Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií C7250 Část V Zbyněk Zdráhal Výzkumná skupina Proteomika, CEITEC-MU Centrální laboratoř-Proteomika, CEITEC-MU Funkční genomika a proteomika, NCBR PřF zdrahal@sci.muni.cz Oddělení funkční genomiky a proteomiky Národní centrum pro výzkum biomolekul Přírodovědecká fakulta MU mu1 Kvantifikace proteinů a MS pic01454 Kvantifikace proteinů pomocí MS Přístupy: * Absolutní kvantifikace stanoveni koncentrace ve vzorku pomocí standardu o známé koncentraci * Relativní kvantifikace poměrné zhodnocení změny koncentrace proteinu ve srovnávaných vzorcích Metody: vs izotopicky odlišnými značkami stejné proteiny/peptidy jsou ve vzorcích odlišeny značkami o různé hmotnosti a takto mohou být měřeny současně vbez izotopického značení (label free) metody absolutní a relativní kvantifikace založené na statistickém vyhodnocení MS, resp. MS/MS dat výhodou je možnost srovnání neomezeného počtu vzorků a absence derivatizační reakce či izotopicky značených standardů C7250 Metody relativní kvantifikace Proteinový vzorek B Společná digesce smíchaných vzorků Proteinový vzorek A SILAC, in-vivo ICAT, ICPL, iTRAQ Oddělená digesce vzorků MCAT, alkylace iTRAQ, TMT LC-MS/MS Stejné peptidy v MS modu neodlišeny MS/MS C7250 Stejný peptid, odlišen kvantifikační značkou 100% LC-MS W. Yan, S.S. Chen, Briefings in functional genomics and proteomics 4 (1), 1–12, (2005) Přehled kvantifikačních metod C7250 Stable Isotope Labelling with Amino acids in Cell culture (SILAC) * in vivo * proteins are labeled by growing cells in media containing isotopically labeled amino acids (e.g. 2H-Leu, 13C-Lys, 13C-Tyr,13C-Arg, 13C/15N-Arg) A B AA labeled cell growing combining purification digestion MS quantification AA normal picture from Ong et al.: MCP 1(2002), 376 C7250 Zobrazit zdrojový obrázek ICAT ... Isotope-Coded Affinity Tags technology for protein expression analysis ü improved quantitation of a wider range of proteins ü overcomes limitations of 2-D gel method (e.g. membrane, low abundance proteins) Ø tags specific for cysteine-containing peptides (reduction of sample complexity) Ø easy automation of a procedure C7250 icatfig2_z ICAT analysis poměr píků = relativní abundance C7250 from Ong et al.: MCP 1(2002), 376 Srovnání in-vivo a in vitro kvantifikačních metod (SILAC vs ICAT) Cell cultures C7250 Mass Coded Abundance Tagging (MCAT) Cagney G., Emili A.: Nature Biotechnol 20 (2002), 163-170 * digesce trypsinem * modifikace digestu vybraného vzorku (K) * * * * * * * * * * * smíchání nemodif/modif v poměru 1:1 D = 42 Da C7250 1:1 Cagney G., Emili A.: Nature Biotechnol 20 (2002), 163-170 MCAT C7250 MCAT Cagney G., Emili A.: Nature Biotechnol 20 (2002), 163-170 poměr píků = relativní abundance C7250 MCAT využití derivatizace pro de novo sequencing b ionty nezměněny, y ionty v dubletech (42 Da) derivatizace neni nikdy kompletní, operace se vzorkem jen ...K peptidy interní K ???? C7250 Kyanotrihydroboritan sodný Reduktivní alkylace - dimetylace - lysin a N-terminus peptidu - izotopicky značený formaldehyd (D, 13C) Hsu et al., Anal.Chem. 2003 http://pubs.rsc.org/services/images/RSCpubs.ePlatform.Service.FreeContent.ImageService.svc/ImageSer vice/Articleimage/2014/CC/c3cc47998f/c3cc47998f-f1_hi-res.gif Reduktivní alkylace - dimetylace Wu et al., Chem. Commun. 2014 Reduktivní alkylace - dimetylace Wu et al., Chem. Commun. 