Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií C7250 Část IV Zbyněk Zdráhal Výzkumná skupina Proteomika, CEITEC-MU Centrální laboratoř-Proteomika, CEITEC-MU Funkční genomika a proteomika, NCBR PřF zdrahal@sci.muni.cz Oddělení funkční genomiky a proteomiky Národní centrum pro výzkum biomolekul Přírodovědecká fakulta MU mu1 nfsnf Charakterizace Modifikací Proteinů MP900448552[1] ...Post-translational modifications (PTMs) occur on nearly all proteins. Many domains within proteins are modified on multiple amino acid sidechains by diverse enzymes to create a myriad of possible protein species. How these combinations of PTMs lead to distinct biological outcomes is only beginning to be understood... A. P. Lothrop, M. P. Torres, S. M. Fuchs, FEBS Letters. 587 (2013) 1247–1257 počet druhů PTMs > 400 počet PTMs ≈ 90 000 (experimentálne identifikovaných) ≈ 230 000 (predikce) (SwissProt, per ≈ 530 000 proteinů) G. A. Khoury et al., Sci. Rep. 1, 90; (2011); http://selene.princeton.edu/PTMCuration ...PTMs are known to act alone and in combination to regulate nearly all aspects of protein function... C7250 Proč? Mutations of p53 or disruptions of p53 coordination, to a lesser extent, can disturb the normal physiological balance, if genome disarrangement reaches a critical value it leads to cancer Protein p53 https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR1oGSRO3Nz6VVvIpqSbASgHtJqSW61KU3uFVk3KY87IW6 4x64_ p53 tetramer bound to DNA p53 exerts irreplaceable anti-neoplastic functions at homeostasis and thus is considered to be 'the guardian of the genome‘. B. Gu et al, Int. J. Biol. Sci. 2012, 8, 672-684. p53 is able to coordinate a regulatory network that supervises and responds to a variety of stress signals: ØDNA damage Øaberrant oncogenic activation Øtelomere erosion Øribosomal stress Øloss of cell-cell or cell-matrix adhesion Øhypoxia International Journal of Biological Sciences 08: 0672 image No. 01 Overview of p53 PTMs B. Gu et al, Int. J. Biol. Sci. 2012, 8, 672-684. Histone H3 most frequent PTMs C7250 * Druh * Lokalizace místa * Obsazenost daného místa náročnost MS “screening” (paralelní charakterizace tisíců PTM míst včetně dosud neznámých) detailní charakterizace jednotlivých modifikací Western blot detekce druhu PTM lokalizace jednotlivé modifikace Specifické barvení gelů detekce druhu PTM bez možnosti lokalizace (fosfo, glyko proteiny) Možnosti MS při analýze modifikací Druhy modifikací: Ø mutace (záměna AMK) Ø Ø chemické Ø posttranslační Užitečný přehled modifikací: DeltaMass - https://www.abrf.org/delta-mass C7250 „Chemické“ modifikace: q záměrné modifikace (karbamidometylace Cys, derivatizace, kvantifikační značky aj.) q nechtěné modifikace (oxidace Met, deamidace N à D při zpracování vzorku, adukty farmak) j0195384 MCj02871590000[1] C7250 Zobrazit zdrojový obrázek Common Posttranslational Modifications C7250 Amines (K/N-terminus) Methylation +14.0269 Formylation +28.0104 Acetylation +42.0373 Lipoic acid +188.3147 