GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii1
GENOVÉ TECHNOLOGIE
Technologie v imunologii
protilátky (struktura, funkce), cílený návrh protilátek, monoklonální protilátky, ELISA, vakcíny (tvorba a výroba, identifikace
potenciálních nových antigenů, DNA vakcíny)
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii2
Úvod
̶ Okolní prostředí je plné infekčních mikroorganismů a virů
̶ Ochrana organismu pomocí buněk imunitního systému
̶ Antigeny – většinou proteiny na povrchu mikroorganismů = aktivace imunitní reakce
̶ Protilátky – rozeznávají a váží se na antigeny = produkovány B-buňkami adaptivního
imunitního systému
̶ Protilátky většinou sekretovány do lymfy, některé se váží na povrch = B-cell receptory
̶ Masivní produkce B-buněk produkujících protilátku rozeznávající daný antigen
̶ Imunitní systém zaznamenává všechny úspěšně použité protilátky= rychlejší a masivnější
odpověď
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii3
Úvod
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii4
Antigen, protilátka, epitop
̶ Antigen – cizorodá molekula aktivující imunitní systém
̶ Nejsilnější imunitní reakce = glykoproteiny a lipoproteiny
̶ Velmi často slouží jako antigeny také polysacharidy
obsažené na povrchu mikroorganismů
̶ Jako antigen může rovněž sloužit DNA
̶ Živočišný imunitní systém je založen na specifické (získané)
imunitě dělící se na:
- humorální imunitu (zprostředkována imunoglobuliny)
- buněčnou imunitu (T – lymfocyty = TH a TC)
̶ Protilátka = vazba na celé proteiny
̶ T-lymfocyty = vazba na fragmenty proteinů
̶ Epitop – oblast proteinu rozpoznávaná protilátkou
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii5
T-lymfocyty
̶ rozpoznávají pouze antigeny exprimované na povrchu ostatních buněk, převážně makrofágů, buněk
infikovaných viry nebo B-lymfocyty
̶ T-lymfocyty rozpoznávají tyto buňky skrze receptorové proteiny třídy I a II hlavních histo-kompatibilních
komplexů (MHCs)
̶ Třída I aktivuje TH buňky a třída II aktivuje TC buňky
̶ MHC receptory jsou kódovány rodinou genů specifických pro každého jedince
̶ MHC receptory nazýváme také hlavní histokompatibilní systémový komplex HLA
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii6
T-lymfocyty
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii7
Struktura a funkce imunoglobulinů
̶ Protilátky děleny do 5 základních tříd
̶ Nejabundantnější jsou IgG v séru
̶ Pouze IgG protilátky prochází přes
placentu
̶ IgA – sekreční potilátky důležité v
potlačování respiračních a
gastrointestinálních infekcí
̶ IgM – 10 vazných míst = obalení
mikroorganismů a stimulace buněk
̶ IgE – na povrchu žírných buněk,
stimulace alergické odpovědí uvolněním
histaminu
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii8
Struktura a funkce imunoglobulinů
̶ IgG protilátka se skládá ze dvou lehkých a dvou
těžkých řetězců
̶ Lehké řetězce kódovány jedním ze dvou genových
lokusů k nebo l
̶ Každý z lehkých a těžkých řetězců se skládá z jedné
až čtyřech konstantních oblastí a jedné variabilní
̶ Variabilní oblasti tvoří tzv. paratop – vazba antigen
̶ Máme miliony různých variabilních oblastí
̶ V Pantové oblasti lze protilátky rozdělit chemicky
(papainem) na Fc a dva Fab fragmenty
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii9
Diverzita protilátek
̶ Existuje téměř nekonečný počet antigenů = je třeba i téměř
nekonečný počet protilátek
̶ Genetický problém týkající se počtu genů kódujících jednotlivé
protilátky
̶ Celý lidský genom by kódoval jen několik miliónů protilátek
̶ Imunitní systém generuje velké množství sekvencí z relativně
malého počtu genů v procesu V(D)J rekombinace
̶ Imunitní systém skládá geny pro protilátky ze sbírek krátkých
DNA segmentů
̶ V(D)J rekombinace probíhá v kostní dřeni během vývoje Bbuněk
a je iniciována proteiny RAG1 a RAG2 s následnou
NHEJ
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii10
V(D)J rekombinace
Smith et al. 2019
Backhaus et al. 2018
Chr. 2 Chr. 14
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii11
Monoklonální protilátky
̶ Protilátky nachází široké klinické využití
̶ Potřeba jedné specifické protilátky proti antigenu
̶ Jeden antigen má mnoho epitopů = polyklonální protilátky
̶ Polyklonální protilátky = směs protilátek s různou mírou specifity a
vaznosti
̶ Monoklonální protilátka = jedna konkrétní protilátka z jedné B-buňky
