C7250 Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií Příprava vzorku pro MS analýzu Gabriela Lochmanová a Hana Konečná Proteomický experiment buňky,tkáň Separace proteinů proteolytické štěpení m/z izolovaný protein MS Separace peptidů Bottom-up 2/celkem Faktory ovlivňující výsledek MS Kvalita a reprodukovatelnost přípravy vzorku Instrumentace Vyhodnocení dat 3/celkem 4/celkem Rozmanitost vzorku Protein extraction = “more of an art than a science” Obecné principy izolace: • Rozrušení buněk – lyzační pufry, mechanicky • Další postup dle povahy cílového proteinu: - srážení (např. aceton, TCA) - změna pH - změna koncentrace soli, imunoprecipitace… Mechanické přístupy rozbití membrán Přístup Nástroj /Pomůcka/Přístroj Princip Mechanický mixér Rozmělnění buněk/tkáně Homogenizace v roztoku Homogenizátory (Dounce Homogenizer, PotterElvehjem Homogenizer) French Press Automatické homogenizátory s využitím skleněných či kovových kuliček Buněčná či tkáňová suspenze protlačena úzkým otvorem Sonikace Ultrazvukový homogenizátor Rozbití buněk pomocí ultrazvukových vln Zmražení/rozmražení Mrazák či suchý led s EtOH Buňky jsou rozbity ledovými krystaly vznikajícími opakovanými cykly zmražování a rozmražování Manuální rozmělnění Miska a tlouček Rozmělnění tkáně v tekutém dusíku 5/celkem Automatická homogenizace vzorku 6/celkem • Homogenizace v roztoku nebo na sucho • Mikrodestičky nebo 2ml zkumavky • Homogenizace na sucho • Zkumavky pro 0.5g – 100g tkáně https://www.youtube.com/watch?v=-hKSJLszx98 https://www.youtube.com/watch?v=fFDc_h11dD4 https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/#precellys24-video https://www.youtube.com/watch?v=zx9oq9dj8Xk Fragmentace nukleových kyselin Ultrasonikační sonda 8/celkem • Jemnější a jednodušší přístup v porovnání s mechanickým rozbitím buněčných membrán (může být i v kombinaci s homogenizací či mechanickým rozmělněním) zpravidla jemnější s nižšími denaturačními účinky Rozbití membrán pomocí lyzačních roztoků Volba lyzačního roztoku s ohledem na kompatibilitu s následným zpracováním vzorku a jeho analýzou • Rozrušení lipidové vrstvy solubilizací proteinů a narušením interakcí lipid:lipid, protein:lipid a protein:protein • Složení lyzačního roztoku: detergent + pufr + další reagencie (specifické dle typu vzorku: chaotropní činidla, soli, inhibitory proteáz a enzymů odstraňujících modifikace, redukční činidla…) Detergenty – ionogenní (kationtové/aniontové) – silné solubilizační a denaturační účinky – zwitteriontové – neiontové • Vliv teploty CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate Nonidet P-40 SDS Sodium Dodecyl Sulfate Příklady inhibitorů proteáz 9/celkem phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF): inhibitor serinových i cysteinových proteáz kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA): inhibitor metaloproteáz Aprotinin: inhibitor serinových proteáz komplex disociuje při pH >10 nebo <3.2 Leupeptin: inhibitor serinových a cysteinových proteáz Pepstatin A: inhibitor kyselých proteáz Příklady inhibitorů fosfatáz 10/celkem fluorid sodný (NaF): inhibitor serinových i treoninových fosfatáz vanadičnan sodný (Na3VO4): inhibitor tyrosinových fosfatáz !nutná aktivace, tj. depolymerace opakovaným vařením a úpravou pH na 10! β-glycerofosfát: inhibitor serinových i treoninových fosfatáz MS analýza proteinového vzorku 11/celkem Cílový protein přítomen v komplexní směsi: •Ionizace velkých molekul probíhá optimálně v přibližně vyvážených množstvích komponent •MS spektrum z komplexní směsi - překrývání množství komponent •Abundantní komponenty – potlačení signálů nízkoabundatních Dynamický rozsah koncentrace proteinů v biologickém vzorku může překročit 10 řádů Požadavek: čistý vzorek s omezenou komplexitou Cíl MS: • Analýza proteinů v komplexní směsi • Analýza cílového proteinu/cílové skupiny proteinů 10 000km 100km 10km 10cm 1 000km 1km 100m 10m 1m 1cm Prefrakcionace a