Farnesylation +204.3556 Myristoylation +210.3598 Biotinylation +226.2994 Palmitoylation +238.4136 Stearoylation +266.4674 Geranylgeranylation +272.4741 Acids & amides (E/D/Q/N) Pyroglutamic acid (Q) -17.0306 Deamidation (Q/N) +0.9847 Carboxylation (E/D) +44.0098 Hydroxyl groups (S/T/Y) Phosphorylation +79.9799 Sulphation +80.0642 Carbohydrates (S/T/N) Pentoses +132.1161 Deoxyhexoses +146.1430 Hexosamines +161.1577 Hexoses +162.1424 N-acetylhexosamines +203.1950 Sialic acid +291.2579 Common Posttranslational Modifications Další detaily např: http://themedicalbiochemistrypage.org/protein-modifications.php C7250 MS/MS fragmentace peptidů opakování MC900431582[1] N-terminus C-terminus + + + + b1 b2 b3 b4 b- ion serie + + + + y1 y2 y3 y4 y- ion serie C7250 N-terminus (c-serie) C-terminus (z- serie) CID vs ETD CID ETD b, y c, z C7250 MS Charakterizace mutací Blue tissue paper wild type 179 - 203 NWLTFNEPQTFTSFSYGTGVFAPGR 2824 E186Q Q 2823 peptide mass difference: - 1 Da 2800 2810 2820 2830 m/z 300 400 500 600 700 800 900 1000 a.i. 2799.73 2824. 65 Zm-p60.1 wild type 2799.85 2823. 82 Zm-p60.1 E186Q Potvrzení výměny AMK na peptidové úrovni Protein: Zm-p60 (pozice 186) In-gel digesce MALDI-TOF MS 1 Da C7250 LC-MS/MS nalezena mutace D/E v pozici 210 ... DEEELQKENVKNTASLTGKITLSVTQSKPETGEVIGVFESIQPSDTDLGAKVPKDVKIQG ... Identifikace výměny AMK na aminokyselinové úrovni Protein ve dvou variantách v jednom spotu na 2-D gelu Vstupní informace: Změna hmotnosti tryptického peptidu: –14 Da ... DEEELQKENVKNTASLTGKITLSVTQSKPETGEVIGVFESIQPSDTDLGAKVPKDVKIQG ... MALDI-MS potvrzení změny hmotnosti daného peptidu (2 proteázy) MALDI-PSD nejednoznačné výsledky C7250 933.5 951.7 970.6 +MS2(1004.0), 32.1min (#878) 0 100 200 300 920 930 940 950 960 970 m/z 927.2 945.0 956.4 +MS2(997.4), 32.6min (#887) 0 100 200 300 Ion b9 LSVTQSKPX D / E m/z MS/MS peptidu LSVTQSKPXTGEVIGVFES, MW 2006.0 (1992.0) D E 1+ 1+ -14 „Nemodif“ – detail MS/MS spektra „Modif“ - detail MS/MS spektra m/z 956 m/z 970 „Modif“ MS2 (997.4, 2+) „Nemodif“ MS2 (1004.4, 2+) Rt (min) EIC chromatogram EIC chromatogram m/z C7250 LC-MSMS methylace, potvrzení D v pozici 210 po derivatizaci výměna H za CH3 na karboxy skupině tj. D = 14 Da/skupinu VTQSKPX*TGE*VIG* y8 y8 nederiv m/z 787.2 pro D y8 methyl m/z 829.3 pro D D = 42 Da C7250 m/z 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840 850 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 [Abs. Int.] y8 787.7 y8 829.3 42 Da MS/MS peptidu VTQSKPXTGEVIG před a po methylaci C7250 MS Charakterizace modifikací „chemické“ C7250 nemodifikovaný peptid 2060 Peptid + X 2222 MALDI–MS spektrum digestů před a po modifikaci (výřez spektra) 162 Da C7250 1256 1261 1266 1271 1276 m/z 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 a.i. MALDI–MS spektrum – Oxidace Met (výřez spektra) 16 Da Sample prep artefact (Sypro Ruby) C7250 1. gi|15803837 Mass: 13532 Score: 487 Queries matched: 5 50S ribosomal protein L14 [Escherichia coli O157:H7] Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Score Peptide ……. 