Roman Kubínek, Klára Šafářová, Milan Vůjtek
Elektronová mikroskopie
Skriptum podává přehled o základech elektronových mikroskopických technik a jejich
aplikacích v oblasti biologického výzkumu.
K    C   U P  O
Obsah
1. Úvod 3
2. Elektron jako vlna ve vakuu 4
3. Tubus elektronového mikroskopu 5
3.1. Vakuový systém . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
3.2. Elektronová tryska – zdroj elektronů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3.3. Pohyb elektronů v magnetickém poli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
3.4. Elektromagnetická čočka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
4. Zobrazení elektronovým mikroskopem 9
4.1. Pozorování a záznam obrazu vytvořeného elektronovým mikroskopem . . . . . . . . . . . . 10
4.2. Interakce elektronů s preparátem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
5. Základní pracovní režimy transmisního elektronového mikroskopu 11
5.1. TEM jako difraktograf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
5.2. Vznik kontrastu v TEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
5.3. Elektronová holografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
5.4. Atomární rozlišení . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
5.5. Elektronová tomografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
6. Tvorba obrazu ve skenovacím elektronovém mikroskopu 15
7. Detekce rentgenového záření 20
7.1. EDS detektor rentgenového záření . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
7.2. WDS detektor rentgenového záření . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
7.3. Závislost velikosti excitačního objemu na urychlovacím napětí . . . . . . . . . . . . . . . . 23
7.4. Příprava vzorků pro elektronovou mikroanalýzu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
8. Parametry zobrazení a úprava obrazu v SEM 23
9. Environmentální skenovací elektronová mikroskopie 26
9.1. Možnosti eSEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
verze z 1. března 2011 © volně šířitelný text
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
v rámci projektu Moderní technologie ve studiu aplikované fyziky (CZ.1.07/2.2.00/07.0018).
10. Příprava vzorků pro TEM 27
10.1. Ultratenké řezy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
10.2. Fixace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
10.3. Podmínky fixace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
10.4. Odvodnění . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
10.5. Zalévání . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
10.6. Ultramikrotomie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
10.7. Nože . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
10.8. Kvalita řezu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
10.9. Kontrastování . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
10.10. Značení koloidním zlatem (imunohistochemické metody) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
10.11. Repliky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
10.12. Stínování těžkými kovy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
10.13. Metody mrazového sušení, lomu a odpařování . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
10.14. Chladicí média . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
10.15. Zpracování zmraženého preparátu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
11. Příprava preparátů pro skenovací elektronovou mikroskopii 39
11.1. Zvláštnosti pozorování biologických preparátů v SEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
11.2. Chemické metody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
11.3. Mrazové metody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
12. Příklady aplikací TEM a SEM 43
12.1. Využití TEM při charakterizaci magnetosomů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
12.2. Studium sluchových kůstek z archeologických nálezů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
12.3. Včelí pyl jako monitor znečištění životního prostředí . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
12.4. Studium cévního zásobení jater krysy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
12.5. Studium kavitačního opotřebení materiálu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
12.6. Studium chloroplastů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
12.7. Využití SEM při studiu dendritické krystalizace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
13. Literatura 49
2
1. Úvod
Světelné mikroskopy využívají ke zobrazení elektromagnetické vlnění ve viditelné oblasti, případně jí
blízké. Rozlišovací mez je omezena difrakčním limitem, který tvoří přibližně polovina vlnové délky použitého
světla. Elektronové mikroskopy, jak už název napovídá, využívají ke zobrazení elektronů. Elektron
popsal J. J. T v roce 1897, ale cesta do mikrosvěta i nanosvěta se otevřela až klíčovým objevem,
se kterým přišel L  B. Ten v roce 1925 navrhl, že rychle letící částice mají nejen korpuskulární,
ale i vlnový charakter jako světlo, dosud využívané pro zobrazení ve světelném mikroskopu. Objev
to byl tak významný, že Lui de Broglie za něj získal v roce 1929 Nobelovu cenu za fyziku. Vlnová povaha
elektronů byla vzápětí potvrzena elektronovou difrakcí. Analogií k fokusaci světla skleněnými čočkami,
které by jinak byly pro rychle letící elektrony nepřekonatelnou bariérou, se staly dlouhé elektromagnetické
cívky (solenoidy), které ovlivňují dráhu letícího elektronu magnetickým polem, které vytváří proud
tekoucí v jejich vinutích.
První konstrukci transmisního elektronového mikroskopu (obr. 1a) představil tým na Vysoké škole
technické v Berlíně, vedený M K a E R v roce 1932 a prezentovali i první
elektronmikroskopický snímek bakterie (obr. 1b). Ernst Ruska (obr. 1c) se dočkal „poloviny“ Nobelovy
ceny až v roce 1986 za zásadní objev v oblasti elektronové optiky a konstrukci elektronového mikroskopu.
Druhou půlku získali G B a H R za objev skenovacího tunelového mikroskopu z roku
1981.
..
.
Obrázek 1: a) První transmisní elektronový mikroskop, b) první snímek bakterie pořízený v TEM a c) Ernst Ruska.
První komerční skenovací (rastrovací) elektronový mikroskop představila firma Cambridge Scientific
Instruments v roce 1965 na základě práce výzkumného týmu, vedeného C. W. O. Teoreticky i
prakticky byl však princip představen již v roce 1938 německým fyzikem M  A.
Výrobou a vývojem elektronových mikroskopů nejrůznější konstrukce se v současnosti zabývají firmy
JEOL, FEI, LEO, Hitachi, Tescan. Československo dokázalo držet krok se světem v oblasti vývoje a výroby
elektronových mikroskopů. V Ústavu přístrojové techniky v Brně se konstrukcí elektronových mikroskopů
zabývala od šedesátých let skupina vedená V. D a A. D. Brno si tuto tradici drží dále,
i když pod hlavičkou nově vzniklých firem (Delong Instruments, Tescan).
Prvními preparáty, které byly v transmisním elektronovém mikroskopu pozorovány, byly biologické
materiály. Jednalo se o krevní buňky, rostlinné tkáně, ale také chitinové schránky hmyzu nebo rozsivky.
Pozorování těchto preparátů bylo limitováno prostupností urychlených elektronů. Proto preparáty musí
být dostatečně tenké a zbavené veškeré volné vody. U prvních preparátů byl pozorován především
obrys, nikoli vnitřní struktura. Vedle fixace a odvodnění bylo třeba najít rovněž způsob, jak vytvořit
kvalitní ultratenký řez. K tomu bylo třeba rozpracovat zkušenosti z mikrotomie preparátů ve světelné
mikroskopii, které vedly k dnešním ultramikrotomům a diamantovým nožům.
Pozdější uvedení skenovacího elektronového mikroskopu přineslo trojrozměrný pohled do mikrosvěta.
Přestože preparáty pro SEM nevyžadují ultratenké řezy, příprava biologických preparátů je rovněž časově
náročná.
3
2. Elektron jako vlna ve vakuu
Pohybující se elektron o energii E a hybnosti p = mv má podle de Broglieho teorie vlnovou povahu.
Chová se tedy jako vlna o frekvenci f = E
h a vlnové délce λ = h
mv , kde h je Planckova konstanta.
Rychlost elektronů v EM se blíží rychlosti světla a je třeba při jejím výpočtu zahrnout relativistické
vztahy. Pro kinetickou energii elektronu urychleného ve vakuu elektrickým polem, daným urychlovacím
napětím U, platí Ek = mc2
− m0c2
= eU, kde m0 je klidová hmotnost a c je rychlost světla ve vakuu.
Relativistická hmotnost je m = eU
c2 + m0 a rychlost
v = c
√
eU
m0c2
(
2 + eU
m0c2
)
eU
m0c2+1
.
Pro vlnovou délku elektronu, po dosazení do de Broglieho vztahu, dostaneme
λ =
h
√
2m0eU
(
1 + eU
m0c2
) ≈
h
√
2m0eU
.
V praxi pro výpočet λ při známé hodnotě urychlovacího napětí U [V], po dosazení známých konstant,
použijeme vztah λ = 1,226√
U
[nm].
Dosadíme-li do vztahu běžnou hodnotu urychlovacího napětí pro skenovací elektronovou mikroskopii
U = 10 kV, dostaneme vlnovou délku λ = 0,012 26 nm. Pro hodnotu U = 100 kV, běžnou pro transmisní
elektronové mikroskopy, potom λ = 0,003 7 nm. Srovnáme-li tyto hodnoty (λ ∼ 0, 01 nm) s vlnovou délkou
viditelného světla (cca 500 nm), lze očekávat, že elektronový svazek přinese mnohem podrobnější
informace o struktuře vzorku.
U světelné mikroskopie nelze dosáhnout lepší hodnoty rozlišení, než je polovina vlnové délky použitého
světla z důvodu jeho difrakce na kruhových otvorech (apertuře objektivu). E A vyšel z Airyho
disků, které pozorujeme při zobrazení bodového zdroje světla. V případě dvou bodových zdrojů světla,
které navzájem přibližujeme, jsme schopni je rozeznat jako oddělené právě tehdy, když ohybové maximum
jednoho obrazu bodu se kryje s prvním ohybovým minimem druhého obrazu, což odpovídá přibližně 20%
poklesu intenzity světla mezi maximy (obr. 2). Vzdálenost mezi středy maxim obrazů světelných bodů
v tomto případě odpovídá rozlišovací mezi světelného mikroskopu.
..
.
Obrázek 2: Airyho disky a podmínka rozlišení dvou bodů v obraze.
Tuto hodnotu určíme podle vztahu, který odvodil Abbé
dmin = 0,61
λ
n sin α
.
Použijeme-li tento vztah pro stanovení rozlišovací meze elektronového mikroskopu, dostaneme, po dosazení
za vypočtenou vlnovou délku elektronového svazku, rozlišení teoreticky o 5 řádů lepší než v případě
optického mikroskopu. Ve skutečnosti v důsledku vad zobrazení je lepší jen o 2 až 3 řády oproti světelné
mikroskopii. I to však stačí na zobrazení jednotlivých atomů a k rutinnímu pozorování organel
buněk v transmisním elektronovém mikroskopu. Běžné laboratorní transmisní elektronové mikroskopy
mají v současné době rozlišovací schopnost v řádu desetin nm, která postačuje k pozorování např. bílkovinných
makromolekul.
Z matematických vztahů vyplývá, že volbou vyšších urychlovacích napětí dosáhneme i kratší vlnové
délky a tím i menší hodnoty rozlišovací meze. Tento způsob vedl dříve ke konstrukci mikroskopů enormě
velkých, pro něž musely být stavěny speciální budovy (délka tubusu byla přes dvě patra budovy) – viz
4
obr. 3a). V dnešní době přichází vědci se stále dokonaleji korigovanými vadami elektromagnetických
čoček (tzv. Cs korekce), které potom umožní dosáhnout lepších rozlišení při zachování běžné velikosti
elektronového mikroskopu (obr. 3b).
..
.
Obrázek 3: Dřívější a dnešní konstrukce TEM s vysokým rozlišením.
3. Tubus elektronového mikroskopu
Tubus elektronového mikroskopu, podobně jako u světelného mikroskopu, obsahuje zobrazovací systém
s čočkami, které vytváří zvětšený obraz detailů pozorovaných preparátů a s clonami, které mají
funkci omezení zorného pole nebo apertury objektivu. Přesto oproti světelnému mikroskopu musíme mít
na paměti, že zobrazujeme prostřednictvím elektronů, které musíme nějak vytvořit a elektronoptickým
systémem přenést.
3.1. Vakuový systém
Vnitřní prostor mikroskopu, ve kterém se pohybují elektrony, musí být vakuovaný. Základní důvody
tohoto požadavku jsou tyto:
1. Elektronová tryska musí být izolována vakuem, protože vzduch není dostatečně dobrým izolantem.
Vzniká nebezpečí ionizace vzduchu a následného elektrického výboje mezi katodou a anodou
trysky.
2. Vzduch obsahuje molekuly O₂, N₂, CO₂ a uhlovodíky, které způsobují kontaminaci tubusu i pozorovaného
předmětu (vzorku).
Důvodem vyčerpání prostoru tubusu je snaha zabránit náhodným srážkám urychlených primárních
elektronů s molekulami vzduchu, které by vedly ke změnám jejich energie a směru pohybu. Na dosažení
pracovního vakua (minimálně 10−3
až 10−5
Pa) musí být mikroskop vybaven dostatečně výkonnými vývěvami
mnoha různých typů. Používají se především rotační, difúzní, iontové a turbomolekulární vývěvy.
Kvalitu vakua kontrolují měrky vakua a celý proces čerpání vzduchu je řízen automaticky. Rotační olejová
vývěva se používá pro předčerpání zavzdušněného vnitřku mikroskopu, případně pro odvzdušnění
komůrky při výměně preparátů. Tato vývěva je schopna snížit tlak zhruba na 10−1
Pa. Po dosažení tohoto
stupně vakua se zapíná difúzní vývěva, která odpařováním a zpětnou kondenzací speciálního oleje
s nízkou tenzí par snižuje tlak na 10−3
Pa. Prostor elektronové trysky vyžaduje nejvyšší stupeň vakua až
10−7
Pa (přibližně stejný tlak je v kosmickém prostoru) a je ho dosahováno iontovými vývěvami. Nutné je
zmínit ještě turbomolekulární vývěvu a kryogenní pumpu. I přes vysoký stupeň vakua dochází ke kontaminaci
vnitřku tubusu zbytky vodních par a molekulami uhlovodíků, které se tam mohou dostat z odparů
oleje vývěv nebo těsnících tuků. To vše ovlivňuje kvalitu obrazu. Proto se používá speciální antikontaminační
komůrka, která je chlazena kapalným dusíkem z Dewarovy nádoby umístěné vně tubusu. Tím se
snižuje tenze vodních a uhlovodíkových par, které potom kondenzují na komůrce.
5
3.2. Elektronová tryska – zdroj elektronů
Každý elektron je v atomu vázán jistou výstupní energií Ev. Abychom tento elektron z vazby uvolnili,
musíme mu dodat energii, která je větší než Ev. To lze zajistit mnoha různými způsoby. V elektronové
mikroskopii našly své uplatnění především tyto:
1. sekundární emise – studené kovové vlákno (katodu) bombardujeme urychlenými ionty, které nárazem
uvolňují elektrony z povrchu katody. Tento postup se aplikoval u prvních typů TEM, ale dnes
se již prakticky nevyužívá.
