GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese1
GENOVÉ TECHNOLOGIE
Genomika a genová exprese
techniky mapování genů, nekódující části genomu, bioinformatické nástroje, farmakogenetika, DNA mikroarrays, RNA-seq
techniky, metagenomika, epigenetika
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese2
Sekvenace lidského genomu
̶ v době počátku (rok 1990) monumentální úkol
̶ započat v roce 1990 za účasti DOE and NIH
̶ sekvenace prováděna pomocí kontigových map a BACs
̶ prvotní plán počítal s dobou trvání 15 let
̶ nakonec sekvenace pomocí Sangerovy metody téměř dokončena již v roce 2000
̶ výsledná sekvenční mapa publikována 14. dubna 2003, 99.99% přesnost (National Human Genome
Research Institute)
̶ celkové náklady projektu 3 miliardy dolarů
̶ v roce 2000 prezident Bill Clinton ujistil o nepatentovatelnosti lidské DNA
https://https://www.genome.gov/25019885/online-education-kit-how-to-sequence-a-human-genome//
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese3
Celera Genomics Project
̶ založena vědcem Craig Venterem a v roce 1998 započala sekvenační projekt
̶ celkové náklady 300 mil. dolarů byly hrazeny plně s privátních zdrojů
̶ poprvé použita metoda „whole genome shotgun sequencing“
̶ k analýze sekvenačních dat použit přístup vyvinutý Gene Myersem
̶ tento přístup však vyžadoval extrémní výpočtové požadavky
̶ finální výpočet prováděn na 7000 procesorech k získání 1000-násobné rychlosti
oproti Pentium počítačům
̶ tento inovativní přístup dovolil dokončit sekvenaci již za 9 měsíců
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese4
Silná role diplomacie
It is hard to imagine today’s politicians reminding
scientists that cooperation has as much value as
competition.
In 26 June 2000, US President Bill Clinton and UK Prime
Minister Tony Blair presided over a carefully choreographed
piece of scientific theatre. Through a video link connecting
Washington DC and London, they announced to the world that
scientists had completed a rough first draft of the human
genome sequence. Craig Venter (vlevo), Francis Collins (uprostřed), Bill Clinton (vpravo)
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese5
Mapovací techniky
̶ Genomové mapy poskytují lineární sérii značek pro skládání sekvenčních dat
̶ Tvorba genomové mapy:
- genetické mapy (křížení, analýza rodokmenu, přenos genů) – vazebné mapy
- fyzikální mapy (radiační hybridní panel, FISH)
̶ Genetické mapy založeny na vazbě = pravděpodobnosti, že se dva mapované znaky od sebe v rámci
křížení oddělí
̶ Pro určení relativní vzdálenosti markerů zásadní procento případů, kdy jsou nalezeni spolu
̶ Dnes je používána celá řada markerů
Typ mapování Markery Metody lokalizace
Genetické Gen, biochemická vlastnost, DNA markery (RFLP, VNTRs,
mikrosatelity, SNPs)
Vazebná analýza využívající křížení nebo páření,
Analýza příbuznosti
Fyzikální STSs, EST, VNTRs, mikrosatelity Restrikční analýza, Radiační hybridní panel
FISH, Cytogenetické mapování
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese6
Genetické markery
̶ RFLP analýza příbuzných jedinců, snadná identifikace
̶ Variable Number Tandem Repeat (VNTR, minisatelity) – tandemové
repetice o délce 9-80bp (forenzní testování, paternitní testy)
̶ Mikrosatelitní polymorfismus – tandemová repetice o délce 2 – 5bp
̶ Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
̶ SNPs, VNTRs RFLPs jsou rovněž používány ve fyzikálním mapování
̶ Pro velké genomy potřebujeme další markery
- STSs (Sequence Tagged Sites) – unikátní sekvence 100-500 bp
- ESTs (Expressed Sequence tags) – identifikace v cDNA knihovnách
̶ Digesce gDNA pomocí restrikčních enzymů – metoda fyzikálního
mapování
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese7
Genetické markery
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese8
Fyzikální mapovací techniky
̶ FISH (Fluorescence in-situ hybridization) – umístění konkrétní
DNA próby u chromozómů v metafázi vzhledem k proužkování
(chromosome painting)
̶ radiační hybridní mapování – velké segmenty klonovaného
genomu mohou obsahovat dva fragmenty z různých částí genom
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese9
Mezery v rámci lidského genomu
̶ Pro doplnění mezer použití techniky „chromosome
walking“
̶ První klon je většinou lokalizován pomocí známého
markeru (STS nebo RFLP)
̶ Nejvíc mezer je v oblastech repetitivní DNA –
heterochromatin
- hypoacetylace
- metylace H3 na specifických Lys
- methylace CpG nebo CpNpG
̶ Fakultativní X Konstitutivní heterochromatin
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese10
Počet genů X Genom
Organismus Velikost genomu
(Mbp)
Počet protein-kódujcích
genů
Pšenice 17 000 95 000
Rýže 520 45 000
Paris Japonica (Pieris japonský) 149 000 26 000
Trichomonas vaginalis 160 46 000
Encephalozoon intestinalis 2.25 1833
Bahník východoafrický 130 000 ?
