Sekvenátor II generace –MiniSeq,
MiSeq, NextSeq, HiSeq, NovaSeq
Sekvenátor II generace
Příprava DNA knihovny
Vzorek DNA – fragmentace (Covaris, fragmentáza)
Začištění konců (DNA polymeráza)
Ligace adapterů (ligáza)
Výběr fragmentů dle velkosti (SPRI)
Amplifikace fragmentů
Sekvenace (Illumina, IonTorrent)
Sekvenátor II generace
Sekvenátor II generace
Sekvenace amplikonů
Sekvenátor II generace
Sekvenace probíhá v klastrech
Sekvenátor II generace
1. Krok – hybridizace templátu na průtočnou celu
2. Krok – Můstková PCR
Sekvenátor II generace
2. Krok – Můstková PCR
Sekvenátor II generace
2. Krok – Můstková PCR
Sekvenátor II generace
Sekvenátor II generace
2. Krok – Můstková PCR
2. Krok – Můstková PCR
Sekvenátor II generace
3. Krok – Linearizace
Sekvenátor II generace
4. Krok – Odštěpení reverzního vlákna
Sekvenátor II generace
5. Krok – Blokace volného 5‘ konce
Sekvenátor II generace
6. Krok: Čtení – hybridizace sek. primeru
Sekvenátor II generace
Chemie reverzibilních terminátorů
Sekvenátor II generace
Sekvenace pomocí syntézy (SBS)
Sekvenátor II generace
Sekvenátor II generace
Sekvenátor II generace
7. Krok – Pair-End sekvenace
Sekvenátor II generace
7. Krok – Pair-End sekvenace
Sekvenátor II generace
7. Krok – Pair-End sekvenace
Sekvenátor II generace
7. Krok – Pair-End sekvenace
Sekvenátor II generace
Čtení indexů
Sekvenátor II generace
Single index čtení
Sekvenátor II generace
Dual index čtení
(iSeq, MiniSeq, NextSeq,HiSeq)
Sekvenátor II generace
Sequel System PacBio RS II
Sekvenátor III generace – PacBio
Sekvenátor III generace – PacBio
• Sekvenace založena na Single Molecule, Real-Time (SMRT®) technologii
• Vyžívá tzv. Zero-Mode Waveguides (ZMWs) umožňujcící osvícení pouze spodní
části jamky, ve které je dole imobilizována DNA polymeráza
• Hlavní výhoda je možnost dlouhého čtění (až 20 kb)
• Další výhoda je možnost přímé detekce methylovaných bazí (epigenom)
Sekvenátor III generace – PacBio
Příprava knihovny
https://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI
Sekvenátor III generace
Oxford Nanopores
• Základem technologie jsou nanopóry (nanodíry)
• Na začátku sekvenace je NK navázána na nanopór tvořený proteinem
• Poté je rozpletena a prochází přes nanopór, což generuje změnu proudu
• Na základě pozorovanéí zmšny jsou odečítání v reálním čase jednotlivé
báze
• Umožňuje sekvenaci velmi dlouhých úšeku (desítky až stovky kilobází)
• Nevýhodou je vyšší chybovost, správnost >90%