2. termoemise – zahříváme-li katodu, zvyšujeme její vnitřní energii. Překročí-li teplota katody jistou
mezní teplotu, dochází k uvolňování elektronů z jejího povrchu. Tento postup je nejužívanější.
3. autoemise – proti studenému kovovému vláknu, odleptanému do tvaru hrotu, umístíme elektrodu
s vysokým kladným napětím. V okolí hrotu vzniká silné elektrické pole, které je schopno vytrhávat
velké množství elektronů z povrchu hrotu. Nevýhodou tohoto postupu je potřeba velmi vysokého
vakua (10−6
až 10−7
Pa).
Zdroj elektronů v elektronovém mikroskopu nazýváme elektronová tryska (popř. elektronové dělo).
Účinnost emise elektronů emitovaných z katody (některým z uvedených způsobů) můžeme ještě zvýšit
vytvarováním katody do tvaru písmene V, což usnadní uvolnění elektronů v místě ohybu (obr. 4a). Katoda
bývá vyrobena z wolframu, protože ten má nízkou výstupní energii valenčních elektronů (Ev = 4,5 eV) a
vysoký bod tání (Tt = 3 653 K) a protože pro svůj provoz nevyžaduje vysokou hodnotu vakua. Životnost
vlákna katody je nepřímo úměrná teplotě, na kterou bývá vlákno obvykle žhaveno. Vlákno wolframové
katody má provozní teplotu přibližně 2 800 K. Jeho životnost je pak asi 40 hodin. V dnešní době je již běžná
katoda z LaB₆ (hexaborid lanthanu – obr. 4b). Tento typ katody má asi 10× větší emisi elektronů než
wolframová katoda, vyžaduje ovšem mnohem vyšší hodnotu vakua (minimálně 10−4
Pa). Tato katoda má
provozní teplotu cca 1 800 K a vydrží asi rok běžného pracovního provozu mikroskopu. V nejvýkonnějších
elektronových mikroskopech bývá zdrojem elektronů autoemisní katoda (Field Emission Gun – FEG,
obr. 4c), která vydrží až několik let.
..
.
Obrázek 4: Katody elektronových mikroskopů: a) wolframová, b) LaB₆, c) autoemisní.
Na zdroje elektronů jsou kladeny požadavky, jako je malá velikost zdroje, nízké rozpětí emisní energie
elektronů, vysoká intenzita elektronového paprsku v malém prostorovém úhlu, nízký šum a dlouhodobá
stabilita, jednoduché ovládání a nízké náklady na provoz. Tyto podmínky splňují Schottkyho (obr. 5) a
studené emisní zdroje. Ve srovnání s termoemisními zdroji vynikají malou velikostí, velkou intenzitou
(100krát vyšší) a životností.
..
.
Obrázek 5: Ukázka řezu Schottkyho emisním zdrojem.
Tento zdroj elektronů je preferován z důvodu vyšší stability proudu svazku. Vyžaduje nižší elektrické
pole k získání stejné emise elektronů, než ostatní emitory. Elektrické pole na emitoru je nastavitelné
napětím, rozměrem, tvarem či ostrostí emitoru. Pro dané elektrické napětí je elektrické pole tím silnější,
čím ostřejší a menší je emitor (hrot). Šum Schottkyho zdroje je velice malý, nepřímo úměrný velikosti
emisní plochy, a proto se zvyšuje se zmenšující se emisní plochou. Proto má Schottkyho emitor větší
poloměr (asi 0,4–1 μm), než studené emisní zdroje.
6
Schottkyho zdroj elektronů je aktuálně nejpokročilejší komerčně dostupný zdroj, zpravidla používaný
ve skenovací elektronové mikroskopii. Tento zdroj využívá Schottkyho jevu, který můžeme popsat jako
zvýšení průtoku elektronů z povrchu zahřátého materiálu působením elektrického pole. Minimální energie
požadovaná k tomu, aby elektron opustil povrch určitého materiálu (výstupní práce), je zajištěna zvýšenou
teplotou. Současně aplikované slabé elektrické pole odnáší emitované elektrony z povrchu materiálu.
Při zvyšování elektrického pole se výstupní práce stále snižuje a tím se zvyšuje emisní proud elektronů.
Kvantově mechanicky můžeme mechanismus emise Schottkyho zdroje vysvětlit snížením potenciálové
bariéry elektrickým polem, což usnadní únik elektronů ve vyšších energetických hladinách. Pro vysoké
hodnoty intenzity elektrického pole se potenciálová bariéra stává tenší a tím zajišťuje značný příspěvek
emise prostřednictvím tunelového jevu.
..
.
Obrázek 6: Schottkyho emisní zdroje, zleva: hrot a ZrOx rezervoár redukující výstupní práci plošek, detail hrotu
s ploškami a celkový pohled na Schottkyho zdroj.
Schottkyho zdroj se tedy skládá z monokrystalického wolframového drátu na jednom konci vyleptaného
do tvaru hrotu, zakončeného ploškami krystalových rovin. Na druhém konci monokrystalického
drátu je svár k polykrystalickému wolframovému drátu přibližně stejného průměru. Tato polykrystalická
smyčka wolframu je upevněna ke dvěma pólům, které jsou vloženy do válcovitého keramického základu.
Asi v polovině monokrystalického drátu je nanesený zásobník (rezervoár) ze ZrOx (obr. 6) Ten zajišťuje
ploškám v krystalografickém směru (100) mnohem nižší výstupní práci, než jiné krystalografické orientace
(obr. 7). Emise ze zdroje je řízena zvýšenou teplotou (1 800 K) ve vakuu.
..
.
Obrázek 7: SEM obrazy špičky hrotů ukazující různé geometrie centrálních plošek emitující elektrony.
Elektronovou trysku tvoří ve všech případech katoda, která je obklopena Wehneltovým válcem, který
má proti špičce vlákna katody otvor (obr. 8). Za válcem je umístěna anoda s otvorem uprostřed, která je
uzemněna. Wehneltův válec vytváří v okolí vlákna katody elektrické pole, které způsobuje, že se svazek
elektronů emitovaných z katody zužuje tak, že těsně před otvorem v anodě vytváří křižiště, tj. nejužší
místo svazku. Toto místo lze pak považovat za bodový zdroj urychlených elektronů. Elektrostatická
optika, která promítá obraz emisního hrotu – křižiště do otvoru v anodě, musí zajistit co nejdokonalejší
kruhovitost průmětu vlákna v křižišti, abychom mohli považovat zdroj elektronů za bodový a koherentní.
..
.
Obrázek 8: Schematický nákres elektronového děla.
Dráha, rychlost a šířka svazku elektronů je poté ještě upravena systémem clonek a čoček, které
společně s elektronovou tryskou vytvářejí ozařovací soustavu elektronového mikroskopu.
7
3.3. Pohyb elektronů v magnetickém poli
Na náboj elektronu e, který se pohybuje v magnetickém poli o indukci ⃗B, působí síla ⃗F, jejíž velikost
a směr lze určit ze vztahu
⃗F = e
(
⃗v × ⃗B
)
,
kde ⃗v je rychlost elektronu. Pro velikost síly F pak platí vztah F = evBsinθ, kde θ je úhel, který mezi
sebou svírají vektory ⃗v a ⃗B.
Jestliže elektron vlétne do homogenního magnetického pole ve směru kolmém k vektoru magnetické
indukce, pak magnetická síla, působící na elektron, zakřivuje jeho trajektorii a ten se začne pohybovat po
kružnici (obr. 9). Z rovnosti odstředivé a magnetické síly můžeme vyjádřit poloměr zakřivení kruhové trajektorie
pohybu elektronu. Vlétne-li elektron do magnetického pole pod určitým úhlem, rozloží se vektor
rychlosti pohybu elektronu na složku normálovou a tečnou. Výslednou trajektorií pak bude šroubovice,
která má v průmětu tvar kružnice o poloměru
r =
mev
Be
,
kde me je hmotnost elektronu.
..
.
Obrázek 9: Trajektorie elektronu v příčném homogenním magnetickém poli.
3.4. Elektromagnetická čočka
Ovlivnění trajektorie elektronu magnetickým polem lze využít k sestrojení elektromagnetické čočky,
která má podobnou funkci jako skleněná čočka v případě světla. Nejjednodušší elektromagnetická čočka
je podobná solenoidu. Solenoid je cívka s velkým počtem závitů, jejichž průměr je mnohem menší než
délka cívky (obr. 10a). Uvnitř solenoidu vzniká téměř homogenní magnetické pole. To, že není dokonale
homogenní, je jedna z příčin vzniku aberací.
..
.
Obrázek 10: Schematické znázornění a) elektromagnetické čočky, b) jejího magnetického pole s vyznačením „chromatické
aberace“ a c) trajektorie elektronů uvnitř čočky.
8
Trajektorie elektronu, který vlétne do magnetického pole elektromagnetické čočky, má tvar prostorové
spirály (obr. 10c). Trajektorie všech elektronů, které procházejí stejným bodem na ose čočky, jsou
magnetickým polem čočky ovlivněny tak, že se za čočkou opět protínají ve stejném bodě na ose čočky.
Čím větší je proud procházející čočkou, tím větší je magnetická indukce pole v dutině čočky, a tím kratší
je ohnisková vzdálenost čočky. Pro vyjádření ohniskové vzdálenosti platí vztah
1
f
=
e
8meU
∫ z2
z1
B2
z0 dz,
kde Bz0 je magnetická indukce v místě z na ose čočky.
Průchodem vysokého proudu vinutím elektromagnetické čočky vzniká teplo, které zvyšuje její teplotu.
Proto musí být elektromagnetické čočky chlazeny. Magnetické pole uvnitř reálné elektromagnetické
čočky není přesně homogenní (obr. 10b). To vede k mnoha vadám, které jsou svou podstatou totožné
s vadami optických čoček. Tyto vady negativně ovlivňují obraz vytvořený čočkou, především jeho kontrast,
hloubku ostrosti a rozlišovací mez. Uveďme příčiny nejběžnějších vad zobrazení.
Sférická (otvorová) vada znamená, že elektromagnetická čočka nefokusuje všechny elektronové paprsky,
vycházející z bodového zdroje na ose, opět do jednoho bodu na této ose. Elektrony, procházející
dále od osy čočky, jsou zaostřovány do bodu, který leží blíž k čočce, než elektrony,
které procházejí čočkou v těsné blízkosti elektronoptické osy. Částečně lze tuto vadu kompenzovat
zmenšením průměru clony.
Chromatická vada je ve světelném mikroskopu způsobena disperzí světla ve skle čoček a projeví se rozkladem
světla na spektrální barevné složky. V elektronovém mikroskopu chromatická vada vzniká
v důsledku rozdílných energií elektronů ve svazku. Pomalejší elektrony s větší vlnovou délkou jsou
v magnetickém poli cívek vychylovány jinak a potom protínají osu cívky v jiném bodě, než elektrony
s vyšší rychlostí. Chromatickou vadu můžeme eliminovat stabilizací urychlovacího napětí mikroskopu,
čímž se stane elektronový svazek monochromatičtější a koherentnější. Jelikož se rychlost
elektronů mění průchodem přes preparát, bude docházet ke chromatické vadě v každém případě.
Tloušťka preparátu musí být tedy co nejmenší.
Osový astigmatismus je způsobený nesymetrií elektronového svazku, tedy i magnetického pole, které
ho deformuje. V důsledku toho mají elektronové svazky různé ohnisko. Astigmatismus se koriguje
přídavným magnetickým polem stigmátoru prakticky při každém zaostřování obrazu, zejména při
větších zvětšeních. Zdrojem astigmatismu mohou být i nečistoty na clonách a pólových nástavcích.
Proto je třeba věnovat udržování čistoty uvnitř tubusu mimořádnou pozornost a clony je třeba čas
od času vyžíhat.
4. Zobrazení elektronovým mikroskopem
Již bylo zmíněno, že stavba transmisního elektronového mikroskopu je podobná stavbě světelného
mikroskopu. Tedy i zobrazení předmětu pomocí transmisního elektronového mikroskopu bude mít jistou
analogii.
Základními stavebními prvky zobrazovací soustavy TEM jsou kondenzor (analogie s kondenzorem
v osvětlovací soustavě SM), objektiv a projektiv (odpovídá okuláru SM). Kondenzor bývá obvykle dvoustupňový
a fokusuje elektronové paprsky na preparát. Promítá křižiště elektronové trysky na preparát
a zajišťuje jeho homogenní a intenzivní ozáření. Důležitým parametrem je úhlová apertura, při níž se
v rovině preparátu zobrazuje křižiště. Ta se mění v závislosti na zaostření, přičemž největší je v ohnisku
kondenzoru. Jak bylo uvedeno v předchozím textu, při malých úhlových aperturách se snižuje chromatická
vada čoček, což však znamená, že pro snímání obrazu se rozostřuje kondenzor a snižuje intenzita
svazku, neboť v oblastech nad a pod ohniskem se zmenšuje úhlová apertura. Naopak, pro vyhledávání
obrazu je možné používat maximální intenzitu svazku a zaostřovat kondenzor. Maximální úhlová apertura
je omezena clonami kondenzoru. V první čočce je vestavěná clona s velkým průměrem, v druhé je
výměnná clona s velikostí otvoru v intervalu 100–500 µm. Kondenzor společně s elektronovou tryskou
tvoří ozařovací část transmisního elektronového mikroskopu (analogie k osvětlovací soustavě SM).
Do zobrazovací části TEM patří prostor preparátu s držákem vzorku, objektiv, projektiv a luminiscenční
stínítko, případně CCD kamera pro záznam obrazu (obr. 13). Objektiv je určen k tvorbě obrazu a má faktor
zvětšení zhruba 100. Zpravidla je tvořen jednou elektromagnetickou čočkou, zatímco projektiv tvoří až
čtyři elektromagnetické čočky. Úkolem projektivu je „promítnout“ obraz na stínítko. Součástí zobrazovací
soustavy TEM je i systém clonek, které omezují průměr zobrazujícího svazku elektronů. Zobrazovaný
9
..
.
Obrázek 11: Tubus transmisního elektronového mikroskopu s kondenzorem, objektivem a projektivem.
předmět je v TEM umístěn v těsné blízkosti objektivu. Objektiv tedy stejně jako ve SM vytváří základní
obraz předmětu. Objektiv má také nejkratší ohniskovou vzdálenost a je rovněž „nejvýkonnější“ čočkou
mikroskopu. Aby se dosáhlo požadované magnetické indukce, má cívka objektivu velký počet závitů,
kterými protéká poměrně značný proud.