939.45 1876.89 1876.88 0.02 0 (125) MIQEQTMLNVADNSGAR 947.44 1892.87 1892.87 -0.01 0 159 MIQEQTMLNVADNSGAR + Oxidation (M) 947.45 1892.88 1892.87 0.01 0 (147) MIQEQTMLNVADNSGAR + Oxidation (M) 955.45 1908.89 1908.87 0.03 0 (118) MIQEQTMLNVADNSGAR + 2 Oxidation (M) ……. Výsledek identifikace proteinu (Mascot) Jen část týkající se modifikovaného peptidu (Petra P. Vz. 3, 080821) D m/z 8 (16) ……. 16 (32) C7250 EIC: m/z 939.5 (2+) m/z 947.4 (2+) m/z 955.4 (2+) LC-MS/MS 1x Ox 1x Ox 2x Ox C7250 ? MS/MS spektrum nemodifikovaného peptidu - MIQEQTMLNVADNSGAR C7250 MIQEQTMLNVADNSGAR Posuny v m/z vybraných fragmentů pro jednotlivé případy M(ox) y10 y10 – LNVADNSGAR b9 – M1IQEQTM7LN b9 y11 y11 – M7LNVADNSGAR bez 1 Ox 1 Ox 2 Ox M1 M7 oba y10 0 0 0 0 y11 0 0 16 16 b9 0 16 16 32 C7250 M7 - ox nemodifikovaný M1 - ox M1, M7- ox y10 – LNVADNSGAR y11 – M7LNVADNSGAR y10 1016,5 y10 1016,5 y10 1016,5 y10 1016,5 y11 1147,6 y11 1163,6 y11 1163,6 y11 1147,6 b9 1089,5 b9 1105,5 b9 1105,5 b9 1121,5 b9 – M1IQEQTM7LN + posun celé b serie (b3 - M1IQ) +16 +16 +32 +16 +16 0 C7250 LC-MSMS spectrum (výřez spektra) Potrzení modifikace na Cys 200.3 246.1 268.1 285.4 300.0 315.3 349.3 383.3 410.1 428.2 448.2 478.5 522.2 0 1000 2000 3000 Intens. 200 250 300 350 400 450 500 m/z y2 y3 y4 C …VC*AR 200.4 246.4 285.5 314.9 384.0 410.5 441.4 455.9 468.1 493.3 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 4 x10 Intens. 200 250 300 350 400 450 500 m/z y3* y2 C + modifikace modifikace C7250 5340 Ac Ac ? 5340 5382 Fragment with one E Ac Fragment with two E Ac Non-acetylated fragment Histon H3, lokalizace acetylace (in-vitro) MALDI-MS digestu (detail spektra) 0 250 500 750 1000 1250 1500 5250 5300 5350 5400 5450 5500 5550 5600 5650 5700 5750 m/z C7250 T G G K* 1246.4 c 11 1303.4 c 12 1360.4 c 13 1530.4 c 14 42 Da Histon H3, lokalizace acetylace K(14) MALDI-ISD MS (detail spektra) ARTKQTARKSTGGKAPR c14 c13 C7250 MS Charakterizace modifikací posttranslační Fosforylace Phosphorylation sites db: http://www.phosphosite.org/homeAction.do http://phospho.elm.eu.org Whereas phosphorylation of serine, threonine or tyrosine results in the formation of a phosphoester linkage, phosphorylation of histidine residues occurs on nitrogen atoms, producing a phosphoramidate bond. Phosphohistidines have a large standard free energy of hydrolysis making them the most unstable of any known phosphoamino acid. Klumpp et al, Eur. J. Biochem. 269, 1067-1071 (2002) Protein Phosphorylation is of Fundamental Importance in Biological Regulation cca 10-30% of all proteins are phosphorylated * S, T, Y 1800 : 200 : 1 ??? * H ??? C7250 Phospho.ELM version 9.0 (September 2010) contains 8,718 substrate proteins from different species covering 3,370 tyrosine, 31,754 serine and 7,449 threonine instances. ANd9GcS7DgpmMhdFVpn6PlY8T92DyDkPS8RmVbgExRVf7Hx161sytJTUMw 9 aminokyselin, které mohou být fosforylovány serin (Ser) > threonin (Thr) > tyrosin (Tyr) histidin (His) kys. asparagová (Asp), kys. glutamová (Glu) lysin (Lys), arginin (Arg), cystein (Cys) ANd9GcSGPXPo1GVda5zic7cVH_KH58S54DXtkkd61xmwD7JEB4QKn5XzAw Fosforylace C7250 Fosfoproteom - Potížista * potlačení signálu v MS - pouze malá část z celkového množství proteinů je fosforylovaná (přednostní ionizace nemodifikovaných peptidů) * většina signálních proteinů je v buňce v nízkých koncentracích * protein se může vyskytovat v různých fosfo formách * proteiny mohou být během zpracování defosforylovány fosfatázami přítomnými ve vzorku C7250 Úprava vzorku * inhibitory fosfatáz (co nejdříve), FASP (lyze v SDT) * frakcionace fosfopeptidů (proteinů) - TiO2 (resp.jiné oxidy kovů, MOAC – „metal oxide affinity chromatography“) - IMAC („immobilized metal affinity chromatography“) - SCX resp. SAX or HILIC („ion exchange or hydrophilic interaction chromatography“) - imunoprecipitace pomocí specifické protilátky (zejména Y(fosfo) I.L. Batalha, Trends in Biotechnology 30 (2), 100-110 (2012) MS analýza jiné typy fragmentací CID ETD (ECD) electron transfer (capture) dissociation HCD higher-energy collision dissociation EThcD electron-transfer/higher-energy collision dissociation Frese at al., J. Proteome Res., 12, 1520−1525 (2013) C7250 phosphoproteins (Pro-Q Diamond , blue) proteins (SYPRO Ruby, red). (https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P33300) Specifické barvení fosforylovaných proteinů, 2D GE alternativa Metabolické značení 32P měření radioaktivity immunoblotting phosphatase treatment phosphoproteins display a basic shift in their pI after the dephosphorylation. comparison 2D gels C7250 Visualization of total protein and phosphoproteins in a 2D gel. http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/Documents/spectra/images/33300.jpg Mobility Shift Detection of Phosphorylated Proteins SDS-PAGE using an Phos-tagTM complex with two manganese(II) ions Mn2+–Phos-tagTMTM c(Mn2+) mM E. Kinoshita et al., Molecular & Cellular Proteomics, 5, 749-757 (2006) C7250 specific binding eluce Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) charging (Cu2+, Fe3+, Ga3+) C7250 IMAC enrichment of -Casein phosphopeptides (1 pmol of tryptic digest) Ziptip MC Technical note - Millipore C7250 normal peptidy kaseinu fosfopeptidy kaseinu Maldi-MS Bez separace LOGO Kasein (1 mg) po digesci trypsinem C7250 Maldi-MS IMAC (Poros), Fe3+ Kasein (1 mg) po digesci trypsinem LOGO peptidy kaseinu fosfopeptidy kaseinu C7250 Maldi-MS TiO2 frakcionace Kasein (1 mg) po digesci trypsinem LOGO peptidy kaseinu fosfopeptidy kaseinu C7250 1070 1120 1170 m/z 500 1000 1500 2000 2500 a.i. 80 Da MALDI–MS spektrum peptidu bez a s fosforylací HRTSS*VPEY LOGO C7250 1 x Phos 2 x Phos Digest kaseinu TiO2 MALDI-MS Potvrzení fosforylace pomocí alkalické fosfatázy C7250 ESI–MS (IT) spektrum peptidu bez a s fosforylací positive mode 165.0 226.8 285.1 334.7 380.1 408.2 447.7 495.0 538.3 569.3 640.4 668.3 873.5 916.9 1076.4 200 400 600 800 1000 1200 m/z 