2014 Zobrazit zdrojový obrázek iTRAQ * isobarické značky (4, 8), přednostně na Lys * označené vzorky při LC separaci a v MS stejné chování * kvantifikace na základě reporterových iontů po MS/MS 1:1:1:1 Applied Biosystems/Sciex C7250 iTRAQ® Reagent-8Plex Protein Quantitation-figure1 iTRAQ C7250 Applied Biosystems/Sciex iTRAQ C7250 Applied Biosystems/Sciex iTRAQ C7250 Applied Biosystems/Sciex TMT značky http://planetorbitrap.com/data/fe/image/Workflows_TMT_v3.jpg TMT značky Tandem Mass Tags from http://planetorbitrap.com C7250 TMT C7250 Thermo Fischer Scientific •Isobarické značky (až 16-plex) •MS/MS •Cysteine-reactive mass tags (6-plex) quantitation of the relative abundance of cysteine modifications, such as S- nitrosylation, oxidation and disulfide bonds •Carbonyl-reactive mass tags (6-plex) glycan, steroids, or oxidized proteins quantification lysine labeling TMT C7250 Procedure summary for parallel isobaric labeling for tandem mass spectrometry Thermo Fischer Scientific Analysis protocol summary for tandem mass spectrometry with 6-plex isobaric tags Relative quantitation by tandem mass spectrometry with TMT10plex Reagents Reagents contain different numbers and combinations of 13C and 15N isotopes in the mass reporter. The different isotopes result in a 10-plex set of tags that have mass differences in the reporter that can be detected using high resolution Orbitrap MS instruments. TMT C7250 Thermo Fischer Scientific EASI-tag Easily Abstractable Sulfoxide-based Isobaric tag bioRxiv preprint first posted online Nov. 27, 2017; doi: http://dx.doi.org/10.1101/225649 (a) Molecular structures of the triplex version of EASI-tag. The isobaric labeling reagents are composed in a modular way of four functional groups and feature a central sulfoxide moiety, which introduces an asymmetric, low-energy cleavage site (zig-zag lines indicate fragmentation site). The stable-isotope labeled positions of the neutral loss and equalizer group for multiplexing are indicated by asterisks. Standard labeling protocols can be applied to couple peptides via the amine-reactive moiety. (b) Mass spectra of an EASI-tag-labeled yeast peptide mixed in a ratio of 1:3:10. HCD fragmentation of the doubly charged precursor ion abstracts the neutral loss group and yields the peptide-coupled reporter ion cluster. C7250 EASI-tag Easily Abstractable Sulfoxide-based Isobaric tag C7250 (c) Co-isolation of the natural isotope cluster in a standard isolation window centered on the precursor ion (upper panel) convolutes the relative abundance of peptide coupled reporter ions. An asymmetric isolation window (lower panel) that suppresses the signal from adjacent isotope peaks and enables direct quantification of reporter ions. (d) The precursor mass information is retained in the peptide-coupled reporter ions for EASI-tag labeled peptides. Colored peaks indicate the peptide-coupled reporter ions from an identified yeast peptide in a two proteome experiment (mixing ratios: 1:3:10 for yeast & 1:1:1 for human). Grey peaks are peptide-coupled reporter ions from a co-isolated peptide. (e) EASI-tag- and TMT-labeled HeLa peptides were fragmented with normalized collision energies between 10 and 34. (N = 17,565 precursors for EASI-tag & 20,610 for TMT) bioRxiv preprint first posted online Nov. 27, 2017; doi: http://dx.doi.org/10.1101/225649 Label – free přístup •bez značek •vzorky měřeny jednotlivě •možnost srovnání „neomezeného“ počtu vzorků kritické kroky: •normalizace dat •imputace chybějících hodnot (DIA – redukce počtu chybějících hodnot) LC-MS/MS odstranění šumu detekce píků/údolí výpočet intenzity/plochy jednotlivých