Obraz vytvořený objektivem je dále zobrazen čočkami, které tvoří projektiv. Proud procházející čočkami
projektivu lze regulovat, a tím i měnit výsledné zvětšení elektronového mikroskopu. Maximální užitečné
zvětšení užívané v elektronovém mikroskopu je 10⁶.
Do držáku (obr. 12) se vkládají síťky, na kterých jsou umístěny vlastní preparáty. Držák vzorku je
umístěn na goniometrickém stolku, který umožňuje jemné a přesné posuny ve směrech x, y, z a často
je vyžadován i náklon vzorku, zejména při pořizování tomografického obrazu. Náklon je v tomto případě
±70°. V dnešních mikroskopech, ovládaných elektronikou řízenou počítačem, umožňují motorky nastavit
reprodukovatelnou pozici, kterou si uživatel mikroskopu uložil do paměti PC při vyhledávání zajímavých
detailů.
..
.
Obrázek 12: Držák sítěk preparátů v TEM.
Preparátová komůrka bývá umístěna mezi pólovými nástavci objektivu. Do tohoto prostou zasahují
různé detektory a jsou zde i aperturní clony určující dosažitelnou rozlišovací mez.
Hloubka ostrosti obrazu je dostatečně velká, aby pokryla tloušťku ultratenkého řezu (cca 50 nm). Tím
se některé detaily ve dvourozměrném obrazu rozostřují, protože se jejich obrazy vzájemně překrývají.
4.1. Pozorování a záznam obrazu vytvořeného elektronovým mikroskopem
Svazek urychlených elektronů, který nese informaci o zobrazovaném předmětu, nelze přímo vidět
okem, jako je to možné ve světelném mikroskopu. Abychom viděli obraz vytvořený elektronovým mikroskopem,
je nutné převést tyto informace do viditelné podoby. K pozorování obrazu se používá stínítko
pokryté luminoforem (nejčastěji ZnS), které bývá umístěno na dně tubusu TEM. Luminofor je látka, která
je schopna, v závislosti na energii a množství dopadajících elektronů, emitovat světlo různé intenzity o
přibližně stejné vlnové délce. V případě ZnS má vlnová délka vznikajícího světla velikost okolo 550 nm.
Na stínítku potom vzniká obraz z odstínů zelené barvy, který je již možné pozorovat okem. Rozlišení
stínítka je omezeno velikostí zrn ZnS, která se pohybuje okolo 50 nm. Kromě velkého stínítka je většina
elektronových mikroskopů vybavena ještě malým stínítkem, na kterém je možno detail obrazu ještě
zvětšit pomocí binokulárního mikroskopu. Velikost zrn ZnS na malém stínítku se pohybuje kolem 10 nm.
V praxi se pořizuje záznam obrazu pozorovaného předmětu na fotografický film nebo v současnosti se
obraz zaznamenává v digitální podobě pomocí speciálních kamer. Fotografický materiál vhodný pro EM
10
musí být stabilní i při vysoké hodnotě vakua, které je uvnitř EM. Nejpoužívanějším typem fotografického
materiálu je polyesterová podložka, na které je nanesena želatinová vrstvička s drobnými krystalky
chloridu stříbrného (AgCl).
Slow-scan CCD kamery (SSC), používané v TEM, pracují obdobně jako klasické CCD kamery používané
ve světelné mikroskopii. Rozdílem je pouze to, že detektor SSC kamery je schopen zaznamenávat
změny intenzity zobrazujícího svazku elektronů (obr. 13). V současné době se ve SSC kamerách používá
nejčastěji YAG krystal (scintilátor), na který dopadají primární elektrony. Vzniklý obraz se přenáší na
CCD senzor pomocí optických vláken. CCD senzor má přes 10 milionů obrazových bodů (pixelů), což zajišťuje
vysoké rozlišení obrazu. Čipy těchto prvků bývají chlazeny Peltiérovými články, aby se zamezilo
temnému proudu v detektoru. Přestože fotografický materiál umožňuje pořízení perfektního snímku, je
zřejmé, že digitální kamery jsou praktičtější. Hlavním důvodem rozšíření CCD kamer je rychlost záznamu
bez nutnosti vyvolávat film. Je možné je využít k efektivnímu záznamu elektronových difraktogramů.
V režimu nízkých dávek elektronů, při pozorování velmi citlivých preparátů (kryořezy) či v elektronové
spektroskopii, poskytují vysokou citlivost, která je předností těchto kamer.
..
.
Obrázek 13: Kamera pro digitální záznam elektronového obrazu, určená pro instalaci do bočního portu tubusu TEM.
4.2. Interakce elektronů s preparátem
V obou systémech – transmisního i skenovacího elektronového mikroskopu, je pro tvorbu obrazu zásadní
interakce urychlených elektronů s preparátem. Je důležité si však uvědomit, že u TEM elektrony
vzorkem prochází a u SEM na něj dopadají. V obou případech dochází v atomech preparátu k pružnému
a nepružnému rozptylu elektronů. Při pružném rozptylu nedochází k výraznějšímu snížení energie
rozptýlených elektronů oproti energii elektronů primárních (dopadajících na vzorek). Primární elektrony
prolétají elektronovým obalem atomu preparátu, vychylují se tím více, čím blíže míjí elektron jádro a
čím vyšší je hodnota elektrického náboje jádra. Tento úhel může dosáhnout takové hodnoty, že elektron
se jeví jako zpětně odražený. Část elektronů, rozptýlených s dostatečně velkým úhlem, je zachycena
clonou objektivu a tím jsou vyřazeny z tvorby obrazu na stínítku TEM. V důsledku toho se mění intenzita
elektronového svazku a vzniká kontrast obrazu. Kromě toho se na tvorbě obrazu projevuje ještě fázový
kontrast, tvořící různé stupně šedi. Fázový rozdíl je způsoben rozdílem drah elektronů, odchýlených pod
různým úhlem.
Při nepružném rozptylu dochází ke srážkám primárních elektronů s elektrony ve slupkách atomů
preparátu. Srážkami se sníží výrazně jejich energie a změna jejich vlnové délky se podílí na zhoršení
chromatické aberace. Tento nepříznivý vliv roste s tloušťkou preparátu a s klesajícím urychlovacím na-
pětím.
Při srážkách urychlených elektronů s elektrony v orbitalech atomů dochází k excitaci atomů a následné
emisi charakteristického rentgenového záření. Tyto signály, společně s dalšími, si představíme
následně při popisu interakce primárních elektronů s povrchem vzorku u skenovacího elektronového
mikroskopu.
5. Základní pracovní režimy transmisního elektronového mikroskopu
Biologické preparáty jsou tvořeny lehkými prvky, které nezpůsobují dostatečný rozptyl primárních
elektronů, procházejících preparátem. Preparáty bývají umístěny v zalévacích hmotách, které mají podobné
rozptylové vlastnosti a tím nelze očekávat větší rozdíl v kontrastu mezi vzorkem a zalévacím
médiem. Z toho důvodu je třeba v průběhu přípravy preparátů dostat do vzorku těžké kovy, např. Os,
Pb, U, jež bývají zpravidla součástí fixačních činidel a výrazně se podílí na zvýšení kontrastu. Kontrast
lze zvýšit i volbou menšího průměru clony objektivu, snížením urychlovacího napětí nebo volbou
větší tloušťky řezu. Bohužel tyto úpravy snižují rozlišovací schopnost a přináší zhoršení vad zobrazení
mikroskopu.
11
U transmisních elektronových mikroskopů, speciálně pro biologické účely, se ke zvýšení kontrastu
také využívá ohybových jevů, které vznikají při průchodu elektronů preparátem. Nejlépe jsou demonstrovatelné
na drobném otvoru v ultratenkém řezu. Na jeho hraně dojde po dopadu elektronového vlnění ke
vzniku nové vlnoplochy, která se šíří všemi směry a interferuje s původní vlnou rovinného charakteru. Na
stínítku vznikne světlá ploška, která je způsobená konstruktivní interferencí vln elektronového svazku.
Naopak při destruktivní interferenci vzniká interferenční minimum a v příslušném místě vznikne tmavý
prostor. K interferenci dochází při dostatečné koherenci elektronových vln. Ta však v reálné mikroskopii
není dostatečná a vznikne zpravidla jen jedno maximum a minimum, označované jako Fresnelův proužek.
Ten se potom dá využít ke korekci astigmatismu nebo k dokonalému zaostření obrazu.
Jako analogii ke zobrazení v tmavém poli ve světelné mikroskopii bychom mohli vysvětlit zobrazení ve
tmavém poli u transmisního elektronového mikroskopu. Princip metody spočívá v naklonění osvětlovací
soustavy tak, aby ze svazku elektronů po průchodu preparátem byly využity ty, které jsou více odkláněny.
Při zobrazení ve světlém poli jsou normálně zachyceny clonou objektivu. Pokud do zobrazovací
soustavy mikroskopu vniknou tyto rozptýlené elektrony, zobrazí nám světlé detaily vzorku na tmavém
pozadí. Velké odchylky v rychlostech rozptýlených elektronů však přispívají ke snížení rozlišení a velké
chromatické aberaci. Použití metody tmavého pole není tak časté a operátoři EM ho používají ve speciálních
případech, kdy chtějí získat specifickou informaci ze vzorku (obr. 14). Porovnáním obou obrázků
je vidět, že v různých režimech vynikají na krystalech jiné detaily.
..
.
Obrázek 14: Krystaly MnO zobrazené a) v režimu světlého a b) temného pole.
5.1. TEM jako difraktograf
Je-li zkoumaný materiál krystalický, dochází na vhodně orientovaných krystalových rovinách (obr. 15)
k difrakci elektronů. Jestliže dopadají elektronové paprsky na vzorek rovnoběžně se zónami krystalových
rovin, svazky elektronů difraktovaných na různých systémech krystalových rovin jsou objektivovou čočkou
fokusovány do bodů v obrazové ohniskové rovině.
..
.
Obrázek 15: Vhodná orientace krystalické mřížky pro procházející elektrony (snímek vlevo).
V obrazové ohniskové rovině se vytváří Fraunhoferův difrakční obraz, který reprezentuje Fourierovu
transformaci vlny vystupující ze vzorku (obr. 16). Mohli bychom ho, stejně jako ve světelné mikroskopii,
nazvat primárním obrazem, který je zdrojem vlnění, jenž v obrazové rovině vytvoří obraz předmětu
prostřednictvím inverzní Fourierovy transformace. V obrazové ohniskové rovině objektivu je umístěna
objektivová clona, která slouží k vytvoření žádaného typu kontrastu. Abychom mohli pozorovat difrakční
obraz, je třeba zaostřit mezičočku na obrazovou rovinu objektivu. V tomto režimu vidíme difrakční obrazec
i na stínítku mikroskopu a můžeme ho registrovat na film nebo digitální kamerou, umístěnou zpravidla
pod stínítkem.
12
..
.
Obrázek 16: Difrakce elektronů na křemíku.
5.2. Vznik kontrastu v TEM
V klasickém zobrazení pomocí difrakčního kontrastu používáme malou objektivovou clonu, která vymezuje
pouze jeden svazek elektronů – prošlý (T) či difraktovaný (D), k získání známých obrazů ve
světlém, resp. tmavém poli. Použijeme-li velkou objektivovou clonu, dostáváme (pokud je dopadající svazek
elektronů dostatečně koherentní) fázový interferenční kontrast. Obraz A′
libovolného bodu A vzorku
je výsledkem interference vln (svazků) ψ(−g), ψ(0), ψ(g) a dalších, které procházejí otvorem clony objektivu
(obr. 17). Tímto způsobem je možné dosáhnout zobrazení krystalové mřížky vzorku až v atomárním
rozlišení. Přenos kontrastu mikroskopem však v případě interferenčního kontrastu není lineární a je
většinou nutné experimentální snímky interpretovat pomocí počítačových simulací, abychom ověřili, zda
obraz odpovídá zkoumané struktuře a nejde o interferenční artefakt [6].
..
.
Obrázek 17: Princip zobrazení předmětu objektivem TEM.
5.3. Elektronová holografie
D G navrhl princip holografického zobrazení již v roce 1948, dokonce původně pro dosažení
lepšího rozlišení v TEM. Nebyly však známy dostatečně koherentní zdroje elektronů a proto s objevem
prvních laserů (zdrojů vysoce koherentního světelného vlnění) byla rozvíjena nejprve optická holografie.
Elektronová holografie byla vyvinuta až po roce 1990, jakmile byly do elektronových mikroskopů
zavedeny kvalitní autoemisní katody (FEG), poskytující koherentní elektronové svazky.
Elektronová holografie vychází z principů vlnové optiky. Obraz registrovaný ve fotografické desce
nebo na čipu CCD kamery je daný intenzitou (druhou mocninou amplitudy) dopadající vlny. Fáze elektronové
vlny, která je důležitou součástí, je přitom ztracena. Fázi lze počítačově rekonstruovat holografickými
metodami. Jedna z nejrozšířenějších metod v elektronové holografii je použití referenční vlny. Do
mikroskopu s autoemisní katodou je mezi objektivovou čočku a vzorek nainstalován dělič elektronového
svazku v podobě pokoveného skleněného vlákna tloušťky menší než 0,5 μm. Vlákno, na kterém je udržován
kladný potenciál 10 až 150 V, působí jako Fresnelův dvojhranol (obr. 18). Vzorek natočíme tak, aby
byl rovnoběžný s vláknem. Část elektronového svazku tak prochází vzorkem (obrazová vlna ΨS), zatímco
druhá část svazku ΨR působí jako vlna referenční. Informace o amplitudě a fázi je zakódována v modulaci
kontrastu a zakřivení interferenčních proužků obrazové a referenční vlny [6].
13
..
.
Obrázek 18: Princip záznamu elektronového hologramu.
Interpretace elektronového hologramu spočívá v jeho počítačovém zpracování, které umožňuje korigovat
vady přenosu kontrastu mikroskopem a získat tak obraz nedeformované elektronové vlny na výstupu
ze vzorku. Počítačové simulace kontrastu potom stačí provést pouze pro interakci elektronové vlny se
vzorkem, čímž se výrazně snižuje počet parametrů výpočtů.