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 7 x10 Intens. m/z 538.3, 2+ m/z 578.3, 2+ 40 Da LOGO C7250 Fosforylace histonu H4 kinázou Aurora B (K. Šedová) • fosforylace • proteolytické štěpení trypsinem • frakcionace fosfopeptidů na TiO2 • LC-MS/MS analýza – sken neutrální ztráty (ETD) Schéma MS analýzy výběr prekurzorů dle intenzity MS/MS CID MS fragmentace vybraných prekurzorů std. fragmentační technikou výběr nových prekursorů detekce neutrální ztráty v CID MS/MS spektrech odpovídající ztrátě H3PO4 (49, 32.6) ne detekce neutrální ztráty fragmentace prekurzoru vykazujícího ztrátu H3PO4 šetrnější fragmentační technikou MS/MS ETD ano C7250 5 10 15 20 25 30 35 Time [min] 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 6 x10 Intens. 1 5 10 15 20 25 30 35 Time [min] 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 7 x10 Intens. LC-MS chromatogram MS chromatogram vybraného iontu o m/z 559.0 TIC EIC 2. +MS, 21.9-22.1min #915-#923 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 5 x10 Intens. 557.0 557.5 558.0 558.5 559.0 559.5 560.0 560.5 561.0 561.5 m/z m/z 559.0 559.3 559.6 560.0 3+ 0.3 C7250 m/z 559.0 MS/MS spektrum, CID fragment 526.3, 3+ detekována neutrální ztráta 32.7 podezření na fosfopeptid m/z 559.0 MS/MS spektrum, ETD C7250 Biotools Score Score (Biotools) (Mascot) CID RKTVTAMDVVYALK 520 23 RKTVTAMDVVYALK 518 22 ETD RKTVTAMDVVYALK 6149 75 RKTVTAMDVVYALK 774 47 m/z Charge RT (min) Expect Mr 559.0 3+ 22.063 1674.0 Identifikace peptidu databázovým prohledáváním MS/MS Ion Search (MASCOT) MASCOT •gi|223582 Mass: 11230 Score: 74 Queries matched: 2 histone H4 Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Score Expect Rank Peptide 558.98 1673.93 1673.86 0.076 2 (23) 7.8 1 K.RKTVTAMDVVYALK.R + Phospho (ST) CID 558.98 1673.93 1673.86 0.076 2 75 5e-05 1 K.RKTVTAMDVVYALK.R + Phospho (ST) ETD Modifications: Optional: Phospho (ST) Search Parameter: Charge=2+ and 3+, MS Tol.:0.500000 Da, MSMS Tol.:0.500000 Da, Trypsin Mascot 2.2.03, NCBInr NCBInr_20081101.fasta C7250 m/z 559.0 MS/MS spektrum, CID RKTVTAMDVVYALK na základě CID MS/MS dat nelze fosfoskupinu lokalizovat C7250 RKTVTAMDVVYALK m/z 559.0 MS/MS spektrum, ETD na základě ETD MS/MS dat lze jednoznačně lokalizovat fosfoskupinu na T(3) C7250 T(3) x T(5) T3 + phospho (101 + 80) T5 (101) T3 (101) T5 + phospho (101 + 80) 403.3 c3 502.3 c4 C7250 Li et al., Front. Plant Sci., 6, 430 (2015) a46 Ubikvitinace Ubiquitination is an enzymatic, protein post-translational modification (PTM) process in which the carboxylic acid of the terminal glycine from the di-glycine motif in the activated ubiquitin forms an amide bond to the epsilon amine of the lysine in the modified protein. Protein ubiquitination regulates many cellular processes including transcription, endocytosis, cell cycle control, signal transduction, stress response, DNA repair as well as proteasomal-mediated degradation C7250 S. Liu, Z.J. Chen , Cell Research (2011) 21:6–21 The complex Ub code contains numerous