Člověk 3200 21 850
Háďátko 97 20 493
Octomilka 180 13 600
Streptomyces coelicolor 8.7 7800
E. coli 4.6 4300
Mycoplasma genitalium 0.58 470
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese11
Nékódující genom
̶ Protein-kódující geny tvoří pouze malou část genomu člověka
̶ V rámci různých druhů celá řada CNE (conserved non-coding elements)
̶ Možné zesilovače transkripce nebo izolační sekvence
̶ 25% lidského genomu tvoří geny pro proteiny, z toho ale jen 1% CDS
̶ Zbývá objasnit roli intronů
̶ Další velká část = repetitivní sekvence
- ribozomální RNA geny (kódující)
- LINE (long interspersed element) (nekódující) – až 20% genomu, retrovirus-like elementy
- SINE (short interspersed element) –až 13% genomu, Alu elementy
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese12
Maxam-Gilbertova sekvenační metoda
• Touto metodou jsme schopni sekvenonat přibližně 250-
300 bp dlouhé fragmenty
• Musíme pracovat s velkým množstvím DNA
• Velká pracnost metody (několik purifikačních kroků),
nemožnost plné automatizace, práce s mutagenními
chemikáliemi
• Používá se stále pro “footprinting“
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese13
Sekvenační metoda dle Sangera
• Syntéza DNA in-vitro za použití “terminátorů“ – dideoxynukleotidů zabraňujících po
svém začlenění do DNA její další elongaci.
Deoxyribosa Dideoxyribosa
• Vyžaduje použití iniciálního primeru, DNA polymerázy a směsi dNTPs
se značenými ddNTPs
• Nasyntetizované řetězce jsou poté separovány pomocí
polyakrylamidové gelové elektroforézy nebo kapilární elektroforézy
• Možnost plně automatizované separace za použití fluorescenčně
značených ddNTPs
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese14
Sekvenační metoda dle Sangera
Throughput/Performance by Run Module
XLRseq: 768 samples per day (690 Kbases)
LongSeq: 1152 samples/day (980 Kbases)
StdSeq: 2304 samples/day (1550 Kbases)
FastSeq: 2304 samples/day (1600 Kbases)
RapidSeq: 3840 samples per day (2100 Kbases)
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese15
Pyrosekvenování (1990)
• umožňuje rychlou sekvenaci krátkých úseků DNA - sekvenace 30 až 50 bazí trvá
přibližně 30 až 45 minut.
• Jedná se o bio-luminometrické sekvenování DNA založené na detekci anorganického
pyrofosfátu (PPi) uvolněného během inkorporace nukleotidů.