Elektronová holografie se používá při studiu struktury krystalů v atomovém rozlišení, řada aplikací
je i při nižším rozlišení, jako například při studiu profilů p-n přechodu, zobrazení elektrických či magnetických
polí s laterálním rozlišením několika nanometrů apod.
5.4. Atomární rozlišení
Z fyzikálního principu zobrazení pomocí elektronů vyplývá, že čím je vyšší urychlovací napětí, tím
je kratší vlnová délka elektronového svazku. Tím se rovněž snižuje rozlišovací mez, která při napětích
200 kV a více přináší možnost zobrazit jednotlivé atomy. Je však třeba brát v úvahu také Cs korigované
elektronové mikroskopy, které dosahují atomárního rozlišení při nižších urychlovacích napětích (80 kV).
K tomu je nutné mít kvalitní autoemisní zdroj elektronů poskytující vysoký proud ve svazku. Při správné
orientaci krystalu do osy zóny rovnoběžné se svazkem jsme schopni získat atomy v podobě světlých
bodů, představujících sloupec atomů v příslušné krystalové mříži.
Jedna z efektivních metod k dosažení atomárního rozlišení je metoda Z-kontrastu. Ta využívá nekoherentního
zobrazení v důsledku difrakce pod úhly většími než 3°. Její výhodou je, že poskytuje přímo interpretovatelné
obrazy mikrostruktury – mapy rozptylových center krystalu, ve kterých je intezita úměrná
protonovému číslu Z (odtud Z-kontrast). Nekoherentní přenos obrazu je lineární, a proto počítačové
simulace nejsou potřeba. Abychom mohli metodu Z-kontrastu použít, musí být mikroskop vybaven autoemisní
katodou, řádkováním elektronového svazku a prstencovým detektorem elektronů difraktovaných
pod velkými úhly (High-Angle Angular Dark Field Detector – HAADF). S použitím autoemisní trysky
je v současné době možné dosáhnout velikosti svazku 0,15 nm a proudu kolem 1 nA, což je dostatečné
pro rozlišní atomových sloupců u kovů. Použijeme-li při naklopení krystalu hliníku do osy zóny ⟨110⟩
velkou objektivovou clonu, získáme obraz v atomárním rozlišení. Každý světlý bod na snímku představuje
atomový sloupec minoritní podmřížky hliníku (obr. 19) [6].
..
.
Obrázek 19: Antifázová rozhraní v uspořádané slitině na bázi Fe₃Al – atomové rozlišení podmřížky hliníku v orientaci
⟨110⟩ [6].
5.5. Elektronová tomografie
Narozdíl od běžné transmisní elektronové mikroskopie, která pracuje s ultratenkými řezy, elektronová
mikroskopická tomografie umožňuje prostorové zobrazení útvarů v buňkách s velmi vysokým rozlišením
14
a často – při použití rychle zmrazených, chemicky nefixovaných biologických materiálů – ve stavu velmi
blízkém stavu za živa. Její princip je podobný jako u počítačové tomografie používané v medicíně, ovšem
v ultramikroskopickém měřítku. Elektrony prozařují objekt (tlustší řez než při běžné transmisní elektronové
mikroskopii) pod různými úhly a z tomografických „řezů“ počítač vytváří „trojrozměrné“ modely
objektů (obr. 20).
..
.
Obrázek 20: Klasický obraz TEM (vlevo) a tomografická rekonstrukce (vpravo) multilysosomálního objektu (počítačově
modelováno) (A. J. Koster and W. J. C. Geerts, Utrecht University, Utrecht).
Kryoelektronová tomografie a elektronová tomografie obecně spočívá v záznamu dvourozměrných
projekcí (2D) trojrozměrného objektu (3D) pod různými úhly, při náklonu preparátu (od +70° do −70°).
Následuje seřazení projekcí a tomografická rekonstrukce 2D projekcí do objemu 3D vzorku. Elektronmikroskopická
tomografie tak může poskytnout neocenitelné a originální informace o prostorovém uspořádání
ultrastruktury ve tkáních, buňkách a makromolekulách. V případě kryoaplikací se těží z prostorového
obrazu chemickou fixací neovlivněných struktur objektu (obr. 21). Je však vyžadováno rychlé
zamražení biologických objektů. Oproti laserové konfokální mikroskopii je možné dosáhnout rozlišení
lepší než 5 nm. Rozlišení je závislé na jemnosti krokování náklonu a na celkovém počtu projekcí zkoumaného
vzorku. Obvykle se jedná o stovky expozic (je třeba brát ohled na radiační poškození preparátu
urychlenými elektrony) řízených elektronikou elektronového mikroskopu, ovládající režim náklonu preparátorového
držáku. Často poskytují tyto techniky doplňkovou informaci, protože navíc dávají možnost
fluorescenčního značení organel. Nejčastěji se metody kryoelektronové tomografie používají pro zobrazení
cytoskeletu buněk, pozice jader buněk, prostorové zobrazení bakterií a virů.
..
.
Obrázek 21: Princip elektronové tomografie.
6. Tvorba obrazu ve skenovacím elektronovém mikroskopu
Interakce primárních elektronů se vzorkem přinášejí informace o fyzikálních a chemických vlastnostech
zkoumaného objektu. Energie primárních elektronů, daná použitým urychlovacím napětím, ovlivňuje
tvar oblasti pod povrchem preparátu, ve které se uvolňují jednotlivé signály (tzv. excitační objem, obr. 22).
Tato oblast se s klesající hodnotou urychlovacího napětí stává mělčí (menší co do hloubky a větší co do
šířky). Zvětšení šířky této oblasti je pak příčinou snížení rozlišovací schopnosti mikroskopu. Na hloubku
průniku primárních elektronů do objemu vzorku má dále samozřejmě vliv i složení vzorku. Je-li vzorek
tvořený těžšími prvky (např. kovy), bude produkovat více odražených elektronů než preparát tvořený
lehkými prvky a hloubka průniku primárních elektronů bude menší.
Při dopadu urychleného primárního elektronového svazku na preparát dochází k tomu, že pod povrchem
preparátů se začnou primární elektrony pohybovat náhodným a velmi chaotickým způsobem. Je to
15
dáno pružnými i nepružnými srážkami s atomy vzorku. Na své chaotické dráze mohou generovat další
signály (sekundární elektrony – SE, Augerovy elektrony – AE, rentgenové záření – RTG).
I přes chaotický pohyb elektronů lze přibližně určit, v jaké hloubce pod povrchem vznikají a jakého
prostoru či objemu konkrétní druhy signálů dosahují. Existují speciální statistické metody simulace drah
elektronu. Nejznámější se nazývá metoda Monte-Carlo. Pomocí této numerické metody, využívající náhodných
čísel, lze chaotický pohyb elektronů a jejich objem přibližně popsat. Obr. 23 zobrazuje simulace
pohybu elektronů ve 100 nm měděné (Cu) a Au fólii. Lze si všimnout, že rozptyl elektronu se zvyšuje se
zvyšujícím se protonovým číslem vzorku.
..
.
Obrázek 22: Excitační objem a signály uvolněné z preparátu po dopadu primárních elektronů.
..
.
Obrázek 23: Simulace drah elektronu ve 100 nm tenké fólii metodou Monte-Carlo. A – fólie Cu a B – fólie Au.
Pružný rozptyl se projevuje způsobem, který zahrnuje coulombovskou interakci atomového jádra
(obr. 24). Jestliže elektron proniká elektronovým oblakem a blíží se jádru, je jádrem silně přitahován a
může být rozptýlen pod většími úhly. Pružným rozptylem také vznikají zpětně odražené elektrony (Back
Scattered Electrons – BSE).
..
.
Obrázek 24: Ukázka pružně rozptýlených elektronů.
Nepružné (neelastické) procesy dělíme do tří částí:
• procesy generující RTG záření,
• procesy generující sekundární elektrony (SE) a
16
• procesy vyplývající z kolektivních interakcí s mnoha atomy.
Každý druh signálu má své využití při studiu a měření specifických vlastností vzorku, případně ho lze
využít i v kombinaci více signálů. Z toho důvodu se v SEM využívá celá řada detektorů a je dobré vědět,
který signál a který detektor použít v určité oblasti zkoumání vzorku.
K zobrazení povrchu preparátu se v SEM využívají sekundární nebo odražené elektrony. Sekundární
elektrony mají energii přibližně 50 eV a vystupují z hloubky řádově desítek nm. Kopírují tedy povrch
a přináší informace o jeho topografii. Odražené elektrony, na rozdíl od nich, vystupují z větší hloubky
a reagují citlivě na změnu složení (průměrné protonové číslo v daném místě). Jak již bylo uvedeno,
zpětně odražené elektrony (BSE) jsou v podstatě primárními elektrony, vracejícími se po coulombovské
interakci s jádrem atomu s malou ztrátou energie. Sekundární elektrony mohou být „pomalé SE“, jestliže
jsou elektrony uvolněny z vodivostního či valenční pásu a není potřeba velká energie k tomu, aby byly
elektrony vyraženy primárním elektronovým paprskem. Jejich energie se pohybuje pod 50 eV. Jestliže
jsou elektrony silně vázané ve vnitřních hladinách atomu, tak po vyražení mimo jejich hladinu mohou mít
významnou část (až do asi 50 %) energie primárního paprsku. Tyto elektrony označujeme jako „rychlé
SE“.
Produkce odražených elektronů závisí především na středním protonovém čísle vzorku. Z toho plyne,
že v režimu odražených elektronů se na obrazovce SEM budou jevit místa tvořená těžšími prvky jako
světlé oblasti. Naopak oblasti tvořené lehkými prvky se budou jevit jako tmavá místa. Obraz v odražených
elektronech je tedy schopen odlišit oblasti s různým prvkovým složením (obr. 28). Detekce těchto
elektronů probíhá různými způsoby. V elektronových mikroskopech je stále používán detekční systém
podle konstruktérů Everharta a ornleyho, složený ze scintilátoru a fotonásobiče (obr. 25).
..
.
Obrázek 25: Everhat-ornleyho detektor (scintilátor-fotonásobič).
Sekundární elektrony jsou nejdříve elektrickým polem mřížky kolektoru „odsáty“ z povrchu vzorku.
Poté dopadají na scintilátor, v němž vyvolávají luminiscenci (emisi fotonů). Slabý signál fotonů je převeden
na elektrický impuls ve fotonásobiči. Ten se dále zesiluje v elektronickém obvodu detektoru. Protože
sekundární elektrony mají oproti odraženým elektronům mnohem menší energii i rychlost, musejí být
ještě před dopadem na scintilátor urychleny napětím přivedeným na scintilátor. Odražené elektrony
musejí být tímto napětím naopak bržděny. Detekce obou druhů elektronů probíhá odděleně. Proto si
můžeme vybrat, zda chceme měřit v režimu odražených elektronů či v režimu sekundárních elektronů.
..
.
Obrázek 26: Vliv náklonu povrchu vůči dopadajícímu svazku na emisi SE.
Díky nízké energii sekundárních elektronů se z nakloněných ploch na povrchu preparátu dostane
do detektoru více sekundárních elektronů než z těch, které jsou položeny kolmo k dopadajícímu svazku
elektronů. Výsledkem je proto vyšší intenzita signálu přicházejícího z detektoru. Proto je možno v režimu
sekundárních elektronů lépe rozpoznat topografii povrchu vzorku. Světlá místa na snímku odpovídají
větším sklonům či zakřivením (obr. 26). Výtěžek emise δ = konst.
cos β , kde β je úhel mezi normálou povrchu
a dopadajícím svazkem paprsků. Následující obr. 27 přináší typický 3D obraz členitého preparátu v režimu
sekundárních elektronů. Na obrázku jsou krystaly vínanu draselného, jehož plochy, které jsou více
skloněné mají světlejší odstín, způsobený vyšší emisí sekundárních elektronů.
17
..
.
Obrázek 27: Krystaly vínanu draselného v režimu sekundárních elektronů.
Odražené elektrony, které vystupují z větší hloubky pod povrchem preparátu, přináší sice zkreslenou
informaci o topografii povrchu, ale přináší informaci o průměrném protonovém čísle Z. Hovoříme o materiálovém
kontrastu, který bývá používán k mapování prvků ve spojení s elektronovou mikroanalýzou
(obr. 28).
..
.
Obrázek 28: Odlišení oblasti materiálu na řezu slitiny Al-Cu v režimu zpětně odražených elektronů (BSE) Al (Z = 13)
– tmavší oblasti, Cu (Z = 29) – světlejší oblasti.
„Magnetický kontrast“ umožňuje pozorovat kontrast na doménových stěnách kubických a jednoosých
feromagnetik. Na elektronech uvolněných po interakci s magnetickým vzorkem se projeví účinek Lorentzovy
síly vyvolané magnetickým polem uvnitř domén. Některé elektrony jsou stočené dovnitř vzorku, jiné
jsou usměrněné k povrchu. Na obr. 29 jsou v režimu magnetického kontrastu patrné magnetické oblasti
– domény.
..
.
Obrázek 29: Magnetické domény v materiálu NdFeB.
„Napěťový kontrast“, realizovaný vlivem přitažlivých či odpudivých sil mezi dopadajícími elektrony a
nabitými místy na povrchu, zobrazuje např. potenciálové rozdíly na povrchu polovodičových součástek,
na které je přivedeno napětí. Je tak možné sledovat místa, která jsou defektní a představují bariéru pro
proud procházející obvodem (obr. 30).
Augerovy elektrony (AE) vznikají, když jsou elektrony vyraženy z vnitřních vrstev elektronového obalu
atomu. V této vrstvě vznikne nezaplněná slupka, která je obratem zaplněna elektronem z vnějších vrstev
18
..
.
Obrázek 30: Napěťový kontrast na povrchu tranzistoru při různých hodnotách napětí.
atomu. Takto uvolněná energie může být vyzářena ve formě fotonu rentgenového záření, ale v některých
případech je předána energie některému z elektronů ve vnější slupce, který ji tak může opustit. Dostaneli
se nad povrch látky jako Augerův elektron, jeho energie je velmi nízká a je registrován z nanometrových
hloubek od povrchu. Tento typ elektronů je ideální při popisu povrchových jevů pevných látek (fyzika
povrchů).
