Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií C7250 Část III Zbyněk Zdráhal Výzkumná skupina Proteomika, CEITEC-MU Centrální laboratoř-Proteomika, CEITEC-MU Funkční genomika a proteomika, NCBR PřF zdrahal@sci.muni.cz Oddělení funkční genomiky a proteomiky Národní centrum pro výzkum biomolekul Přírodovědecká fakulta MU mu1 GIGO Pečlivá příprava vzorku – základní kámen úspěchu zachování původního proteinového složení zachování modifikací (např. inhibitory fosfatáz) odstranění kontaminant rušících koncovou MS analýzu ... C7250 Analýza proteomu * proteinů je podstatně víc než genů lidský genom obsahuje ~21 000 genů, ale lidský proteom může obsahovat ~ 1 000 000 proteinů a jejich forem (izoformy, PTMs) (http://www.expasy.org/sprot/hpi/hpi_desc.html) ~ 10 000 proteinů v buňce v každém okamžiku * široký rozsah koncentrací proteinů (~ 10 řádů) nutnost účinné separace majoritních proteinů od minoritních, chybí obdoba PCR reakce používané pro amplifikaci DNA * široké spektrum fyzikálně-chemických vlastností * analýza komplexů pro úplné pochopení buněčných procesů mnohdy nestačí prostá identifikace jednotlivých proteinů, cca 80% je funkčních jako součást komplexů MM900282753[1] C7250 proteoforms image C7250 Frakcionace/separace cíl – zjednodušení extrémně komplexní směsi oddělit specifickou skupinu proteinů/peptidů (např. fosfopeptidy) nutnost kombinovat různé techniky – vícerozměrná separace volba vhodné kombinace pro daný experiment (dalším rozměrem separace může být i zvolená MS koncovka) Základní důvod pro zjednodušení směsi – získání kompletnější informace ~ 105 peptidů Přímá LC-MS/MS analýza 1000 peptidů ~ 100 peptidů Skenovací rychlost Časová limitace ~ 900 peptidů nezměřeno C7250 Metody frakcionace/separace elektroforetické techniky: * isoelektrická fokusace (v gelu, v roztoku) * SDS PAGE * 2D gelová elektroforéza (DIGE) * kapilární elektroforéza chromatografické techniky: * kapalinová chromatografie - reverzní fáze - iontoměnič - molekulové síto - afinitní (IMAC, MOAC, protilátka) - HILIC (hydrophilic interaction chromatography) * off-line * on-line imunoprecipitace Standardní 1-D postupy 1-D GE Specifické proteolytické štěpení Separace proteinů MS/MS Separace naštěpených peptidů Specifické proteolytické štěpení MALDI-MS/MS LC-MS/MS (JEDNODUCHÉ) SMĚSI 1-D LC-MS/MS shotgun proteomics C7250 Separace proteinů MS MS/MS MS s vysokým rozlišením Proteinový extrakt fága – 1-D separace Iden. – 5 majoritních proteinů LC/MSMS kDa 66.2 45.0 31.0 21.5 14.4 97.4 GE cca 50 bandu LOGO koncentrační rozsah snížená možnost detekce minoritních komponent rozhoduje instrumentace podmínky LC separace C7250 popandai 2-D GE 2-D LC-MS/MS Specifické proteolytické štěpení Separace proteinů MS/MS Separace naštěpených peptidů Specifické proteolytické štěpení Klasické 2-D postupy 2-D LC-MS/MS MALDI-MS MALDI-MS/MS on-line/off-line LC-MALDI C7250 fag 812-Ag 2006-08-18 2-D GE/MALDI-MS Proteinový extrakt fága – 2-D separace ≈ 700 skvrn ≈ 20 proteinů LOGO C7250 Protein mix digesce 2D - RP MS/MS 1D - SCX On-line (“MudPIT”) frakcionace step by step 2D - RP MS/MS Peptide fraction 1D - SCX Off-line UV Peptide fraction Peptide fraction Peptide fraction Peptide fraction Peptide fraction Peptide fraction Peptide fraction LC 2-D LC peptides MudPIT (multidimensional protein identification technology) C7250 2-D LC peptides C7250 ionex / RP 2-D LC (peptides) 1D-RP 2D-RP, frakce 5 mM 2D-RP, frakce 50 mM 2D-RP, frakce 100 mM Dionex application note C7250 2-D LC (peptides) RP-RP stejná stacionární fáze – jiné pH www.ace-hplc.com Ortogonalita separace C7250 Characterization of proteome and phosphoproteome of HEK293 cells