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese16
454 a GS Junior systém
Průchodnost 1 miliarda bazí za den
Doba analýza 10.0 hodin
Délka čtení 400
Počet čtení/analýzu 1 000.000
Správnost >99.0% správnost jednoho čtení na 400
bazích
Potřebné množství DNA Méně než 100 ng DNA
Multiplexování Až 192 vzorků/běh
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese17
Akumulace mutací v DNA
̶ Projekt HUGO otevřel mnoho nových možností
̶ V rámci miliónů let dochází k hromadění mutací v rámci
genomu
̶ Většina defektních buněk umírá procesem apoptózy
(řízené buněčné smrti)
̶ Mutace
- v somatických buňkách – nepřenáší se na potomstvo
- v zárodečných buňkách – přenáší se na potomstvo
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese18
Typy mutací
Tranzice GAACGT → GAGCGT
Transverze GAACGT → GATCGT
Missense mutace GAACGT → GATCGT
Glu Arg Asp Arg
Konzervativní substituce ACTCGT → TCTCGT
Thr Arg Ser Arg
Radikální nahrazení GATCGT → GCTCGT
Asp Arg Ala Arg
Nonsense mutace GAACGT → TAACGT
Asp Arg STOP
Inzerce GAACGT → GAAACGT
Delece GAACGT → GACGT
Mutační hot-spoty – oblasti s vyšším výskytem mutací (metylace cytosinu, prokluz v repetitivních oblastech)
Genetická variabilita zohledňuje rekombinační hot-spoty = haplotypové bloky (haplobloky)
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese19
Míra mutací v genomech
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese20
Genomika v medicíně
̶ Největší aplikace genomických dat v diagnostice onemocnění
̶ Genetické testování – stanovení přítomnosti genu asociovaného
s onemocněním:
- svalová dystrofie (gen pro dystrophin)
- cystická fibróza (gen CFTR)
- Huntingtonova choroba (HTT gen)
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese21
Genomika v medicíně
̶ Pro identifikaci kauzálních mutací výhodnější sekvenovat exom (2%) než genom
̶ V současné době více než 3000 onemocnění identifikováno pomocí genomiky a rodokmenové analýzy
- tzv. Mendelovy choroby (mutace v jednom genu vede k onemocnění)
̶ Celá řada onemocnění je polygenních (příspěvek více genů pro rozvoj onemocnění)
- Crohnova choroba
- autoimunitní onemocnění
- psychiatrické poruchy (schizofrenie, AD, mírná kognitivní porucha)
̶ V rámci těchto onemocnění využití GWAS (genome-wide association study)
- analýza jednobodových polymorfismů (SNPs) – frekvence nižší než 1%
- vliv genotypu a prostředí na rozvoj onemocnění
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese22
Zipcode analysis
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese23
Metoda Infinium
• Celogenomové typizace SNPs
• Možnost provádění CNV analýz (copy number variation)
• Průměrná call rate > 99%
• 1 072 820 SNPs/vzorek
• 4 až 48 vzorků najednou
Infinium HD BeadChips
Samples per
BeadChip
Markers per Sample
HumanOmni1-Quad 4 > 1 million*
Human1M-Duo 2 > 1 million
HumanOmniExpress 12 > 700,000
Human660W-Quad 4 > 658,000
HumanCytoSNP-12 12 ~ 300,000
Semi-Custom Human1M-Duo+,
and HumanHap550-Quad+
2 / 4 standard content and up to
60,800 customized SNPs per
sample
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese24
CNVs (copy number variants) analýza
̶ Pomůcka pro detekci celé řady geneticky-podmíněných onemocnění
̶ Analýza chromozomálních aberací (delece, inzerce, multiplikace, přesupení
Gross et al. 2018
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese25
Farmakogenetika a genomika
̶ Vývoj celé řady léčiv byl řízen omylem (penicilin, paralen,
viagra, atd.)
̶ Velký problém při vývoji léčiv je ADR (adverse drug
reaction) – přibližně u 7% lidí
̶ Farmakogenetika – studium dědičných rozdílů v
metabolismu léků
̶ Farmakogenomika – studium všech genů ovlivňujících
odpověď na léčivo
̶ Roche Diagnostics' AmpliChip P450 2D6/2C19 – první
diagnostická analýza SNPs spojených s metabolismem
léčiv pomocí DNA čipu
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese26
Genová exprese - Microarrays
̶ cDNA microarrays:
- nanesení části cDNA knihoven, PCR produktů na čip (25tis. genů u člověka)
- přímá syntéza oligonukleotidů na čipu pomocí fotolitografie
̶ Výběr vhodných oblastí pro sondy (GC poměr, sek. struktury)
Clark and Pazdernik, 2016
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese27
Genová exprese – WGAs, ChIP
̶ WGAs (whole-genome tiling arrays pokrývají
celý genom