Katodoluminiscence vzniká, pokud elektron z valenčního pásu přechází přes zakázaný do vodivostního
pásu, čímž vznikne ve valenčním pásu vakance. Rekombinací elektronu dochází k vyzáření energie ve
formě fotonu ve viditelné oblasti.
Zajímavá je problematika emitovaného rentgenového záření, které vystupuje ze vzorku po dopadu
elektronů s vysokou energií. Analýza charakteristického rentgenového záření umožní jak v TEM, tak
i v SEM provést prvkovou analýzu preparátu. Tím se významně rozšiřují analytické možnosti těchto
přístrojů.
Spojité rentgenové záření Rtg záření patří do širokého spektra elektromagnetického záření. Jeho vlnová
délka, se pohybuje v rozmezí 10−12
m až 10−8
m. Jedná se o záření se silnými ionizačními účinky.
Spojité rtg záření bývá též nazýváno jako brzdné záření a vzniká zpomalením urychleného primárního
elektronu ve zkoumaném vzorku. Elektron nepružně interaguje s jádry atomů. Energetické ztráty jsou
spojité a závislé na příslušném urychlovacím napětí a na úhlu dopadu mezi primárním svazkem a vzorkem.
Spojitá složka rtg záření, emitovaná ze vzorku, zhoršuje výsledky analýzy charakteristického rtg záření.
Spojité rtg záření je polychromatické, má spojité energetické spektrum a jsou v něm obsaženy fotony
různých vlnových délek. Intenzita brzdného záření je funkcí energie (obr. 31). Intenzita se rychle zvyšuje
v oblasti nízkých energií, ale velké množství energie brzdného záření je absorbováno ve vzorku a v detektoru,
čímž intenzita postupně klesá k nule. E0 je energie elektronů způsobujících emisi rentgenového
záření. Ve spektru na obr. 32 je patrná spojitá složka rtg záření mezi píky Au a Cu charakteristického
rtg záření.
..
.
Obrázek 31: Intenzita brzdného rtg záření jako funkce energie.
Charakteristické rentgenové záření Při popisu charakteristického rtg záření můžeme vyjít z teorie,
že jednotlivé elektrony se pohybují kolem jádra atomu v určitých orbitalech. Při aproximaci hovoříme o
kruhových drahách neboli elektronových hladinách, nacházejících se v různé vzdálenosti od atomového
jádra. Kvantová fyzika jednotlivým orbitalům (hladinám) přiřadila určité označení. Hladině, nacházející
se nejblíže jádru, náleží označení K. Hladiny více vzdálené atomovému jádru se dále označují písmeny
L, M, N. Počet hladin záleží na druhu atomu, přesněji na jeho protonovém čísle, které udává zároveň
počet elektronů v obalu. Každé hladině náleží energie udávaná v elektronvoltech (eV).
Z důvodu rozštěpení energie jednotlivých hladin na více podhladin může mít například orbital L další
tři podhladiny označené jako L₁, L₂, L₃ (obr. 33). Tyto indexy se zvyšují s tím, jak se podhladiny vzdalují
od jádra. Podobně je to u ostatních hladin.
Elektron patří mezi částice (fermiony) s poločíselným spinem a podléhajícím určitému pravidlu při
obsazování jednotlivých hladin. Podle tohoto pravidla nemohou být žádné dva nerozlišitelné fermiony ve
19
..
.
Obrázek 32: EDX spektrum zlatem pokovených latexových kuliček na povrchu měděné podložky. Mezi charakteristickými
vrcholy je možné pozorovat spojitou složku spektra rtg záření.
..
.
Obrázek 33: Přechody mezi hladinami vedoucí k emisi charakteristického rtg záření.
stejném kvantovém stavu. Tzn., že je povoleno, aby v každé energetické hladině byly pouze dva elektrony,
a to s opačně orientovanými spiny. Tímto pravidlem je umožněn výskyt pouze jednoho elektronu v každém
rozlišeném kvantovém stavu. Počet elektronů, které mohou obsadit n-tou hladinu atomu je 2n2
, kde n je
hlavní kvantové číslo. „K hladina“ atomu se tedy skládá ze dvou elektronů pro n = 1, která je následována
„L hladinou“ s n = 2 a „M hladinou“ s n = 3. Tyto uzavřené hladiny K, L, M pak dohromady obsahují
2 + 8 + 18 elektronů.
Přechody elektronů mezi těmito jednotlivými hladinami vedou k uvolnění energie, která v určitých
případech odpovídá energii rtg záření. Vznik charakteristického rtg záření nastane, pokud primární
urychlený elektron vyrazí některý elektron z atomu vzorku na některé vnitřní hladině (blízké jádru),
např. z hladiny K. K vyražení dojde pouze za předpokladu, že je předána energie větší, než je energie
kritická (Ec) pro danou vrstvu (K, L, M, N).
Po vyraženém elektronu vznikne prázdné místo a nepřítomností elektronu je narušen rovnovážný stav
atomu jako celku. Takhle ionizovaný atom spěje opět do stavu s minimální energií (do základního stavu)
tím způsobem, že prázdné místo např. v hladině K je obsazeno elektronem z některé vyšší energetické
hladiny, např. hladiny L₃. Rozdíl energií těchto dvou hladin L₃ a K, mezi kterými se přeskok elektronu
odehrál, je vyzářen ve formě kvanta rtg záření nebo je energie předána Augerovu elektronu. Tyto přechody
mají své konkrétní označení, tento konkrétně Kα1. Další přechody jsou znázorněné na obr. 33. Potom,
co elektron z hladiny L₃ přeskočí na prázdné místo po vyraženém elektronu na hladině K, vzniká na
hladině L₃ opět další prázdné místo, které je obsazeno elektronem z některé následující vyšší hladiny,
např. M. Emitované záření má opět svou charakteristickou energii a také své konkrétní označení. Energie
jsou tabelovány a využívají se při identifikaci složení vzorku. Každý prvek periodické tabulky má své
jedinečné rozložení energetických hladin a také jedinečné hodnoty energií při všech možných povolených
přechodech mezi dvěma hladinami.
V přeneseném významu tyto energie slouží jako „otisky prstu“ každého chemického prvku a tímto
způsobem je tedy možné zjistit chemické složení zkoumaného vzorku.
7. Detekce rentgenového záření
Pro získání charakteristického spektra a následné vyhodnocení charakteristického rtg záření, je důležitá
rychlá a přesná detekce rtg záření vystupujícího ze vzorku. Elektronový mikroskop (SEM nebo
20
TEM) může být vybaven analyzátorem, který provádí rozklad rtg záření podle energie (Energy Dispersive
Spectrometer - EDS) nebo podle vlnové délky (Wavelength Dispersive Spectrometer – WDS). Protože
systém EDS je běžnější, především z důvodu nižších pořizovacích nákladů a rychlejšího získání spektra,
bude popsán především jeho princip; o WDS se zmíníme okrajově.
7.1. EDS detektor rentgenového záření
Dnešní EDS detektory jsou schopny registrovat více než 10⁶ rtg pulzů za sekundu a roztřídit je
v mnohokanálovém analyzátoru do podoby charakteristického spektra.
Zpravidla EDS rtg detektory (obr. 34) mají Si(Li) detektor chlazený kapalným dusíkem (LN₂). Ten je
schopen poskytnout mikroanalýzu s vysokým rozlišením čar charakteristických energií ve spektru.
..
.
Obrázek 34: ermo Scientific NanoTrace detektor rtg záření.
Tyto typy detektorů využívají aktivní oblasti od 10 do 50 mm². Energetická citlivost a vysoké rozlišení
dovolují přesnou kvalitativní a kvantitativní analýzu. Schéma polovodičového Si(Li) detektoru ilustruje
obr. 35.
..
.
Obrázek 35: Schéma Si (Li) polovodičového detektoru.
Detektor pracuje na principu obráceně polarizované PIN diody. Když rtg záření interaguje s polovodičem,
dochází k přechodu elektronů z valenčního pásu do pásu vodivostního a vytvoření páru elektron-díra.
Vysokoenergetické elektrony ztratí energii v křemíku (Si). Charakteristické rtg záření s typickou energií
více než 1 keV může vygenerovat tisíce párů elektron-díra. Počet vytvořených párů elektron-díra je
přímo úměrný energii přicházejícího rtg záření n = Ex
ω , kde Ex je energie fotonů rtg. záření a ω průměrná
energie potřebná na vytvoření 1 páru (pro Si ωSi = 3,6 eV). Amplituda napěťového impulsu je vyjádřena
vztahem
U =
en
C
=
eEx
ωC
,
kde e je elementární náboj a C celková kapacita systému.
Jelikož rtg záření proniká hmotou mnohem snadněji než elektrony, potřebujeme pro rtg záření vnitřní
oblast mezi P a N polovodičem o tloušťce asi 3 mm k tomu, aby vytvořila páry elektron-díra. Používaný
křemík obvykle obsahuje nečistoty akceptorového druhu (P polovodič), proto je dopován lithiem (Li).
Lithium nasytí akceptorovou příměs a polovodič má jen vlastní vodivost. Elektrony a díry vygenerované
rtg zářením představují velmi malý náboj (asi 10−16
C). Sběr většiny signálů zajišťuje záporné předpětí
mezi čelní a zadní stěnou, které jsou pokryty tenkou kovovou vrstvou z Au či Ni (10 až 20 nm na čelní
21
stěně a 200 nm na zadní stěně). Aplikujeme-li závěrné napětí, záporný náboj je disklokován na P oblasti
v přední části detektoru a kladný náboj na zadní části. Elektrony a díry jsou oddělené a může tak být
měřen puls elektronů v zadním ohmickém kontaktu. Následně je signál zesílen tranzistorem řízeným
polem (FET). Velikost tohoto pulsu je úměrná energii rtg záření, které vygenerovalo páry elektron-díra.
Chlazení detektoru je nutné z důvodu omezení tepelné energie, která by aktivovala páry elektron-díra
a zvyšovala tak úroveň šumu. Dále by hladina šumu ve FET maskovala signály z nízkoenergetického rtg
záření. Z těchto důvodů chladíme detektor i FET kapalným dusíkem ze zásobníku – Dewarovy nádoby.
Rozlišovací schopnost detektoru je běžně dosahována v hodnotách 140 eV na MnKα
a 80 eV na CKα
.
Mezi detektorem a komorou je beriliové okénko, které zabraňuje kondenzaci nečistot na detektoru.
Odsunutím okénka je možno měřit na nižších energiích.
Vedle pojmu EDS ,,Energy Dispersive Spectrometer“ se můžeme setkat také s EDX, což je označení
pro ,,Energy Dispersive X-Ray Analysis“. Existují dva přístupy jak provést EDX mikroanalýzu. Kvalitativní
EDX mikroanalýza, kterou můžeme detekovat prvky v určité oblasti vzorku. Rozsah detekce prvků
záleží na citlivosti konkrétního detektoru, na protonovém čísle studovaného vzorku a na délce expozičního
času při načítání EDX spektra. Kvantitativní EDX mikroanalýza vychází z porovnání spekter.
Srovnávají se intenzity čar rtg záření měřených prvků ve studovaném vzorku s intenzitami odpovídajících
čar produkovaných z určitého standardu.
7.2. WDS detektor rentgenového záření
Tento způsob detekce charakteristického rentgenového záření vede k získání mnohem přesnějšího
spektra energií a tím k přesnějšímu stanovení chemického složení analyzovaných mikroobjemů. Princip
detekce je naznačen na obr. 36.
..
.
Obrázek 36: Princip detekce charakteristického rtg záření u WDS.
Při WDS se využívá Braggova vztahu 2d sin θ = n.λ pro difrakční maxima, z něhož lze při známém
d určit λ a tím i energii rtg záření. Základem detekce je krystalový detektor se syntetickým krystalem,
případně systémem krystalů s velkou vzdáleností krystalových rovin d, aby byla umožněna i analýza
lehkých prvků (Be, B, C, O, N). Energie dopadajícího svazku elektronů musí být 2 až 2,5krát vyšší než
je excitační energie (energie absorpční hrany) pro daný prvek. Touto metodou však můžeme dosáhnout
mnohem vyššího rozlišení energií až 5 eV (oproti 150 eV u EDS).
WDS EDS
Vysoké spektrální rozlišení (2–6 eV) Nízké spektrální rozlišení (130–155 eV)
Nižší účinnost při nabírání spektra (pomalejší) Vysoká účinnost při nabírání spektra (rychlejší)
Vyšší citlivost na změnu geometrie vzorku Nižší citlivost na změnu geometrie vzorku
Řídké artefakty ve spektru Časté artefakty ve spektru
Nevyžaduje LN₂ Vyžaduje LN₂
Dochází k pohybu mechanických částí Nedochází k pohybu mechanických částí
Je nutná relativně vysoká energie svazku Nízká energie svazku není problémem
Nákladné zařízení Méně nákladné zařízení
..
.
Tabulka 1: Porovnání WDS a EDS mikroanalytických metod.
22
7.3. Závislost velikosti excitačního objemu na urychlovacím napětí
Excitační objem je nejvíce ovlivněn urychlovacím napětím primárního svazku elektronů. Ve snaze
dosáhnout většího excitačního objemu lze zvýšit energii dopadajících elektronů na desítky keV. Primární
paprsek s vyšší energií dokáže proniknout hlouběji do vzorku. Elektronový svazek paprsků musí mít
energii větší než je kritická hodnota energie (Ec), potřebná k ionizaci atomu uvolněním elektronu z vnitřní
hladiny elektronového obalu atomu. Hodnota Ec se zvyšuje pro elektrony v hladině nejblíže jádru. Pro
K slupku je Ec vyšší než pro hladinu L. Atomy s vyšším protonovým číslem mají více elektronů v obalu
a proto je i Ec vyšší. Jak velké hloubky excitační objem dosáhne, lze přibližně vypočítat pomocí střední
hloubky penetrace ve vzorku podle vzorce
R = 0,33(E2
0 − E2
c )/ρ,
kde R je střední hloubka penetrace, E0 energie primárního elektronu (v keV), Ec kritická ionizační energie
(keV) (pro AuMα1
= 2,123 keV) a ρ hustota vzorku (v g/cm³) (ρAu = 19,32 g/cm³). Následující tabulka 2
obsahuje vypočtené hodnoty hloubky penetrace ve zlatě pro hodnoty urychlovacího napětí 5 kV, 10 kV a
15 kV.
E0 [keV] 5 10 15
R [nm] 35 163 376
..
.
Tabulka 2: Střední hloubky penetrace pro jednotlivá urychlovací napětí.
