014040,46 5608936,17 594895,7102 5,976069319 1,044834958 1 1,044835 0 -0,01285 D PR5 16,39 6203831,88 PR5vsPR1 PR5 29,61 938,432051 PR5 18,85 1207202,4 1101277,746 105924,652 0,006663158 0,002179831 0,001115 0,000678 -9,80877 -8,24627 B PR5 17,61 2754925,19 PR5 19,14 995353,094 · Z poškozených fotek vypočítejte dle vztahu z kapitoly „Vyhodnocení nekrózy“ míru nekrózy po přímé infiltraci a taktéž po infiltraci skrze petiolu: Náš vzorek byl D a měli jsme list nasátý skrze petiolu. Není zde náznak nekrózy (stejně to měly i skupiny, které měly přímou infiltraci vzorkem D). · Na základě výsledků z RT-PCR a nekrotického působení určete, jaký efektor byl ve vašem neznámém vzorku. Pro vyhodnocení použijte tabulku: V našem neznámém vzorku byla voda. Výsledky: Náš neznámý vzorek (D) indukoval…krát zvýšenou/sníženou/nezměněnou expresi PR5 …krát zvýšenou/sníženou/nezměněnou expresi PR-1 Náš neznámý vzorek (D) způsoboval 0% nekrózu na listu tabáku po přímé infiltraci 0% nekrózu na listu tabáku po nasátí petiolou Dle výsledků výše byl v našem neznámém vzorku: voda Odůvodněte: Náš vzorek nevykazoval známky nekrózy po nasátí petiolou ani po přímé infiltraci. Po PCR nevykazoval žádné zvýšení ani snížení exprese u všech genů. Vzorek B který jsme si vybrali pro kvantifikaci vykazoval 10,4x sníženou expresi PR5, 5,5x sníženou expresi EF1a, 6,9x zvýšenou expresi PR1 a 8,9x zvýšenou expresi PR2. Jak vypadal list nevíme.[JL2] ________________________________ [JL1]Grafy nemají vyznačené osy a měly by mít stejné měřítko na ose y + graf pro EF1a nedává smysl, je to house-keeping gen, viz. poznámka níže. [JL2]Gen EF1a je housekeeping, nemůže být tedy logicky kvantifikován, nutno přepočíst data z qPCR, je zde někde chyba!