variants of homotypic and heterotypic (mixed or branched) chains. Based on the eight possible linkages (M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48, and K63) between two Ub moieties, at least 92 different Ub chain types exist. Stolz A. et al., Trends in Cell Biology, 28 (1), 1-3 (2018) Akutsu M. et al., J. Cell Sci., 129, 875-880 (2016) Ubikvitinace ubikvitin – protein 8.5 kDa (76 AMK) MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLV LRLRGG K heterogenita forem C7250 * lokalizace modifikovaných AMK * určení vazeb v polyubikvitinu The most studied polyubiquitin chains - lysine48-linked - target proteins for destruction N.J. Denis, Proteomics 2007, 7, 868–874 Strategie analýzy ubikvitinovaných míst C7250 > Score Mr(calc) Delta Sequence 45.2 2630.4003 -0.0059 KTVTAMDVVYALKRQGRTLYGF 45.2 2630.4003 -0.0059 KTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG 0.3 2630.3792 0.0152 KSAPAPKKGSKKAVTKAQKKD All matches to this query Mascot 79 –100 658.6059 2630.3944 2630.4003 -2.23 0 45 0.0013 1 R.KTVTAMDVVYALKRQGRTLYGF.G + UBI_dT (K) 1 SGRGKGGKGL GKGGAKRHRK VLRDNIQGIT KPAIRRLARR GGVKRISGLI 51 YEETRGVLKV FLENVIRDAV TYTEHAKRKT VTAMDVVYAL KRQGRTLYGF 101 GG Histon H4 (trypsin) Chybná identifikace ubikvitinace nebo K(91) je ubikvitinylován ??? C7250 BBAP monoubiquitylates histone H4 at lysine 91 and selectively modulates the DNA damage response." Yan Q., Dutt S., Xu R., Graves K., Juszczynski P., Manis J.P., Shipp M.A. Mol. Cell 36:110-120 (2009) C7250 Chybná identifikace ubikvitinace nebo K(91) je ubikvitinylován ??? K(1) není ubikvitinylován Nelze rozhodnout zda je ubi na K nebo GG na C-terminu KTVTAMDVVYALKRQGRTLYGF D.Bustos, MCP, 2012 11: 1529-1540 Charakterizace ubikvitinací Schéma experimentu pomocí imunoprecipitace C7250 Ubikvitinace Obsazenost místa, semikvantifikace poměr obsazenosti jednotlivých Ubi míst vzorek vs kontrola četnost jednotlivých míst řetězení ubikvitinu vzorek vs kontrola C7250 de Groot R. E.A. et al., Sci. Signal., 7 (317), ra26 (2014) Charakterizace ubikvitinací Schéma experimentu pomocí imunoprecipitace II UbiSite antibody jiný typ protilátky rozeznávající 13 aminokyselin z C-konce ubikvitinu princip metody schéma experimentu Nat. Struct. Mol. Biol., 25 (July), 631–640, (2018) two human cell lines Hep2 Jurkat proteasomal inhibitors treatment BOR - bortezomib AP15 - b-AP15 Charakterizace ubikvitinací Schéma experimentu pomocí imunoprecipitace II Numbers of ubiquitination sites and ubiquitinated proteins identified in the two cell lines (n = 3 independent biological replicates). Numbers on the top of bars indicate identified ubiquitination sites; numbers within bars indicate identified proteins. Overlap of ubiquitination sites and ubiquitinated proteins between Hep2 and Jurkat cells. Numbers indicate the number of identified ubiquitination sites (left) or proteins (right). Nat. Struct. Mol. Biol., 25 (July), 631–640, (2018) C7250 Ubiquitin-like proteins a77 Glykosylace one of the most common