Volba optimálního urychlovacího napětí je důležitá pro optimalizaci podmínek EDX mikroanalýzy.
Souvisí s účinným ionizačním průřezem a obecně se dá konstatovat, že větší urychlovací napětí usnadňuje
excitaci, zvyšuje penetraci elektronů do hloubky, ale tím zvyšuje i absorpci rtg kvant vygenerovaných ve
vzorku. Kvůli účinkům absorpce, která může zhoršit vyhodnocení EDX spekter, by volba primární energie
elektronu neměla být příliš vysoká. Použité urychlovací napětí se zpravidla pohybuje kolem 15 kV.
7.4. Příprava vzorků pro elektronovou mikroanalýzu
Naprášená vrstva pro eliminaci povrchového náboje u nevodivých preparátů (biologické preparáty,
…) způsobuje problémy při analýze překryvem píků naprášeného kovu (čím těžší prvek, tím více čar).
Preparáty musí být čisté a nekontaminované (hydrokarbonáty, prach, …)
8. Parametry zobrazení a úprava obrazu v SEM
Zatímco v TEM můžeme dosáhnout jen pseudo-3D efektu při pozorování tenkých řezů, charakteristickým
obrazem v SEM je 3D obraz s vysokou hloubkou ostrosti. Obraz v SEM vzniká bod po bodu, řádek
po řádku skenováním povrchu vzorku. Zvětšení obrazu je proto rovno podílu velikosti L hrany obrazu na
monitoru a velikosti intervalu L′
zobrazovaného povrchu vzorku
Z =
L
L′
.
Rozsah zvětšení používaných v SEM se pohybuje v rozmezí od 5 až po 600 000. Maximální hodnota
zvětšení SEM je současně rovna velikosti jeho užitečného zvětšení.
Rozlišovací mez SEM závisí především na průměru stopy fokusovaného elektronového svazku na
povrchu preparátu. U nejběžnějších přístrojů s wolframovou přímo žhavenou katodou se rozlišovací mez
pohybuje v rozmezí 10 až 15 nm. V novějších typech výkonných SEM se používají autoemisní elektronové
trysky, které mají mnohem menší průměr katody. Tyto typy SEM pak umožňují dosáhnout rozlišovací
meze až 1 nm. Rozlišovací mez SEM je (stejně jako v TEM) dále ovlivněna mnoha vadami zobrazení
(chromatická vada, otvorová vada, astigmatismus, aj.). Tyto vady lze minimalizovat clonkami a speciálními
druhy elektromagnetických čoček, které jsou umístěny v elektronoptické soustavě SEM.
Pro hloubkou ostrosti L0 obrazu vytvořeného pomocí SEM (obr. 37) platí vztah:
L0 =
d0
Zα
,
kde d0 je rozlišovací mez oka (0,2 mm), α aperturní úhel (v rad) a Z zvětšení SEM.
Z uvedeného vztahu je zřejmé, že s rostoucím zvětšením SEM klesá hloubka ostrosti vzniklého obrazu.
Proto musíme při zobrazování pomocí SEM volit kompromis mezi zvětšením a hloubkou ostrosti obrazu
23
..
.
Obrázek 37: Znázornění intervalu L0 (hloubka ostrosti).
tak, abychom dosáhli optimální hloubky ostrosti v zobrazených detailech povrchu preparátu [14]. Pro
případ plochého zobrazení povrchu integrovaného obvodu (obr. 38) není nutná vysoká hloubka ostrosti
a převažuje potřeba dosáhnout vyšší rozlišovací schopnosti, zatímco u preparátu na obr. 39 je tomu
naopak. Může jím být hmyz, členité krystaly nebo jiné objekty. Ve všech případech je pro nás rozhodující
dostatečná hloubka ostrosti, zajišťující přijatelně ostré zobrazení v celém objemu vzorku.
..
.
Obrázek 38: Povrch integrovaného obvodu.
..
.
Obrázek 39: Krevní buňky a snímek hmyzu.
Uveďme ve stručném přehledu nejčastější příčiny vedoucí ke snížení kvality výsledného obrazu.
1. Neostrost způsobená:
• špatnou volbou urychlovacího napětí,
• nestabilitou zdroje elektronového svazku, např. způsobená nedostatečným žhavením katody,
• chybným seřízením primárního elektronového svazku,
• nedokonalým vycentrováním aparatury objektivu,
• nedostatečnou korekcí astigmatismu,
• příliš velkým zvětšením,
• špatně fokusovaným svazkem elektronů (nezaostřeno),
• značnou plošnou hustotou náboje na povrchu vzorku,
• nezaostřeným fotoaparátem nebo CCD kamerou.
24
2. Celkově nízká kvalita obrazu může být zapříčiněna:
• špatnou volbou urychlovacího napětí,
• chybným nastavením velikosti proudu primárního svazku elektronů,
• zřetelným šumem vyvolaným nadměrným zesílením fotonásobiče,
• chybně nastaveným jasem a kontrastem pro snímání obrazu,
• nevhodnou vzájemnou polohou vzorku a detektoru,
• nedokonale připraveným vzorkem,
3. Faktory způsobující lokální poruchy obrazu z důvodu:
• nestability emise elektronového děla,
• značné plošné hustoty náboje na povrchu vzorku,
• mechanických vibrací,
• vnějšího elektromagnetického pole,
• nečistot na vzorku.
4. Deformace vzorku může být způsobena:
• termickým poškozením primárním elektronovým svazkem,
• změnou teplotního gradientu vzorku,
• zkreslením způsobeným náklonem preparátu,
• velkým plošným nábojem na povrchu vzorku,
• poškozením vzniklým při přípravě vzorku.
Existuje celá řada způsobů, jak se výše uvedeným problémům vyhnout. Dnešní přístroje dokážou i
samy optimalizovat parametry pro dosažení dokonalého snímku. Musíme však mít minimální hodnotu
proudu ve svazku, abychom nezvyšovali šum detektoru. Následující obrázky 40a) až 40d) porovnávají
různé hodnoty urychlovacího napětí v závislosti na prokreslení detailů vzorku.
..
.
Obrázek 40: Prokreslení detailů biologického vzorku při různých hodnotách urychlovacího napětí.
Nesprávná volba urychlovacího napětí u skenovacího elektronového mikroskopu
Při charakterizaci vzorků pomocí skenovací elektronové mikroskopie je špatná volba urychlovacího napětí
jedním z nejčastějších problémů. V případě nevodivých vzorků (pokud nejsou pokoveny) je třeba volit
nízká napětí (0,5−1,5 kV). Pokud by bylo nastaveno vyšší napětí, docházelo by ke značnému hromadění
elektronů v preparátu a jeho nabíjení (viz kap. 11.1). To se projevuje deformacemi měřeného vzorku a
ztrátou ostrosti obrazu. Na snímcích se nabíjení preparátu projevuje světlými plochami (obr. 41), které
zcela znehodnocují snímek.
25
..
.
Obrázek 41: Zobrazení chrupavky v SEM s efektem nabíjení.
Při pozorování některých nevodivých vzorků v režimu sekundárních elektronů při urychlovacích napětích
do 3 kV je možné pozorovat zajímavý jev. Místo obrazu pozorovaného preparátu bylo sekundárními
elektrony vytvořeno tzv. „zrcadlení detektorů“ (obr. 42). Jev zrcadlení lze vysvětlit následujícím způsobem.
V analyzovaném preparátu se hromadí elektrony, které díky špatné vodivosti vzorku nejsou z preparátu
odváděny. Ty poté vytvoří natolik silnou bariéru, že další dopadající primární elektrony se pouze odpudí
od preparátu a dopadají na vnitřní stěny mikroskopu, kde vybudí sekundární emisi. Vzorek se tedy stává
v podstatě zrcadlem.
..
.
Obrázek 42: Zrcadlení preparátové komory SEM.
9. Environmentální skenovací elektronová mikroskopie
Environmentální skenovací elektronová mikroskopie (eSEM) představuje jeden z vývojových trendů
v elektronmikroskopických metodách. Umožňuje zkoumání vzorků živé i neživé přírody v podmínkách
vysokého tlaku plynů až 3 kPa, ve kterých se nejen povrch nevodivého preparátu nenabíjí, ale dokonce
lze uchránit vlhký vzorek před vyschnutím. Přístroje eSEM přitom umožňují pracovat i ve vakuu pod
10−3
Pa, odpovídajícímu podmínkám pozorování v klasickém skenovacím elektronovém mikroskopu.
Je-li tlak plynů v komoře vzorku eSEM vyšší než přibližně 200 Pa, dochází k ionizačním srážkám primárních
i signálních elektronů s atomy a molekulami plynů v okolí preparátu a vzniklé ionty kompenzují
nabíjení vzorku dopadajícími elektrony. Tento proces umožňuje pozorování elektricky nevodivých vzorků
bez nutnosti pokrytí jejich povrchu elektricky vodivou vrstvou. Je-li v komoře vzorku tlak plynů, nejlépe
vodních par, vyšší než 611 Pa (při teplotě 0 °C), lze pozorovat objekty obsahující menší či větší množství
vody bez vyschnutí a zborcení jejich struktury.
9.1. Možnosti eSEM
• Studium detailů struktury povrchů vodivých i nevodivých vzorků pocházejících z živé i neživé přírody
o rozměrech nanometrů až milimetrů.
• Studium vlhkých vzorků a vzorků na fázovém rozhraní skupenství (procesy kondenzace, vypařování,
tání, tuhnutí, atd.)
• Studium vzorků v podmínkách mechanického i tepelného namáhání v prostředí vakua, nebo různých
druhů plynů s volitelnou vlhkostí.
• Studium materiálového, topografického, popř. napěťového kontrastu (umožňujícího zobrazit nahromadění
a rozložení elektrického náboje, například na hradlech tranzistorů).
• Studium reakcí různých chemických látek v komoře vzorku mikroskopu.
26
• Studium chemicky agresivních látek, například bateriových hmot.
• Studium různých druhů vzorků v podmínkách blížících se atmosférickému tlaku.
..
.
Obrázek 43: Speciální tlakové clonky oddělující prostor tubusu s vysokým vakuem a prostor preparátové komory
s nízkým vakuem (až s atmosférickým tlakem).
eSEM mikroskop musí mít v tubusu stejně vysoké vakuum, jako ostatní elektronové mikroskopy.
Prostor preparátové komory, kde je vakuum nízké, je odděleno speciální tlakovou clonkou (obr. 43). Detektory,
které jsou v eSEM využívány, tolerují přirozené prostředí preparátu (proto také environmentální
mikroskopy). Nejsou citlivé na světlo a teplo a umožňují zvýšení účinnosti detekce. Z obr. 44 vyplývá,
že dochází k ionizaci plynu uvolněnými elektrony ze vzorku. Ionizovaný plyn nejenže kladnými ionty
potlačuje nabíjení preparátu, ale při ionizaci dochází k vyšší tvorbě elektronů, které zvyšují účinek detekce.
Následující snímky na obr. 45 ukazují některé z mnoha aplikací, které by nebylo možné realizovat
v klasickém SEM.
..
.
Obrázek 44: Schematické znázornění ionizačních procesů v eSEM po dopadu primárních elektronů na vzorek.
..
.
Obrázek 45: Příklady aplikací eSEM: zleva rozpouštění krystalů NaCl, kapky vody na lidském vlase a živá mšice.
10. Příprava vzorků pro TEM
Hlavním cílem přípravy vzorku jak pro TEM, tak i pro SEM, je získat reprodukovatelným způsobem
přesnou morfologickou informaci o preparátu a maximálním způsobem potlačit jakékoli artefakty v jeho
objemu.
27
Pro zachycení ultratenkých řezů, replik povrchu nebo suspenze buněk nebo částic se používá tenká
fólie, transparentní pro elektrony. Podmínkou je, aby byla stabilní vůči urychleným elektronům a měla
nízkou zrnitost. Z důvodu eliminace absorpce elektronů ve fólii musí mít tloušťku kolem 20 nm. Nejvíce
se používají uhlíkové a plastové fólie. Uhlíkové mají často otvory, aby pozorované struktury nebyly
ovlivněny uhlíkovou vrstvou (holey carbon – obr. 46). Jako plastová fólie se používá Formvar ředěný
v etylendichloridu o koncentraci menší než 0,5 %). Příprava plastové fólie je snadná, uhlíkové vrstvy je
možné připravovat napařováním. V dnešní době je možné zakoupit uhlíkové fólie, nanesené přímo na
podložní síťku.
..
.
Obrázek 46: Holey carbon fólie.
Síťka pro TEM představuje pevnou podporu pro fólie a ultratenké řezy nebo suspenze částic. Bývá
vyrobena z mědi, která je diamagnetickým materiálem, neovlivňujícím procházející elektrony. Síťky se
liší procentem otevřené plochy a perioda síťování se označuje v čarách na palec (obr. 47).
..
.
Obrázek 47: Podložní síťka s označením Mesh 100 a Mesh 300 (čar/palec).
Postup nanesení fólie na síťku je znázorněn na obr. 48:
a – sklíčko ponořit do roztoku s Formvarem,
b – vysušit v bezprašném prostředí,
c – fólii splavit na hladinu vody,
d – podložní síťku dát na proužek papíru, ponořit pod fólii a vytáhnout.
..
.
Obrázek 48: Postup nanesení formvarové fólie na síťku.
10.1. Ultratenké řezy
Vrstvou biologického preparátu o tloušťce 100 nm, který má měrnou hmotnost ρ = 1 000 kg.m−3
,
prochází při urychlovacím napětí 50 kV přibližně 50 % elektronů. Z toho vyplývá, že není možné pozorovat
celé buňky. Obvyklá tloušťka tenkého řezu je kolem 50 nm. Silnější preparáty by snižovaly penetrační
schopnosti elektronů. V případě, že projdou, ztratí rychlost, a to zvýší chromatickou aberaci a ztíží
28
zaostření pozorovaného preparátu. Vzorky pro transmisní i skenovací elektronovou mikroskopii nesmí
obsahovat vodu, protože v mikroskopu jsou vystaveny vysokému vakuu a v něm by mokré vzorky okamžitě
zmrzly a při sublimaci ledu by se deformovaly. Předtím však musí být biologický preparát fixován, aby
byla věrně reprodukována jeho ultrastruktura. Z toho je patrné, že pro samotné vytváření ultratenkých
řezů musí být tkáň speciálně připravena. Kompletní příprava zahrnuje odběr tkáně nebo buněk, fixaci
preparátu, odvodnění, kontrastování, zalití do bločku a teprve potom následuje krájení na ultramikrotomu.