obohacení nízkoabundantních proteinů = efektivnější identifikace a studie cílového proteinu 12/celkem 13/celkem MS analýza proteinového vzorku Snížení komplexity vzorku Subcelulární frakcionace Frakcionace na úrovni proteinu Frakcionace na úrovni peptidu Separace Deplece Obohacení 14/celkem Buňky v kultivačním médiu Buněčný lyzát – charakter dle povahy lyzačního pufru (v případě jemnějších lyzačních podmínek zachovány intaktní organely) Povrchově vázané proteiny Proteiny sekretované do kultivačního média (sekretom) Odstranění buněk a buněčných zbytků Membrány Cytoplasma Odebrání buněk Buněčná lýze Jaderné proteiny Mitochondriální proteiny Cytosolární proteiny Izolace buněčných kompartment Membránové proteiny MS analýza proteinového vzorku Snížení komplexity: Subcelulární frakcionace hydrofobicita, bazicita, velikost Specifické detergenty pro selektivní extrakci membránových proteinů - separace od cytosolárních hydrofilních proteinů 15/celkem Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů MS analýza proteinového vzorku Frakcionace Proteinů = Separace komplexních proteinových směsí Deplece abundatních proteinů Obohacení nízkoabundatních proteinů proteinový vzorek komplexní proteinový vzorek jednoduchý ~ 16/celkem Frakcionační metoda Fyzikálně-chemický parametr Centrifugační metody Ultracentrifugace Hustota Elektroforetické metody Gelová elektroforéza Velikost/náboj Izoelektrická fokusace Izoelektrický bod Kapilární elektroforéza Velikost/náboj Chromatografické metody Reverzní fázová kapalinová chromatografie Hydrofobicita Iontoměničová chromatografie Náboj Afinitní chromatografie Specifická biomolekulární interakce Gelová chromatografie Velikost molekul Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů MS analýza proteinového vzorku Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE MS analýza proteinového vzorku 2D SDS-PAGE: • 1. rozměr = Izoelektrická fokusace (IEF) - elektromigrační metoda - separace proteinů dle pI • 2. rozměr = SDS-PAGE - elektromigrační metoda - separace proteinů dle MW - 1.4g SDS/g protein - SDS pro 2D v kontinuálním uspořádání pI MW KONTAMINANTY: Soli, iontové detergenty, nukleové kyseliny, polysacharidy, lipidy, fenolické látky… 17 Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE – Solubilizace proteinů MS analýza proteinového vzorku Složení solubilizačního roztoku: • Chaotropní činidla (močovina, thiomočovina) • Neionogenní detergent (CHAPS, C7BzO) • Redukční činidla (DTT, TBP) • Inhibitory proteáz a enzymů odstraňujících modifikace (např. fosfatáz, deacetyláz, …) • Amfolyty Komponenty kompatibilní s IEF - nesmí zvyšovat iontovou sílu CHAPS C7BzO Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE – 1. rozměr MS analýza proteinového vzorku pH 3 10 • 1. rozměr = Izoelektrická fokusace (IEF) Migrace nabitých částic v gradientu pH v elektrickém poli 19 Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE – 1. rozměr MS analýza proteinového vzorku ROZSAH STRIPU ROZMĚR STRIPU 20 Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE - 2. rozměr MS analýza proteinového vzorku • 2. rozměr = SDS-PAGE • Migrace aniontů v elektrickém poli dle MW 21 22 • fosforylace: Pro-Q Diamond (pSer, pThr, pTyr), Pierce phosphoprotein staining kit (pSer, pThr) glykosylace: Pro-Q Emerald, Pierce glycoprotein staining kit • Radioaktivní značení Značení před analýzou (DIGE – CyDye, radioaktivní značení) Barvení po analýze Specifické barvení: post-translační modifikace (PTM) Nespecifické barvení: všechny proteiny • Viditelné barvení: Coomassie brilliant blue (R250, G250), stříbro (kyselá x amoniakální varianta) • Fluorescenční barvení: Sypro Ruby (Ex/Em = 280, 450/610 nm), Lucy (Ex/Em = 506/520 nm), Flamingo Pink (Ex/Em = 512/535 nm), Oriole (Ex/Em = 270/604 nm), Krypton (Ex/Em = 520/580), Deep Purple (Ex/Em = 365, 520/610 nm), Lumitein (Ex/Em = 280, 450/610 nm) Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE – Detekce proteinů MS analýza proteinového vzorku Typy detekce: Sypro Ruby Coomassie silver Protean Plus Dodeca Cell Mini-Protean 3 Dodeca Cell Protean II xi Cell Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 2D SDS-PAGE - 2. rozměr MS analýza proteinového vzorku Instrumentace: Izoelektrický fokusátor Elektroforetická aparatura Denzitometr / Fluorescenční skener SW pro obrazovou analýzu 23/celkem MS analýza proteinového vzorku Když SDS-PAGE nefunguje… reduced non-reduced proteins in sample buffer (SDS/DTT/heat) velké nativní proteiny membránové proteiny 24/celkem MS analýza proteinového vzorku Jde to i bez SDS… 25 Schägger & von Jagow, 1991 MS analýza proteinového vzorku BNE vs. BNE / SDS-PAGE eluce SDS-PAGE BNE digest 2-3 PGs per band digest 92 PGs BNE 26 • prefrakcionace v roztoku IEF v roztoku frakcionace dle pI obohacení proteinů o vybraném rozsahu pI •prefrakcionace na IPG stripu IEF v roztoku s využitím IPG stripu frakcionace dle pI Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů IEF Frakcionace MS analýza proteinového vzorku 27/celkem OFFGEL IEF prefrakcionace proteinů nebo peptidů Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů IEF Frakcionace MS analýza proteinového vzorku 28/celkem Gel Elution Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis BSA 92% 97% 1 ug 25 ug Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů 30/celkem Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů MS analýza proteinového vzorku Frakcionace Proteinů = Separace komplexních proteinových směsí Deplece abundatních proteinů Obohacení proteinů •nízkoabundatních •PTM proteinový vzorek komplexní proteinový vzorek jednoduchý ~ Deplece abundatních proteinů Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů MS analýza proteinového vzorku Metody •Precipitace abundantního proteinu •Gelová chromatografie •Imunodeplece Vysoce specifická protilátka proti abundantnímu proteinu imobilizovaná na sorbentu - komerční kity (př. ProteoPrep 20 Plasma Immunodepletion Kit, Seppro (Sigma-Aldrich); Pierce Top 2/12 Abundant Protein Depletion Spin Columns) Výhoda: •Detekce nízkoabundantních proteinů, které byly před deplecí maskovány Riziko: •Nespecifická vazba cílového proteinu na depletovaný abundantní protein (např. nízkoabundantní protein krevní plasmy se může vázat na depletovaný protein, který slouží jako jeho transportní protein) cílový protein může být odstraněn společně s abundantním 31/celkem 32/celkem Deplece abundatních proteinů Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů MS analýza proteinového vzorku Příklad: Proteiny plasmy Abundantní proteiny: ~ mg/ml (Albumin: 30-50 mg/ml, ~ ½ proteinů plasmy) Potenciální biomarkery: ~ pg/ml, nízké hladiny zvláště v brzské fázi nemoci Deplece HSA a IgG Deplece abundatních proteinů Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů MS analýza proteinového vzorku 33/celkem 34/celkem Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů Obohacení nízkoabundatních proteinů MS analýza proteinového vzorku ProteoMinerTM protein enrichment kit • Redukce dynamického rozsahu koncentrace proteinu v komplexní směsi Obohacení středně a nízkoabundantních proteinů a snížení množství abundantních proteinů • Princip: velká, vysoce různorodá knihovna hexapeptidů vázaných na kuličky Abundantní proteiny saturují afinitní ligandy a nadbytečné proteiny jsou odmyty x Středně a nízkoabundantní proteiny jsou zakoncentrovány na specifických ligandech Výhody: Snížení dynamického rozsahu koncentrací při zachování zástupců všech proteinů původního vzorku : Metoda vhodná pro rozmanité typy vzorků, nezávislá na dostupnosti protilátek (na rozdíl od imunodeplece) ProteoMinerTM protein enrichment kit: CPPL Combinatorial Peptide Ligand Library Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů Obohacení nízkoabundatních proteinů MS analýza proteinového vzorku 35/celkem Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů Obohacení nízkoabundatních proteinů MS analýza proteinového vzorku ProteoMinerTM protein enrichment kit 36/celkem 37/celkem Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů Obohacení nízkoabundatních proteinů MS analýza proteinového vzorku • Transfekované buňky (protein zájmu vázaný s tag) • Magnetické kuličky s navázanou protilátku proti tag • Promytí kuliček s navázaným proteinem • Digesce proteinu z kuliček 38/celkem Digesce proteinů MS analýza proteinového vzorku Digesce Obohacení peptidů proteinový vzorek komplexní proteinový vzorek jednoduchý směs peptidů 39/celkem • Výběr vhodné proteinasy (event. kombinace proteinas) • Redukce a alkylace S-S můstků před digescí • Digesci ovlivňuje: poměr enzym:substrát, teplota, doba • Kompatibilita roztoků s následnou MS - odstranění kontaminant – např. FASP, SP3 v gelu v roztoku Digesce proteinů Digesce proteinů MS analýza proteinového vzorku 40/celkem FASP = filter aided sample preparation Digesce proteinů MS analýza proteinového vzorku SDS 8M Urea Peptides DTT IAA centrifugace proteiny nukleové kyseliny Lyzát 8M močovina Hydrogenuhličitan SDS DTT IAA amonný Trypsin PROTEINY PEPTIDY Nature Methods 6, 359 - 362 (2009) centrifugace centrifugace inkubace centrifugace SP3 = Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation 41/celkem MS analýza proteinového vzorku Digesce proteinů Mol Syst Biol. 2014;10:757 Examples: • Carboxylated beads • HILIC beads • S-trap SP3 Protein Aggregation Capture on microparticles of various surface chemistry Modified according to Odstranění kontaminant ze vzorku Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation Protein Aggregation Capture on microparticles Odstranění kontaminant ze vzorku Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni peptidů Frakcionace peptidů v roztoku pomocí LC MS analýza proteinového vzorku Frakcionace: • off-line: LC (prefrakcionace) • on-line: LC-MS • Multidimenzionální chromatografie: LC-(LC)-… v různých provedeních Základní faktory ovlivňující frakcionaci peptidů: • Charakter kolony • Složení mobilní fáze • Fyzikálně-chemická povaha peptidů (náboj, polarita, hydrofobicita, velikost) 44/celkem 45/celkem Chromatografie na reverzní fázi • Nejčastěji používaná • Separace molekul v roztoku na základě hydrofobicity - separace na základě rozdělovacího koeficientu mezi polární mobilní a hydrofobní (nepolární) stacionární fázi • Separaci ovlivňuje: teplota, rozměry kolony, stacionární fáze, velikost částic, iontově-párující činidla, gradient Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni peptidů Frakcionace peptidů v roztoku pomocí LC MS analýza proteinového vzorku Iontově párující činidla 46/celkem Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni peptidů Frakcionace peptidů v roztoku pomocí LC MS analýza proteinového vzorku Hydrofilní interakční chromatografie (HILIC) • Separace hydrofilních peptidů • Hydrofobní mobilní fáze a • hydrofilní stacionární fáze • Vhodná pro separaci posttranslačně-modifikovaných peptidů 1. Distribuce mezi vodnou a organickou vrstvou 2. Iontoměničová interakce se skupinami stacionární fáze • voda • pufr • pH Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni peptidů Frakcionace peptidů na IPG stripu MS analýza proteinového vzorku 47/celkem 48/celkem Obohacení peptidů MS analýza proteinového vzorku Obohacení specifických posttranslačně modifikovaných peptidů • Fosforylace • Ubiquitinace • Glykosylace • Acetylace Přístupy: • Imunoprecipitace (IP) (specifické protilátky proti PTM) • Afinitní chromatografie (protilátka nebo ligand – specifita pro PTM) • Enzymatická modifikace (specifický enzym pro danou modifikaci) • Chemická modifikace 49/celkem • Přístupy pro obohacení fosfopeptidů Obohacení peptidů MS analýza proteinového vzorku SCX Central European Institute of Technology c/o Masaryk University Žerotínovo nám. 9 601 77 Brno, Czech Republic www.ceitec.eu | info@ceitec.cz DOTAZY?