lysis SDT buffer [SDS+DTT+Tris] HEK293 SPL – „scheduled precursor list“ analysis enables repeated analysis of sample with exclusion of already identified peptides in previous analysis 16 TiO2 enrichment analysis of phosphofractions LC-MS/MS (pH 3) (Orbitrap Elite) Data processing Data processing direct analysis w/o and with SPL LC-MS/MS (pH 3) (Orbitrap Elite) reversed phase pH 10 1D LC separation Data processing analysis of fractions LC-MS/MS (pH 3) (Orbitrap Elite) FASP TMT labeling cooperation with Assoc. Prof. Bryja group, FS MU C7250 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 LC-separation of the digested sample in 1D (high pH) 17 reversed phase pH 10 1D LC separation C7250 18 17931 20395 86212 95781 Number of identified peptides C7250 Number of identified proteins 9013 3398 3098 5474 5140 1317 1126 8560 Fractionation •three fold increase in number of identified proteins •higher sequence coverage for most proteins C7250 Průměr HPLC kolony vs citlivost „Sensitivity increases with a decrease in column diameter because the same sample mass (amount) is eluted in a smaller volume. Therefore the concentration of the eluting peak is higher and the detection signal is stronger.“ Amer. Lab., 2001, 33 (10), 26-38. C7250 C7250 Kapilární a nano kolony * Zvýšení citlivosti * Limitní množství vzorku * Snížení spotřeby rozpouštědel www.ace-hplc.com sorbenty 1-D: reverzní fáze (high pH) ionex HILIC IMAC (fosfoproteiny) affinity (lectin – glyko) 2-D LC peptides On-line vs Off-line automatizace flexibilita optimalizace kontinuální odběr frakcí C7250 2-D: reverzní fáze LC –MALDI (peptides) Peptide fraction nano LC (RP) ESI-MS/MS on-line MALDI TOF/TOF MS off-line Depozice na MALDI target Archivace C7250 Avesome_Spectecle LC separace komplexních proteinových směsí Protein mix Protein 1D frakce Frakcionace I. Ionex, SEC, …. Frakcionace II. Protein 1D frakce Protein 2D frakce RP exp. exp. Protein 2D frakce digesce 1D (2D) HPLC ESI-MS/MS C7250 LC separace komplexních proteinových směsí C7250 Kombinace GE a HPLC separace slices protein fractionation digesce nano 1-D LC 1-D GE ESI-MSMS nebo IPG strip C7250 from Carter et. al. The Plant Cell, 2004, 16, 3285–3303. 2D-On-line 2D-Off-line (3D ?) C7250 from Carter et. al. The Plant Cell, 2004, 16, 3285–3303. C7250 Depletovaná plazma (3500 – 9000 proteinů ??) IEF (liq) 20 frakcí 1. rozměr LC (RP) 1600 frakcí 2. rozměr GE (1D/2D) ∞ frakcí 3/4. rozměr from H. Wang, Molecular & Cellular Proteomics, 2005, 4, 618–625. 0. rozměr Celková analýza proteomu (screening) C7250 C7250 A draft map of the human proteome Min-Sik Kim et al., Nature 509, 575-581 (2014) doi:10.1038/nature13302 293 000 non redundant peptides corresponding to proteins encoded by 17294 genes from A.D. Zoumaro-Djayoon et al. / Methods 56 (2012) 268–274 Cílená analýza imunoafinitní frakcionace (Y(phos)) C7250 from K. Bluemlein et al. / Nature protocols 6 (2011) 859 –869 Cílená analýza jednotlivých proteinů Parent mass Fragment mass CID Q1 Q3 Q2 Q1 „fix“ Q3 „fix“ * kvadrupol Q1 i Q3 jsou nastaveny na vybrané hodnoty m/z (prekurzoru a vybraného fragmentu), zaznamenány jsou jen prekurzory, z kterých při fragmentaci v kolizní cele Q2 vzniká určený fragment * během analýzy lze sledovat více reakcí (MRM) C7250 BLESSED High throughput Parallel operation C7250 High throughput Reduction of chromatographic run Zobrazit zdrojový obrázek C7250 from Evosep technical note High throughput Reduction of chromatographic run Method details Number of identified peptides and proteins per method Evosep One + Exploris 480 C7250 from Evosep technical note + Miniaturizace - chip technologie C7250 Konec III. části