Obecně existují dva způsoby jak připravit vzorky pro TEM:
1. Do mikroskopu přímo vkládáme celý studovaný objekt, připravený podle obvyklých pravidel. Jedná
se buď o suspenze virů, bakterií nebo izolovaných buněčných organel, které můžeme v mikroskopu
pozorovat celé, nebo z větších vzorků jsou připraveny ultratenké řezy.
2. Druhý způsob představuje nepřímé pozorování ultrastruktury, kdy v mikroskopu pozorujeme repliku
(otisk) studovaného objektu, nikoliv samotný objekt.
10.2. Fixace
Prvním krokem přípravy preparátů pro TEM je fixace. Jejím cílem je zachovat buněčnou ultrastrukturu
s minimem změn oproti nativnímu stavu, zabránit degradačním procesům a stabilizovat vzorek pro další
kroky přípravy. K fixaci biologických objektů se používají chemické nebo fyzikální metody. Je důležité
si uvědomit, že zatím neexistuje univerzální fixační postup, který by byl vhodný pro všechny typy tkání
a buněk. Stanovení vhodného postupu je třeba pro každý vzorek hledat experimentálně, přičemž na
začátku je možné vycházet ze všeobecně platných zásad.
Chemická fixace je založena na reakci některých chemických činidel se složkami biologických objektů,
které vedou k jejich stabilizaci a imobilizaci bez větších ultrastrukturálních změn. Chemická fixační
činidla se dělí do skupin koagulátorů a nekoagulátorů. Koagulátory denaturují proteiny a způsobují jejich
precipitaci. Jelikož při tomto typu fixace nevznikají žádné vazby mezi různými molekulami, označuje
se také jako neaditivní. Mezi tato fixační činidla patří např. metanol, etanol nebo kyselina chlorovodíková.
Nekoagulátory fixují tak, že dochází k přeměně cytoplasmy v gel transparentní pro elektrony.
Často se označuje také jako aditivní fixace a z hlediska elektronové mikroskopie nejlépe zachovává buněčnou
ultrastrukturu. Příkladem tohoto typu fixačních činidel jsou glutaraldehyd, oxid osmičelý, nebo
manganistan draselný.
Kvalitu fixace však ovlivňuje celá řada faktorů, z nichž uveďme ty nejdůležitější: výběr fixačního činidla,
velikost vzorku, způsob fixace, koncentrace a rychlost penetrace fixačního činidla, teplota, osmolalita a
pH fixačního roztoku, délka fixace, přídavky dalších látek ovlivňujících průběh fixace.
Tyto faktory se ovlivňují navzájem a v mnoha případech je třeba volit určité kompromisy. Např. teplota
ovlivňuje rychlost difúze fixačního činidla a tím i dobu fixace. Penetrační rychlost je ovlivněna velikostí
preparátu apod. V následujícím textu zmíníme jen některé typické příklady fixačních roztoků a uvedeme,
pro které typy preparátů jsou vhodné.
Osmium tetroxid (OsO₄) Dobře reaguje s lipidy a fosfolipidy, stabilizuje buněčné proteiny formující
cytoplasmu, naopak špatně fixuje karbohydráty (glykogen) a nukleové kyseliny.
Doba fixace se pohybuje od 30 do 90 minut. Krátký čas vede k nedostatečné fixaci, dlouhý čas může
zase vést až k rozpadnutí tkáně. OsO₄ penetruje do tkáně pomaleji z důvodu pomalé difúze velkých
molekul. V případě OsO₄ obvykle urychluje fixaci vyšší teplota a pomocí pufrů se udržují roztoky při pH
blízkém 7.
Aldehydy Pro přípravu preparátů v elektronové mikroskopii jsou z této skupiny nejpoužívanější formaldehyd
a glutaraldehyd. Dobře fixují bílkoviny, cytoplasmu a lysosomy. Špatně stabilizují v buňkách
lipidy, což se dá napravit osmiovou postfixací. Glutaraldehyd má relativně malou viskozitu (Mm =
100,12 g/mol). V koncentracích 1–6 % se většinou mísí s kakodylanovým pufrem o pH 7,2. Rychle penetruje
do tkání a buněk. Mírná deformace buněk se dá odstranit manganistanovou fixací.
Manganistanové fixace Používají se zejména pro fixaci rostlinných pletiv a buněk. Dobře fixují chlorofyl,
výborně fixují cytoplasmatické membrány a struktury obsahující lipidy a lipoproteiny. Nevýhodou
manganistanové fixace je, že po ní mizí ribozomy a rušivě působí také granulace, která se však dá odstranit
předfixací glutaraldehydem, případně použitím acetonu místo etanolu při odvodnění. Doba fixace
se pohybuje od 15 do 50 minut, teplota ani pufr nejsou rozhodující. Podle některých autorů pufrované i
nepufrované roztoky dávají stejné výsledky.
29
10.3. Podmínky fixace
Jak již bylo uvedeno, výsledek fixace je závislý na celé řadě faktorů. Pokusme se shrnout nejdůležitější
z nich. S výjimkou manganistanu draselného, který se užívá rozpuštěný v redestilované vodě, všechny
ostatní fixační činidla se aplikují rozpuštěné v pufrovacích roztocích. Důvodem je, aby se fixační roztok co
nejvíce blížil svými vlastnostmi (pH, teplota, osmolalita apod.), prostředí, ve kterém se vzorek nacházel
do chvíle odebrání a nedošlo k reakci fixovaného objektu na změnu vnějšího prostředí, která by mohla
vést k jeho poškození, např. smrštění fixovaných buněk.
Koncentrace fixačního činidla závisí na druhu fixovaných objektů a způsobu fixace. Pro glutaraldehyd
se doporučují koncentrace v intervalu 1–3 % v případě izolovaných buněk a perfúzní fixace, 3–6 % pro tkáně
a imerzní fixaci. Podobná doporučení platí i pro formaldehyd. U OsO₄ se doporučuje koncentrace 1–2 %
a to jak pro primární fixaci, tak pro postfixaci.
pH fixačního roztoku závisí na typu fixovaného vzorku. Průměrné pH extracelulární kapaliny člověka
je blízké hodnotě 7,4, oproti tomu pH intracelulární kapaliny kolísá v rozmezí 6,0–7,5. Doporučovaná
hodnota pH fixačního roztoku se pohybuje v intervalu 6,7–7,1. V této oblasti se dá očekávat dobrá reaktivita
glutaraldehydu a rovněž i stabilita roztoku OsO₄. K udržení pH ve zvoleném intervalu se používají
tlumící roztoky. Nepufrované aldehydické roztoky způsobují pouze malou změnu intracelulárního pH,
naproti tomu v případě roztoků OsO₄ může pH klesnout na hodnotu mezi 2 a 3 a použití nepufrovaných
roztoků nepřipadá v úvahu.
Vlastnosti pufrů – na pufry používané v elektronové mikroskopii jsou kladeny vysoké nároky. Kromě
dostatečné tlumící kapacity by měly být chemicky stabilní a odolné proti degradaci enzymy a jinými
biologicky aktivními látkami, neměly by být cytotoxické, neměly by disociovat a uvolňovat fyziologicky
účinné ionty vápníku, draslíku, sodíku apod., neměly by tvořit precipitáty, interferovat s fixačním činidlem,
inhibovat nebo naopak stimulovat buněčné funkce atd. Z celé velké škály tlumících roztoků nenajdeme
ani jeden, který by beze zbytku splňoval uvedená kritéria. Mezi nejpoužívanější v současné době patří
fosfátový a kakodylanový pufr a pufry označované zkratkami TRIS, PIPES, HEPES apod., které jsou
většinou organickými deriváty aminokyselin. Mezi přednosti uvedeného seznamu pufrů patří především
nízký stupeň toxicity, kompatibilita s fyziologickými funkcemi buněk, snížení extrakce lipidů, proteinů a
dalších buněčných komponent v průběhu zpracování materiálu.
Přídavky jiných látek – některé látky svojí přítomností ve fixačním roztoku selektivně fixují určité
organely, některé ovlivňují reaktivitu fixačního činidla, rychlost jeho pronikání do tkáně apod., čímž
ovlivňují výsledky fixace (peroxid vodíku, Saponín, dimetylsulfoxid, Tanín, ferokyanid draselný).
Osmotické vlastnosti fixačního roztoku – buňky obsahují velké množství intracelulárních roztoků, které
jsou uzavřeny a navzájem od sebe odděleny semipermeabilními membránami. Vně buněk jsou extracelulární
kapaliny a v živém organismu membrány fungují jako selektivní bariéry a propouštějí do tohoto
vyrovnaného systému jen některé látky a vodu. Pohyb vody přes semipermeabilní membrány je dán
rozdílem koncentrací roztoků, které odděluje, a sice ze strany nižší koncentrace roztoku směrem k vyšší,
který zřeďuje. Čím je rozdíl koncentrací vyšší, tím větší je tlak vody na membránu. Tento tlak se označuje
jako osmotický a udává hydrostatický tlak, který by bylo třeba vyvinout na straně koncentrovanějšího
roztoku, aby se zabránilo proudění vody do něj. Při fixaci je důležité, aby vzorky po ponoření do fixačního
roztoku nebyly vystaveny velké změně osmotického tlaku, aby nepřijímaly vodu ani ji neuvolňovaly, což
by mělo za následek velkou objemovou změnu buněk. Roztoky, ve kterých dochází ke zvětšení objemu
buněk se označují jako hypotonické, opačně působí hypertonické roztoky. Ideální jsou izotonické roztoky,
které nevyvolávají objemové změny. Právě takovými by měly být fixační roztoky. Tlak elektrolytů
je vždy vyšší než neelektrolytů, protože jejich molekuly disociují na více částí. Proto 0,16M roztok NaCl
má např. stejnou osmolalitu jako 0,3M roztok glukózy. Při stanovení optimálních osmotických vlastností
se většinou vychází z osmotické koncentrace lidského séra, která je asi 300 mOsm/kg. Při fixaci je výhodné
fixovat mírně hypotonickým roztokem, aby obsah fixační látky proudil dovnitř buněk. Membrány
si však při fixaci glutaraldehydem dlouho zachovávají své semipermeabilní vlastnosti a glutaraldehyd
nepatří k látkám, které by ochotně pouštěly dovnitř buněk. Často zůstávají buňky osmoticky aktivní i po
fixaci GA a při použití vypíracího roztoku s nevhodnými osmotickými vlastnostmi může stále dojít k jejich
poškození.
Při určování osmotické koncentrace fixačního roztoku je třeba stanovit tzv. účinnou osmolalitu, která
se může lišit od celkové, např. GA v koncentraci 2–6 % není osmoticky aktivní. OsO₄ naproti tomu okamžitě
ničí semipermeabilní vlastnosti membrán a v tomto případě se účinná osmotická koncentrace rovná
celkové, včetně podílu OsO₄.
Snížení osmolality roztoku lze docílit přidáním vody, zvýšení přídavkem glukózy a sacharózy nebo
kationtů (K+
, Na+
, Mg2+
, Ca2+
). Výsledný vzhled ultrastruktury vypoví, zda měl fixační roztok správnou
osmolalitu. Scvrknuté buňky a buněčné organely byly fixovány hypertonickým roztokem, zvětšené
30
buňky a organely, kulatá jádra hypotonickým roztokem. Nejcitlivěji reagují na nevhodnou osmotickou
koncentraci mitochondrie.
Teplota fixačního roztoku – na jedné straně do značné míry ovlivňuje penetrační rychlost fixačního
činidla a na druhé straně rychlost autodegradačních a autolytických procesů ve fixovaném materiálu.
Zatímco pro pronikání fixačního roztoku do buněk je vhodnější vyšší teplota, pro zbrzdění autodegradačních
procesů teplota nižší. Na určení vhodné teploty má vliv celá řada faktorů, především způsob fixace,
např. při perfúzní fixaci je vhodné upravit teplotu na hodnotu živého organismu. Určení konkrétní teploty
fixačního roztoku je vždycky kompromisem mezi několika faktory.
Doba fixace – závisí na velikosti fixovaného materiálu, teplotě fixačního roztoku, jeho složení, způsobu
fixace atd. Obecně neplatí, že čím déle fixujeme, tím lepší výsledky, neboť proteiny změněné na gel reakcí
s glutaraldehydem po čase kapalní a potom jsou odplaveny během dalších kroků přípravy. Bylo změřeno,
že průměrná rychlost penetrace fixačních roztoků při pokojové teplotě je 0,2 až 0,34 mm/hod. Při imerzní
fixaci vzorku o velikosti 1 mm³ pronikne fixační roztok do jeho středu za 1,5 až 2,5 hod. Při celkové délce
fixace 3 hod jsou však buňky ve středu vzorku fixované pouze za 30 min, zatímco na povrchu 3 hod. Při
pokusech stanovit optimální délku fixace se ukázalo, že na imobilizaci pohybu v rostlinné cytoplazmě
potřeboval glutaraldehyd 15–20 min, formaldehyd 30 min a akrolein 6 min.
Množství fixačního roztoku a promíchávání – závisí především na způsobu fixace. Při imerzní fixaci
se doporučuje, aby objem roztoku byl asi 1000krát vyšší než objem fixovaného vzorku, aby byl zajištěn
dostatek fixačního činidla. Tedy na fixaci 5 kusů vzorku o objemu 1 mm³ by se mělo použít asi 5 ml
roztoku. Při perfúzní fixaci bývá objem spotřebovaného fixačního roztoku ještě vyšší. Stejně důležité je i
jemné promíchávání při fixaci, aby se podpořila penetrace fixačního roztoku do vzorku.
Způsob fixace – je většinou nejvíce ovlivněn účelem pokusu. Nejběžnějším, nejjednodušším a nejčastěji
používaným způsobem je imerzní fixace spočívající v ponoření získaného materiálu do fixačního
roztoku. V případě citlivých tkání, např. jaterní, je však tento způsob pomalý a v ultrastruktuře je již
možno pozorovat poškození způsobené degradačními procesy. Perfúzní způsob fixace je možné použít
při experimentu na pokusném zvířeti, kterému se v celkové anestézii vstřikuje fixační roztok přímo do
krevního řečiště. Dalším způsobem je možnost předfixovat tkáň určenou k odebrání pomocí injekce s fixačním
roztokem, nebo opět při celkové anestézii obnažit hledaný orgán a nakapat na něj fixační roztok
a teprve poté odebrat kousky tkáně. V případě vzorků tkání ze živého člověka získaných biopsií připadá
v úvahu pouze imerzní fixace, tedy co nejrychlejší ponoření získaných vzorků do fixačního roztoku. Pro
vzorky určené pro transmisní elektronovou mikroskopii platí, že by neměly přesahovat velikost 1 mm³.
