MUNI SCI GENOVÉ TECHNOLOGIE Replikace a syntéza DNA: Replikace DNA u eukaryot a prokaryot, opravné procesy, in-vitro syntéza DNA (PCR, reverzní transkripce). 1 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA Replikace DNA - Zachování integrity organismu vyžaduje kompletní identickou replikaci genomu - Rozvinutí dvoušroubovice, tvorba Y-replikační vidlice Začíná na chromosomu ve specifickém místě označovaném ori (origin of replication) - ori místo obvykle obsahuje vysoký podíl AT bazí - Komplementární řetězec je syntetizován komplexem faktorů a enzymů nazývaných replizom - DNA polymeráza syntetizuje pouze ve směru 5' —► 3' - vedoucí vlákno se syntetizuje kontinuálně - spožďující se vlákno pomocí Okazakiho fragmentů - jednotlivé fragmenty na opožďujícím se vlákně jsou spojovány DNA ligázou - Tento způsob replikace nazýván semikonzervativní replikace 2 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA Replisome (protein) Replication Fork (DNA + protein) Parent DNA Clark and Pazdernik, 2016 M U NI SCI Replikace DNA - DNA má nad šroubovicové vinutí - Nutnost relaxace (gyráza) a rozvinutí dvoušroubovice DNA (helikáza) - Rozvinuté řetězce udržovány pomocí single-stranded binding proteins (SSB) - Pohyb DNA polymerázy - více pozitivního nad šroubovicové h o vinutí - Po replikaci cca. 5% bakteriálního genomu nutno odstraňovat pomocí gyrázy - V rámci replikace kruhových chromozómu může dojít ke katenaci sesterských kopií 3 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA UNTANGLING CHROMOSOMES TOPOISOMERASE IV 'mol Clark and Pazdernik, 2016 M U NI SCI Replikace DNA - Na počátku replikace RNA polymeráza nazývaná primáza nahrazuje SSB proteiny a syntetizuje krátké RNA primery (11-12 b) - Bakteriální chromozom je replikován převážně pomocí DNA polymerázy III - DNA je uzamčena do posuvné svorky pomocí vkládacího komplexu - Následně svorky váží hlavní enzymy pro replikaci - syntetizující a-podjednotka, korekční s-podjednotka a stabilizační 0-podjednotka GENOVÉ TECHNOL polymerase RNA primer Kelchetal, 2012 clamp loader MUNI SCI Clamp loader ATPase 5 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA Kelch etal, 2012 Core enzyme complex DNA moves to DNA polymerase Lagging Clark and Pazdernik, 2016 polymerization complex 6 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA proofreading complex Qiang et al, 2018 MUNI SCI Syntéza opožďujícího řetězce - Nese celou řadu zlomů, segmentů s RNA nebo mezer - DNA polymeráza I odstraňuje RNA a dosyntetizovává řetězec - RNA může být rovněž odstraněna RNasou H (odstraňuje RNA z heteroduplexu) - Výsledné fragmenty jsou spojeny DNA ligázou 7 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA Okazaki RNA primer Okazaki fragment | fragment Parental DNA , sssssss Parental DNA Parental DNA PPPPPPpĚ Parental DNA Pol I movement ° \ Discarded RNA nucleotides Nick sealed SS88SSSSSS , MUNI Clark and Pazdernik, 2016 3 C I Oprava chyb po replikace - Po dokončení replikace opravný systém opraví chyby (u E. coli MutSHL systém) - Při začlenění špatné báze vzniká ve dvoušroubovici vyduť - Buňka předpokládá, že parentální báze je správná, kdy originální vlákno je identifikováno pomocí metylace - Po replikaci DNA je nové vlákno pomalu dometylováván pomoci DNA Adenosin (Dam) a cytosin (Dcm) methyláz CH3 CCTGG GACC CH3 Nonmolhylatod strand cut by MulH DAM METHYLASE CH3 I S A T C C T AG CH3 DCM METHYLASE CH3 I CCTGG G G A C C CH3 CH3 DNA in mismatch region is degraded CH3 _I_ 8 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA iw DNA is insortod and ý > mismatch is correct od to G C CH 4—■ Methyl group 3 on GATC i unit j CH3 • MutS binds mismatch MutL AND MulH JOIN MutS CH3 WM bind One ol MutH subunats binds to methyl group and DNA In between loops out MUNI SCI Srovnání replikace - prokaryota - DNA replikace probíhá běžně dvousměrně - replikační vidlice postupují v opačných směrech - U bakterií proces replikace