post-translational modifications of proteins in eukaryotic cells. involved in a wide range of biological functions such as receptor binding, cell signaling, immune recognition, inflammation, and pathogenicity. Základní typy glykanů: * N-linked * O-linked * GPI anchors - C-linked - glykace http://www.uniprot.org/manual/carbohyd Variation in the degrees of saturation at available glycosylation sites results in heterogeneity in the mass and charge of glycoproteins Signal Supression C7250 nlink olink N - linked O - linked C7250 glycans are attached to the protein backbone via an amide bond to an asparagine during protein synthesis (in endoplasmic reticulum) N-linked glycosylations N-X-S(T) X nesmí být P subtypes: * High-mannose * Hybrid * Complex C7250 b-D-Mannose b-D-N-Acetylglucosamine N-linked:High-mannose subtype C7250 b-D-Mannose b-D-N-Acetylglucosamine N-linked: Hybrid subtype a-N-Acetylneuraminic acid (Sialic Acid) b-D-Galactose C7250 N-linked: Complex subtype a-L-Fucose C7250 glycans are linked via the hydroxyl group of serine or threonine O-linked glycosylations examples: b-D-N-Acetylgalactosamine C7250 GPI (glycosylphosphatidylinositol) anchors anchors are linked via C-terminus, membrane bound proteins C7250 Charakterizace glykoproteinů * specifická detekce glykosylovaných proteinů * identifikace proteinů * určení glykosylačního místa * určení struktury glykanu C7250 Specifická detekce glykosylovaných proteinů Pro-Q Emerald 300 - glyko only Sypro Ruby - all další techniky detekce: kolorimetrická detekce fluorescenční detekce specifické obohacení: afinitní chromatografie (lektinové matrice. m-Aminophenylboronic Acid) identifikace proteinu: Peptide mapping MS/MS Ion search C7250 chemická: Hydrazinolysis Hydrazine hydrolysis has been found to be effective in the complete release of unreduced O- and N-linked oligosaccharides. Alkaline b-Elimination - jen O-linked s vyjímkami Trifluoromethanesulfonic Acid - destrukce glykanu enzymatická: PNGase F N-linked, vše pryč, pokud ne PNGase A N-linked, vše pryč, pokud ne Endoglycosidase H N-linked, štípe až za prvním Endoglycosidase F1, F2, F3 N-linked, štípou specificky ke struktuře O-Glycosidase O-linked. vše pryč b-galactosidase štípe před ... Deglykosylace C7250 Určení místa glykosylace, resp. struktury glykanů * glykosylace „jen“ na S nebo T (O-linked) NXS(T) (N-linked) lze vytipovat potencionální glyko místa určité strukturní typy u glykanů (high-mannose....) * kombinace MS a MS/MS technik * * separace glykoproteinů resp. glykopeptidů * vhodná deglykosylační strategie * derivatizace glykanů C7250 MALDI-MS spectrum of glycosylated and non-glycosylated protein size of glycan part 30000 40000 50000 m/z 50 100 150 200 250 300 350 a.i. D = 2.8 kDa heterogenita C7250 glykosylovaný protein protein po deglykosylaci Endo Hf 1D GE of protein before and after deglycosylation confirmation of glycosylation C7250 MALDI-MS spectrum of deglycosylated protein confirmation of glycosylation Endoglycosidase