POKROČILÉ PRAKTIKUM Z BIOCHEMIE JMÉNO UČO Miroslava Velecká 499670 Jan Šimoník 473766 Úloha E: Identifikace jednotlivých druhů Václavek ze vzorku půdy Náš vzorek: I · Uveďte koncentraci a na základě naměřených dat zhodnoťte čistotu izolované DNA: Nano-fotometr: c= 6,0 ng/μl A260/280 = 2 DNA je nejspíš znečištěna RNA nebo organickými látkami[JL1] Qubit: c= 1,5 ng/μl Ředení vzorku 2 μl + 4 μl voda · Na základě délky amplifikátu a výsledku restrikční analýzy určete, jaký druh václavky obsahoval váš vzorek půdy, výsledek zdůvodněte: Jedná se nejspíše o A. ostoyae C2a, jelikož je na gelu vidět bandy pod 300 bp pak pod 250 bp, pod 150 pod 100 a pod 50 bp.[JL2] · Porovnejte separaci DNA fragmentů pomocí agarozové elektroforézy a Fragment Analyzeru: · Na základě sekvencí jednotlivých druhů václavek z NCBI databáze zkuste navrhnout dvojice specifických primerů a TaqMan sondu pro detekci Vámi identifikovaného druhu václavky: o Gene bank: MW717692.1 o OLIGO start len tm gc% any 3' seq o LEFT PRIMER 59 20 59.87 55.00 5.00 2.00 aactctggtggaggctcgta o RIGHT PRIMER 163 20 60.92 55.00 4.00 3.00 tcggcaggaaccagctacta o HYB OLIGO 83 22 65.09 45.45 6.00 4.00 ttctgacgtgcaaatcgatcgt o 481 gctcctctga aatgcattag cagaaaccgc tatgcctgaa tagggtgaag ccagaggaaa o 541 ctctggtgga ggctcgtagc gattctgacg tgcaaatcga tcgtcgaatt tgggtatagg o 601 ggcgaaagac taatcgaacc atctagtagc tggttcctgc cgaagtttca Primery vykazují v Primer Blast také vysokou nespecifitu, nutno obojí znovu navrhout! Sonda detekuje: Obsah obrázku text Popis byl vytvořen automaticky ________________________________ [JL1]Z tohoto koeficientu lze hodnotit pouze znečištění proteiny, ale obecně při takto nízké koncentraci bývá hodnota často zavádějící. [JL2]Jednalo se o A. cepistipes (293, 227, 132, 43 bp), bohužel se Vám asi vzorek úplně nedoštěpilm proto ten jeden proužek navíc.