nazýváme tzv. theta replikací - Některé plazmidy a viry replikují genom procesem nazývaným replikace valivou kružnicí Replication fork New f """"v. ^^^^ GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA Srovnání replikace - eukaryota Eukaryota nemají ekvivalent DNA polymerázy I mající duální aktivitu (exonukleázová a polymerázová) - Objevuje se problém se zkracování konců lineárních chromozómů - No koncích chromozómů telomery (TTAGGG opakování u člověka) syntetizované na základě RNA templátu enzymem telomerázou telomerase transcriptase (TERT) RNA component (TERC) dyskerin protein complex (dyskerin, NOP10, NHP2, GAR1) shelterin complex (TRF1, TRF2, RAP1, POT1.TPP1 a TIN2) TERC GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA Chemická syntéza DNA H. Gobind Korana syntetizoval první aktivní tRNA molekulu o 72 nukleotidech (1970) Arteficiální syntéza DNA je ve směru 3' —► 5' - přichycení první báze na CPG (controlled pore glass) - 5'konec je zablokován pomocí DMT (dimethyloxytrityl) - DMT skupina je odstraněna pomocí slabé kyseliny (TCA) - další nukleotid je přidán ve formě tzv. phosphoramiditu aktivovaného tetrazolem - 5'- OH konce nezreagovaných nukleotidů jsou acetylovány pomocí anhydridu k. octové - opakování procesu (zleva) Har Gobind Khorana, Robert W Holley, Luis W Alvarez, Marshall W Nirenberg, Lars Onsager and Yasunari Kawabata při udílení Nobelovy ceny v roce 1968. M U NI 11 GENOVÉ TECHNOLOGIE-Replikace a syntéza DNA n n T o U J. Chemická syntéza DNA Blocking group DMT ' CH, .Nr Base ■ Deoxyribose Next nucleotide will be joined here X I CH3 N^C-ChU-CHp-O-® CH' / V CH3 Phosphoramidite ^CH^ 3 * XCH, Di-isopropylamino group Blocking group DMT U o Base 1 HV /H 0 1 c = o I (CH2)2 c = o I NH Initial nucleotide Spacer CPG DMT-Dimethoxytrityl PHOSPHORAMIDITE NUCLEOTIDE ACTIVATION COUPLING Blocking group [ Base I Activating Blocking group group I Base I dR H3CO- O ,CH3 NC - (CH,), - O - P - N - CH I sCHo CH d CHo CHo 0 1 Activating 1 -p Activating group 1 group o COUPLE 1ST NUCLEOTIDE TO CPG [Baši] X UR Blocking group Blocking group DI-ISOPROPYLAMINO GROUP ,CH3 HN-CH 1 sCHo CH 3 CHg OHß I Base I I (CH2)2 I CN Blocking group I Base j I Base I NC-(CH?)?-0-P .-. 22 i [Baši] Acid -i>On dR OH ^^Spacer Blocking group ^^S^pacer 12 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA Cl 0CH3 MUNI SCI Chemická syntéza DNA Free 5'- OH -never reacted with 2nd nucleotide O O II II HoC'VSCH, Base Spacer O II HoC/S0- Base H3c'N0-,5'0 O J J Spacer https://www.youtube.com/watch?v=1S0x3aRCviM 13 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA DMT '-i—1 O CH 20 dR Base 21 O PHOSPHATE TRIESTER OXIDATION NC-(CH2)2-0-P 0-CH2Q dR Spacer I DMT j 0 1 CH 20 , dR Base 2 PHOSPHODIESTER NC-(CHp)o-0-P-0 III O CH2 Base I j Spacer Couple spacer + 1st base to CPG -ľ- DEPROTECTION Remove DMT from 5'-OH i COUPLING 1 Add phosphoramidite i CAPPING * Cap all unreacted nucleotides 1 STABILIZATION Oxidize phosphite triester to phosphodiester Remove all other protecting groups Phosphorylate 5' end of oligo Elute from column Repeat for each nucleotide MUNI SCI Polymerázová řetězová reakce K Mullis. F Faloona, S Scharf, R Saiki, G Horn, H Erlich. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol;1986;51 ..the idea of PCR came to him while driving with his girlfriend on a highway.. "It was quiet and something just went, Click!" KARY B MULLIS 1944-2019 Inventor of PCR Technique ■ Denatured template DNA Primer binding site Newly synthesized -copy Denature Products of 2nd Cycle Primer I 3' 3' t Primer Primer binding site Denature Products of 1st Cycle 5- , 3' ' t Denatured template DNA mm REPEAT ■ 5 3 ■ 5 3 Newly . synthesized copy ■ 5 Newly synthesized copies This short product will become the majority when lull number of cycles is complete 14 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA MUNI SCI Modifikace PCR - Inverzní PCR - Použití degenerovaných bazí, zavedení restrikčních míst - Reverzně-transkripční PCR (RT-PCR) - 5'RACE, 3'RACE - PCR cílená mutageneze - Emulzní PCR - Droplet Digital PCR _<\\mŕ<ŕ Double-stranded Target sequence DNA - i ■ i - Target sequence - LAMP ***HB5T STEP 1: MAKING THE TEMPLATE i i '-, Left side Known sequence Right side H Recognition site for restriction enzyme CUT W,TH RESTRICTION ENZYME: LIGATE ENDS PCR primers ■§ Circular 3. 