̶ Poprvé u Arabidopsis (25-merní
oligonuleotidy)
̶ Objevení nových genů, sestřihových variant
̶ ChIP (chromatin immunoprecipitation):
- analýza DNA oblastí jednotlivých
transkripčních faktorů
- analýza DNA oblastí asociovaných s PTMs
histonů
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese28
Genová exprese - RNAseq
̶ Výhody RNAseq metody:
- není závislý na sondách (správnější kvantifikace daných RNA molekul)
- velký dynamický rozsah
- detekce alternativních sestřihů a možnost jejich kvantifikace
- možnost provedení i bez znalosti genomové sekvence
- možnost provedení i z jedné buňky
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese29
MetaRibo-Seq
Fremin et al. 2020
̶ Riboseq – zastavení translace a následná
sekvenace translatomu
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese30
Metagenomika
̶ Studium genetického materiálu obsaženého ve vzorku
̶ ShotGun přístup X sekvenace specifických fylogenetických oblastí
(16S, 18S, ITS, mcrA)
Johnson et al. 2019
Microbiome Microbiota Metagenome
Microorganisms (and
their genes) living
in a specific
environment
Microorganisms
(by type) living
in a specific
environment
The genes
of microorganisms
in a specific
environment
Gohl et al. 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese31
Sledování genové exprese
̶ Celá řada detailů o genu získána pomocí reportérových genů
- přidání reportérového genu za promotor
- přidání reportérového genu za CDS
̶ Použití následujících genů:
- lacZ gen (b-galaktozidáza)
- phoA gen (alkalická fosfatáza)
- lux/luc gen (luciferáza)
- gfp gen (Green Fluorescent Protein)
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese32
Sledování methylomu
̶ Analýza míst metylace gDNA
̶ Metylací většinou umlčení transpozonové elementy
̶ Umlčení jedné kopie chromozomu X u žen
̶ Analýza pomocí bisulfitové metody
- přidání siřičitanu sodného vede k konverzi nemetylovaných
cytosinů na uracil
- následná sekvenace bez a s přídavkem siřičitanu vede k
odhalení metylačních míst
̶ sekvenátory 3. generace (Nanopores, PacBIO) jsou
schopny přímo číst metylaci na cytosinu
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese33
Sekvenátor PacBio
̶ Sekvenace založena na Single Molecule, Real-Time (SMRT®) technologii
̶ Vyžívá tzv. Zero-Mode Waveguides (ZMWs) umožňujcící osvícení pouze spodní části jamky, ve které je
dole imobilizována DNA polymeráza
̶ Hlavní výhoda je možnost dlouhého čtění (až 20 kb)
̶ Další výhoda je možnost přímé detekce methylovaných bazí (epigenom)
https://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI
PacBio RS II
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese34
Sekvenátor Oxford Nanopores
̶ Základem technologie jsou nanopóry (nanodíry)
̶ Na začátku sekvenace je NK navázána na nanopór tvořený proteinem
̶ Poté je rozpletena a prochází přes nanopór, což generuje změnu proudu
̶ Na základě pozorované změny jsou odečítání v reálním čase jednotlivé báze
̶ Umožňuje sekvenaci velmi dlouhých úseku (desítky až stovky kilobází)
̶ Nevýhodou je vyšší chybovost, správnost >90%
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese35
Editace genomu
̶ Všechny techniky pracují na základě tvorby dvou-řetězcových zlomů
̶ Tyto zlomy jsou následně opraveny nehomologním párováním konců (NHEJ) nebo homologní
rekombinací (HR)
̶ V rámci procesu může dojít k začlenění nového genu nebo vnesení krátké inzerce/delece
inaktivujích daný gen
̶ Dvě základní metody pro tvorby dvou-řetězcových zlomů:
- endonukleázy nebo restrikční enzymy s dlouhou rozpoznávací sekvencí (až 40 bp)
- použití CRISPR/Cas9 systému
̶ ZFNs (Zinc Finger Nucleases) – doména zinkového prstu rozpoznává sekvenci, DNA je štěpena
FokI restriktázou.
̶ TALE nukleázy (TALENs) – rozpoznávací doména pochází z TALE (Transcription Activator-Like
Effector) proteinu, DNA je štěpena FokI restriktázou
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese36
ZFNs a TALENs
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese37
CRISPR/Cas9
̶ Co-exprese endonukleázy Cas9 nebo Cas12a a gRNA specifické k cílovému genu (ropoznávaná
sekvence ∼20 nukleotidů)
̶ Nutno splnit dvě podmínky:
1. Sekvence je unikátní v genomu
2. Cílová sekvence je přítomna hned za Protospacer Adjacent Motif (PAM) – vazba Cas9 endonukleázy
Clark and Pazdernik, 2016