Hf 30000 40000 50000 m/z 20 40 60 80 100 120 140 160 180 a.i. deglycosylated 30000 40000 50000 m/z 20 40 60 80 100 120 140 160 180 a.i. 30000 40000 50000 m/z 20 40 60 80 100 120 140 160 180 a.i. C7250 35000 40000 45000 50000 m/z 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 a.i. Daver = 1.2 kDa MALDI-MS celých proteinů C7250 P5_all_zz MALDI-MS tryptických digestů * rozdílový peptid * stejný protein C7250 2900 3100 3300 3500 3700 3900 m/z 100 150 200 250 300 350 400 450 500 a.i. Detail spekter digestů proteinu před a po deglykosylaci PNGase A peptid 3966 zmizel objevil se peptid 2797, vedle peptidu 2795 * N-glykosylace * Daver = 1169 Da C7250 2770 2790 2810 m/z 100 150 200 250 300 350 400 450 500 a.i. Detail spekter digestů proteinu před a po deglykosylaci C7250 tryptický peptid 2796 Da …PHIFDYSGS… , kde D vzniká z N po deglykosylaci PNGasou A původní sekvence je tedy …PHIFNYSGS… (hmotnost 2795 Da) Peptid potvrzen také LC-MS/MS analýzou (v glykosylovaném vzorku digestu nebyl nalezen) Hmotnost glykanu 1170 Da odpovídá xylose+fucose+3*mannose+2*N-acetylglukosamin Nebyl dále potvrzen MS/MS technikami Shrnutí výsledků C7250 …missing parts have potential N-glycosylation sites... • MLRNVCPVLILLIIGATAQDPTDVGEAFANVEWSVAELKRVLVMGVPRDCGELFLSGQNHSGVYNIYPYKDSLLPVSAYCDMETDGGGWTVFQRRGQFG NPVYYFYKKWADYAHGFGDPAKEYWLGNNVLHALTSDKAMSLRIEKNHSLETLTAEYSVFKVASEEEYFKINVGGYIGSK GSDAFSIANGSMFTASDQDHDTYTNNCAVEFKG AWYTSCHGSNLNGLNLNGEHPSYADGIEWSAR GGSTGLYYYSYPNVEMKVRDAHFISRVADGRAS from lecture of Petr Man C7250 2nd_site_MS hexose increments ... glycopeptide... MS/MS from lecture of Petr Man C7250 2nd_site_MS2 MS/MS from 1202.2 - – glycopeptide, type of glycan identified from lecture of Petr Man H – Hexose N – HexNAc C7250 MS/MS 2nd_site_MS3 MS/MS from 971.7 – peptide with one HexNAc – site of glycosylation identified from lecture of Petr Man b2 N(HexNAc)H y13 SLETLTAEYSVFK H – His N – Asn C7250 • MLRNVCPVLILLIIGATAQDPTDVGEAFANVEWSVAELKRVLVMGVPRDCGELFLSGQNHSGVYNIYPYKDSLLPVSAYCDMETDGGGWTVFQRRGQFG NPVYYFYKKWADYAHGFGDPAKEYWLGNNVLHALTSDKAMSLRIEKNHSLETLTAEYSVFKVASEEEYFKINVGGYIGSK GSDAFSIANGSMFTASDQDHDTYTNNCAVEFKG AWYTSCHGSNLNGLNLNGEHPSYADGIEWSAR GGSTGLYYYSYPNVEMKVRDAHFISRVADGRAS from lecture of Petr Man C7250 Kombinace deglykosylačních enzymů C7250 Postupná deglykosylace různými enzymy (MALDI-MS) C7250 C7250 Glycan profiling and structural analysis of glycans NSCLC - Bronchoalveolar Carcinoma Bronchoalveolar Adenocarcinoma Large Cell Carcinoma 0 1 2 3 4 4 x10 2000 2500 3000 3500 4000 m/z 0 2 4 6 4 x10 0 0.5 1.0 1.5 4 x10 3x 3x 4x 4x 6x 5x 5x 3x 6x 4x 5x 3x 5x 3x 4x 3x 4x 5x 3x GlcNAc; Fuc Gal; Man; MALDI-TOF-MS spectra of N-glycans after desialylation Lattová E. et al., J. Proteome Res., 15 (8), 2777-2786 (2016) C7250 Stadlmann J. et al., Nature, 549, 538 (2017) Glycoproteomics of stem cells example of LC-MS/MS based global study C7250 MSFragger-Glyco example of software development Polasky D. A. et al., Nat. Methods, 17, 1125 (2020) a67 A to je konec