3> template a- S £ Sticky ends join STEP 2: RUN PCR REACTION ^\ ' Front of primer Extra bases matches target form cut site Short segment of known sequence Left side Left side Left side Left side Sticky ends Short segment of known sequence Right side Right side Right side Original gene Exon Intron Exon Intron Exon TRANSCRIPTION AND PROCESSING RT-PCR mRNA Exon Exon Exon REVERSE TRANSCRIPTASE cDNA Exon Exon Exon PCR Multiple copies Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA MUNI SCI RACE PCR 5-RACE 3-RACE 5-UTR 3-UTR AAA reverse trarscrption with specific primers mRNA I S'-UTR 3-UTR AAA ___ reverse transcription with anchor primer fa«toy with terminal transferase —v— ,_min n AAA1 [Al A2 1 TTT~|^ ' A' 1 PCR with anchor pnmoi and anchor specific primer At ■ ■■■■■ii. Illlllll 2. PCR with anchor specific primer A2 Template Primer Template Prim Of . Template Primer t. PCR wim anchor specilic primer A1 JTTT A2 llll llll ITI A- 2 PCR with anchor specific pnmer A2 TTT a,: Illlllll Illlllll llll llll TTT Rapid Amplification of cDNA Ends UilllllliiiiiiiiI A2 AAA! 16 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA MUNI SCI 1016 PCR cílená mutageneze (Predominant product from Step 1) 1. Mutant Strand Synthesis Perform thermal cycling to: •Dcnat.'c :)\A tan; a:e •Anneal mutagenic primers (all primers bind same strand] •Extend primers and ligate nicks with the QuikChange Multi enzyme blend 2. Dpn I Digestion of Template Digest methylated and hemimethylated DIMA with restriction enzyme Dpn I 3. Transformation Transform mutated ssDNA into XI 1 0 Gold ultracompetent cells Figure 1 Overview of the QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis method. 17 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA MUNI SCI Emulzní PCR Použito při NGS technologii (454, ion torrent) a) Generate emulsion by stirring b) Generate clonal beads by emulsion PCR I_ Aqueous phase containing PCR-Mixture Oil phase Droplets Denaturation ^F* Annealing Extension • v.. c) Extract beads from emulsion mm Emulsion breaking buffer* Centrifugation ;.\ * Magnetic J Centrifugation I Washing qPCR for I the determlng beads the yield d) Quantify yield by real time PCR 18 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA Repetition for 50 cycles 2-butanol ♦Vortexing I e) Flow cytometry analysis 3 fluorescence signal MUNI SCI Droplet digital per TUBERCULOSIS (TB) SPUTUM COLLECTION PROCEDURE DNA isolation VIC FAM HEX I Prepare ddPCR ready mix Load mix and sample into a plate Place plate in a droplet generator Q QuantaSoft Read and analyze results Place amplified droplets in a droplet reader Amplify targets in droplets by PCR Generate droplets https://www.youtube.com/watch?v=IAVVoyZxlTU 19 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA MUNI SCI Loop-Mediated Isothermal Amplification - Použití Bst polymerázy (Bacillus stearothermophilus DNA Polymerase I) - Probíhá isotermálně - Amplifikační faktor až 10E09 srovnatelný s 30 cykly PCR - Detekce v rámci 10-30 minut, fluorescence, kolorimetricky, turbidimetricky - Méně náchylná na inhibice - možno provádět přímo ze vzorku https://www.youtube.com/watch?v=L5zi2P4lggw 20 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Replikace a syntéza DNA 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 6B 72 76 80 84 í Time (min) -9- 24.8 ng/fil -■- 2.48 ng/fil 248pg/fil -24.8 pg/(1l -2.48 pg/nl 0.248 pg/|.il 0 0248 pg/jd - 0.00248 pg/til 0.000248 pg/(il Negative control Marker 123456789 10 Marker MUNI SCI