̶ Životaschopnost B-buněk mimo organismus je velmi nízká = fúze s
myelomovými buňkami
̶ Vzniklou buňku nazýváme hybridom = navždy živá buňka
produkující cílenou protilátku
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii12
Využití protilátek
ELISA
Rychlé testy FACS (Fluorescence-activated cell sorting)
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii13
“Polidštění“ monoklonálních protilátek
̶ Lidský imunitní systém rozpoznává myší protilátky
̶ Několik řešení:
- Nahrazení C-oblasti lidskou variantou protilátky
- Nahrazení V-oblastí nezahrnutých v rozpoznání antigenu lidskou variantou
- Complementarity Determining Region (CDR) – hypervariabilní oblast
rozpoznávající Ag
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii14
Herceptin a Casirivimab
̶ Monoklonální protilátka rozpoznává receptor HER2 (epidermal growth factor receptor type 2)
̶ U pacientek s rakovinou prsu je nadprodukce HER2 spojená s rezistencí k chemoterapii
̶ Vazba protilátek na receptor brání jeho internalizace = lepší účinnost chemoterapie
̶ Casirivimab - monoklonální protilátky rozpoznávající spike protein coronaviru SARS-CoV-2
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii15
Nanobodies
̶ Protilátky velbloudů, alpak a lam mají pouze těžký řetězec (heavychain
antibodies, hcAb)
̶ Antigen váže koncová variabilní oblast těžkého řetězce nazývaná
VHH (12-15 kDa)
̶ Rekombinantní protilátky obsahující pouze tuto část nazýváme
nanobodie (Nb)
̶ VHH oblast má velmi vysokou afinitu pro antigen
̶ Nanobodie dokáží přecházet do mozku
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii16
Vakcíny
̶ Imunitní systém si pamatuje cizí antigeny – imunitní paměť
̶ Imunitní paměť zprostředkovávají speciální paměťové B-buňky
̶ Vakcíny se skládají z odvozených infekčních agens, které již nemohou způsobit onemocnění,
ale jsou stále antigenní
̶ Vakcíny:
- atenuované = stále živé patogeny, které však již neprodukují toxiny nebo proteiny způsobující
onemocnění
- podjednotkové = efektivní pouze proti jedné komponentě z patogenu, často nutné použití
adjuvans
- multivalentní = cílí na několik proteinů z jednoho nebo více virů
̶ Nejlepší imunitní odpověď je indukována většinou vakcínami z atenuovaných mikroorganismů
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii17
Vakcíny
Atenuované vakcíny
Subjednotkové vakcíny
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii18
Hledání vhodných antigenů a adjuvans
̶ Reverzní vakcinologie = postupné klonování genů patogenu a exprese proteinů používaných pro
imunizaci (vakcína pro Neisserie meningitidis séroskupina B)
Adjuvant Composition Vaccines
Aluminum One or more of the following: amorphous aluminum
hydroxyphosphate sulfate (AAHS), aluminum hydroxide,
aluminum phosphate,
potassium aluminum sulfate (Alum)
Anthrax, DT, DTaP (Daptacel), DTaP (Infanrix), DTaP-IPV
(Kinrix), DTaP-IPV (Quadracel), DTaP-HepB-IPV (Pediarix),
DTaP –IPV/Hib (Pentacel), Hep A (Havrix), Hep A (Vaqta),
Hep B (Engerix-B), Hep B (Recombivax), HepA/Hep B
(Twinrix), HIB (PedvaxHIB), HPV (Gardasil 9), Japanese
encephalitis (Ixiaro), MenB (Bexsero, Trumenba),
Pneumococcal (Prevnar 13), Td (Tenivac), Td (Mass
Biologics), Tdap (Adacel), Tdap (Boostrix)
AS04 Monophosphoryl lipid A (MPL) + aluminum salt Cervarix
MF59 Oil in water emulsion composed of squalene Fluad
AS01B Monophosphoryl lipid A (MPL) and QS-21, a natural
compound extracted from the Chilean soapbark tree,
combined in a liposomal formulation
Shingrix
CpG 1018 Cytosine phosphoguanine (CpG), a synthetic form of DNA
that mimics bacterial and viral genetic material
Heplisav-B
No adjuvant ActHIB, chickenpox, live zoster (Zostavax), measles, mumps
& rubella (MMR), meningococcal (Menactra, Menveo),
rotavirus, seasonal influenza (except Fluad), single antigen
polio (IPOL), yellow fever
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii19
Hledání vhodných antigenů a adjuvans
Reverzní vakcinologie Diferenční fluorescenční indukce (DFI) In Vivo indukovaná antigenní technologie (IVIAT)
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii20
Adenovirové vakcíny
Bermejo et al, 2020
https://sputnikvaccine.com/about-vaccine/
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii21
mRNA vakcíny
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie v imunologii22
mRNA vakcíny
Versteeg et al, 2019