píků normalizace imputace chybějících hodnot výpočet poměrů jednotlivých proteinů mezi vzorky statistické testování signifikantní změny v proteomu C7250 Identifikace na základě MS/MS dat, přiřazení identity jednotlivým signálům Label – free přístup Violin graphs and number of observed values: violins width corresponds to the number of values not normalized 3582 3592 3503 3571 3534 3626 3567 35 30 25 20 3556 3552 Violin graphs and number of observed values: violins width corresponds to the number of values loessF normalized 3582 3592 3503 3571 3534 3626 3567 3556 3552 35 25 20 Density (dark blue->dark red) MA plot ('x-y' on matrix red curve is estimated nonparametric lowess model dashed line is unity line (x=y) —10 —10 10 5.0 2.5 0.0 —2.5 —5.0 —10 5.0 0 2.5 0.0 —2.5 —5.0 5.0 2.5 —1 0.0 —2.5 —5.0 —7.5 5.0 0 2.5 0.0 —2.5 —5.0 20 5-1 ID 20 5-2 ID 20 5-5 ID 20 5-6 ID 20 5-7 ID I essF normalized data 20 5-8 ID 20 6-2 ID 20 6-3 ID 20 6-4 ID 20 6-5 ID 20 6-8 ID MA plots - dependence of (x-y) on (x+y)/2 C7250 Label – free přístup Volcano plot with selected categories visualization thresholds: logFC 1, P 0.01 Not sign. (8372) Down&Sign. (14) up&Sign. (22) Significant (54) LIMMA_KO-WT.logFC C7250 Flow_01 Ø AQUA Peptide Selection Ø Order selected peptide isotopically labeled (15N, 13C) Ø Adding labeled peptide to protein mix Ø Digest Ø Analyze by LC-MS/MS to quantitate protein of interest Select an optimal tryptic peptide and stable isotope amino acid from the sequence of your protein of interest Optimize LC-MS/MS separation protocol for quantitation Absolutní kvantifikace AQUA jen pro vybraný protein C7250 Absolutní kvantifikace C7250 AQUA peptidy QconCAT PSAQ syntéza izotopicky označených proteotypických peptidů konstrukce umělého genu složeného z proteotypických peptidů až 20 proteinů exprese v E.coli na značeném mediu purifikace umělého proteinu přidání známého množství do vzorku digesce MS analýza MS analýza MS analýza přidání známého množství do vzorku digesce přidání známého množství do vzorku digesce exprese izotopicky označeného proteinu (s tagem pro purifikaci) Rivers at al., MCP 6, 1416 (2007) purifikace proteinu Brun et al., MCP 6, 2139 (2007) Absolutní kvantifikace Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) N.L. Anderson, J. Proteome Res., 3, 235 (2004) MRM PRM S. Pan, J. Proteome Res., 8, 787 (2009) C7250 Cílená MS/MS analýza vybraných proteinů relativní /absolutní kvantifikace multiple reaction monitoring (MRM) screening – výběr kandidátního proteinu příprava metody (výběr MRM přechodů – peptid + vybraný fragment) Protein mixture In-solution digestion Peptides LC-MS/MS – MRM mode vlastní analýza a zpracování dat http://www.srmatlas.org C7250 Multiplex Immuno-Liquid Chromatography−Mass Spectrometry− Parallel Reaction Monitoring (LC−MS−PRM) Quantitation of immune markers CD8A, CD4, LAG3, PD1, PD-L1, and PD-L2 in Frozen Human Tissues C7250 Zhang et al., J. Proteome Res. 2018, 17, 3932−3940 Accurate MS-based Rab10 Phosphorylation Stoichiometry C7250 assay to measure increased phospho Rab levels using synthetic stable isotope-labeled analogues for both phosphorylated and non-phosphorylated tryptic peptides surrounding Rab10-Thr73 Limit of detection (LOD) of SIL Rab10-pThr73 tryptic peptide (FHpTITTSYYR) with various acquisition methods; full MS, SIM, mxSIM and PRM. Karayel et al., Mol Cell Proteomics (2020) 19(9) 1546–1560 Lawless C., MCP,15, 1309–1322, 2016. Absolute Quantification of over 1800 Yeast Proteins C7250 Konec V. části