Často bývá problém s fixací izolovaných buněk v suspenzi, které je nutno pro jednodušší manipulaci zalít
do agaru. Pokud je počet buněk v suspenzi nízký, je třeba je zkoncentrovat filtrací přes membránový filtr,
filtr rozstříhat na malé kousky a pracovat s nimi jako s kousky excize. Pouze při odvodňování a zalévání
je třeba zajistit, aby se v některém kroku filtr nerozpustil.
Z uvedeného stručného přehledu vyplývá rozmanitost postupů používaných k fixaci, které odráží
variabilitu připravovaných preparátů.
10.4. Odvodnění
Úkolem je nahrazení volné vody ve vzorku odvodňujícím činidlem (etylalkohol, metylakohol, isopropylalkohol,
aceton). Nejčastěji se jako dehydratační činidla používají etanol a aceton.
Etanol je nejběžnější dehydratační činidlo, jehož nevýhodou je možnost reakce se zbytky OsO₄ za
vzniku drobných hustších precipitátů. Udává se, že způsobuje menší extrakci buněčného materiálu než
aceton. Není přímo mísitelný s epoxidovými a polyesterovými pryskyřicemi, kde se z tohoto důvodu musí
použít jako mezistupně např. propylenoxid.
Aceton je druhé nejčastěji používané dehydratační činidlo. Přičítá se mu větší extrakce buněčného
materiálu, hlavně lipidů, na druhé straně je přímo mísitelný se všemi používanými pryskyřicemi. Způsobuje
menší scvrkávání vzorku než etanol.
Obvykle se acetonem nebo etanolem odvodňuje tak, že vzorek prochází řadou roztoků o stoupající
koncentraci – 30, 50, 70, 80, 90, 95, 100 %, ve kterých je podle typu a velikosti ponecháván 5 až 10 min.
Protože komerčně dodávaný čistý etanol i aceton obsahují vodu, je třeba je vysušit přidáním bezvodého
síranu mědnatého nebo chloridu vápenatého.
Dehydratace bývá považována za zdroj řady artefaktů. Po nekvalitní fixaci dochází k extrakci proteinů,
lipidů, sacharidů atd. Objemové změny mohou dosáhnout až 40 %. Kromě toho vzniká řada precipitátů.
Infiltrace je postupné prosycení preparátu pryskyřicí. V praxi se provádí tak, že vzorek projde řadou
roztoků pryskyřice v dehydratačním médiu s rostoucí koncentrací pryskyřice. V případě zalévacích médií
s vyšší viskozitou nebo málo prostupného vzorku je možné zvýšit účinnost prosycení mikrovlnami nebo
změnou tlaku.
31
10.5. Zalévání
Existují obecně dva způsoby zalévání preparátů. Plošné zalévání se používá v případě, kdy je vzorek
třeba orientovat, aby oblast, kterou chceme připravit pro prohlížení, ležela co nejblíže řezné roviny
bločku. Zalévání do kapslí je vhodné v případě suspenzí nebo jiného materiálu, kdy nezáleží na jeho
orientaci. Ideální zalévací hmota by měla mít následující vlastnosti:
• rozpustnost v etanolu nebo acetonu před polymerizací,
• neměla by chemicky ovlivňovat vzorek,
• nezpůsobovat pnutí ve vzorku.
• Měla by být homogenně tuhá, ale dostatečně plastická a
• stabilní při ozařování elektronovým paprskem.
Při zalévání preparátů pro imunoznačení, z důvodu minimalizace extrakce, agregace a přemístění buněčných
komponent se používá nízkoteplotní zalévání.
Zalévací hmoty Zalévání do parafínu např. neumožňuje pořídit řezy pod 1 µm, protože je příliš měkký.
Z běžnějších zalévacích hmot, používaných pro elektronovou mikroskopii, se používají následující hmoty.
Uveďme rovněž jejich přednosti i nevýhody.
Metakryláty Poskytují rychlou penetraci do tkáně a snadné pořizování řezů o tloušťce 50 až 100 nm.
Správná tuhost je dosažena vhodnou směsí metylmetakrylátu a n-butyl metakrylátového monomeru.
Jejich nevýhodou je, že až o 20 % se sníží objem při polymerizaci, což vede ke vzniku artefaktů
a nestabilitě řezů po prozáření elektrony.
Hmoty rozpustné ve vodě se používají bezprostředně po fixaci. Glykol metakrylát (2-hydroxyetyl metakrylát)
má tendenci se rozpínat pod vlivem elektronů. V této skupině je patrně nejpoužívanější
hmota s komerčním označením Durcupan.
Polyesterové pryskyřice – Vestopal W poskytuje dobrou stabilitu v elektronovém svazku, nevýhoda je
vysoká viskozita a mísitelnost s etanolem.
Epoxidové pryskyřice – vytvrzují se teplem 60 °C (termoset) po dobu 48 hod. Jsou odolné proti teplu a
rozpouštědlům a po polymerizaci nejsou patrná žádná poškození. Řezací vlastnosti jsou závislé na
poměru složek směsi pryskyřicového monomeru (epoxidová pryskyřice, tužidlo, katalyzátor, změkčovadlo).
Mezi tyto látky patří Araldit, Epon 812 (velmi často užívaný), DER–334.
Polymerizace Existuje několik způsobů, jak nastartovat polymerizaci zalévacího média:
1. Teplem při teplotách do 60 °C. Tento způsob je obvyklý především u epoxidových pryskyřic. Dochází
při něm však k značnému snížení imunoreaktivity vzorku.
2. Ozářením UV zářením lze nastartovat polymerizaci především u akrylátových pryskyřic v teplotním
intervalu od pokojové teploty dolů.
3. Přidáním chemického katalyzátoru nebo iniciátoru polymerizace. Ten bývá kombinován s dodáním
energie UV zářením nebo tepla.
Postup při zalévání do bločku Dehydratační činidlo v posledním kroku odvodnění je nahrazeno směsí
(50 : 50) dehydratačního činidla a epoxidové pryskyřice. Následuje infiltrace ve 100% roztoku pryskyřice.
Bloček tkáně je přenesen na dno želatinové kapsle a zalit zalévací hmotou. Nakonec se provede ořezání
bločku do tvaru komolého jehlanu, přičemž ploška ploška by měla mít velikost 0,5 mm. Postup při ořezání
bločku je naznačen na obr. 49.
32
..
.
Obrázek 49: Postup při ořezání bločku.
10.6. Ultramikrotomie
Pro reprodukovatelnost ultratenkých řezů je nutné splnit některé podmínky. Všechny pohyby musí
být bez vibrací, příslušné mechanismy musí mít minimální tření, tyč s držákem vzorku musí zajistit
tloušťku řezu k hodnotě 10 nm a po provedení řezu musí utlumit rázy způsobené řezáním. Ultramikrotomy
většinou k posuvu bločku k hraně nože využívají tepelné dilatace měděné tyče. Jiné ultramikrotomy jsou
konstruovány s mechanickým posunem. Předností termodilatačního ultramikrotomu je schopnost krájet
i velmi tvrdé materiály, mechanický ultramikrotom je naopak velmi stabilní v tloušťce ultratenkých řezů.
Výhody obou výrobci spojili u kombinovaných typů. Schéma ultramikrotomu, ze kterého je zřejmé, že
v jeho pohyblivém vahadlu je umístěn bloček, který je přibližován k řezné hraně nože, upevněného ve
stolku proti němu, je na obr. 50.
..
.
Obrázek 50: Pozice nože proti bločku ve výkyvném držáku.
10.7. Nože
Nutné vlastnosti nožů pro dosažení kvalitních řezů:
1. poloměr křivosti hrany nože musí být menší než je nejmenší požadovaná tloušťka řezu,
2. tvrdost a tuhost nože musí odolávat nárazům bločku se vzorkem,
3. odolnost vůči chemickému rozkladu,
4. homogenita materiálu nože podél jeho hrany,
5. fyzikální stabilita při pokojové teplotě.
Diamantové nože jsou odolné, ale poměrně drahé, skleněné nože jsou křehké pro tvrdé tkáně (kosti),
ale levné. Skleněné nože se připravují lomem ze čtvercové destičky speciálními zařízeními (knife maker,
obr. 51), která dávají reprodukovatelné výsledky (délka, pozice hrany, působiště ohybové síly a její
velikost).
Před krájením je třeba u řezné hrany vytvořit vaničku (obr. 52), do které se napustí voda, na jejíž
hladinu se splavují po skrojení ultratenké řezy. Vanička vznikne nalepením stříbrné pásky nebo plastového
přípravku a utěsní se (např. lakem na nehty). Kvalitu nožů hned po lámání určíme podle velikosti
33
..
.
Obrázek 51: Knife maker – přípravek pro lámání skleněných desek pro výrobu skleněných nožů.
protiplošky, která by u nožů pro ultratenké krájení měla být menší než 0,2 mm. Další chyby lze odhalit
ve stereomikroskopu ultramikrotomu při vhodném osvětlení suchého nože. Připravené skleněné nože
skladujeme na suchém a bezprašném místě.
..
.
Obrázek 52: Vanička na skleněném noži (postup přípravy, reálný pohled, splavování řezů na vodní hladinu).
Diamantový nůž poskytuje výrazně kvalitnější ultratenké řezy (obr. 53). Z důvodu vysoké ceny diamantových
nožů se většinou bločky předřezají na skleněném noži a diamantový nůž se použije až na
ultratenké řezání. Hlavním problémem při použití diamantového nože je jeho čištění a hydrofobnost,
takže občas je problematické dostat hladinu ve vaničce k řezné hraně. Pokud na hraně nezůstaly zbytky
pryskyřice, stačí nůž opláchnout proudem čisté vody nebo s přídavkem saponátu. Zbytky pryskyřice
je možné odstranit přejetím hrany polystyrenovou tyčinkou namočenou v etanolu nebo ve speciálních
přístrojích určených pro mytí diamantového nože. Na diamantové nože pro kryoaplikace se kladou ještě
vyšší nároky.
..
.
Obrázek 53: Diamantové nože pro klasické preparáty a pro kryořezy.
10.8. Kvalita řezu
Kvalita ultratenkého řezu závisí na kvalitě nože, především jeho ostrosti, dobře připraveném bločku,
který umožňuje pravidelné řezání a na kvalitě ultramikrotomu, zejména s ohledem na tlumení vibrací
atd. Při řezání je řezaná tkáň stlačována a není-li dostatečně homogenní zalévací médium, není rovná
řezná hrana nože, či vznikají-li vibrace tyče ultramikrotomu, není možné získat kvalitní ultratenký řez.
Na obr. 54 je patrné, k jakým změnám dochází ve tkáni při řezání, na obr. 55 je znázorněn vliv špatného
ořezání bločku a na obr. 56 je vidět projev špatného tlumení vibrací a vznik odpovídajícího artefaktu.
34
..
.
Obrázek 54: Působení sil při řezání tkáně.
..
.
Obrázek 55: Chybný sklon ořezaného bločku.
..
.
Obrázek 56: Vibrace při řezání na ultramikrotomu a jejich projev při zobrazení tkáně.
10.9. Kontrastování
Kontrastování se provádí proto, aby těžké kovy zvýšily kontrast vzorku při prozařování elektronovými
svazky. Používá se uranylacetát, kyselina fosfowolframová, citrát olova, KMnO₄. Způsob, který se používá
nejvíce, je selektivní adsorpce těžkých kovů na buněčné organely. Těžké kovy více rozptylují primární
elektrony a zvyšují tak kontrast struktur, na které se adsorbovaly. K prvnímu kontrastování dochází
již při fixaci OsO₄. V ostatních případech se řezy kontrastují buď před zalitím, nebo po nakrájení na
ultratenké řezy přímo na síťkách. Kontrastování vzorku v bloku se provádí buď okamžitě po fixaci, nebo
při odvodňování. Ve srovnání s kontrastováním ultratenkých řezů nemají vzorky kontrastované v bloku
takový kontrast a ostrost. Při kontrastování ultratenkých řezů se nejčastěji používá octan uranylu a
citrát olova. Octan uranylu reaguje především s nukleovými kyselinami, ale také s proteiny. Citrát olova
zvyšuje obecně kontrast membrán, proteinů, nukleových kyselin a glykogenu. Pokud se ke kontrastování
použijí postupně obě látky, vzorek získá rovnoměrný kontrast všech buněčných struktur.
10.10. Značení koloidním zlatem (imunohistochemické metody)
Pro pozorování specifických struktur buněk a tkání lze použít úpravu preparátu, založenou na značení
pomocí protilátek. V tomto případě jsou na sekundární protilátky navázány velmi malé (obvykle 5 až
15 nm) koloidní zlaté částice. Protože jsou tyto částice elektrodensní, jeví se v elektronovém mikroskopu
jako tmavé tečky (obr. 57).
10.11. Repliky
Jak již bylo uvedeno, vzorky silnější než 0,1 µm nemohou být v TEM studovány z důvodu absorpce a
rozptylu elektronů v látce. Zejména u kovů, které není možné připravit v podobě tenkého řezu, bylo nutné
najít způsob, jak zajistit otisk povrchu. Metody vytváření replik se dnes používá zejména v kombinaci
s metodami mrazového leptání.
35
..
.
Obrázek 57: Buňky K562 fixované aldehydem a před zalitím (Epon) značené koloidním zlatem (velikost částic 15 nm).
Repliky se dělí na jednostupňové a dvoustupňové, pozitivní a negativní. Jednostupňový pozitivní otisk
se utvoří tak, že objekt se ve vakuu nejprve šikmo nastínuje kovem a pak se na něj kolmo napaří silnější
krycí vrstva uhlíku. Replika se potom splaví nebo sejme pomocí plastické hmoty. Jednostupňový negativní
otisk se připraví tak, že se na objekt kolmo napaří ve vakuu vrstva uhlíku a stínuje se až sejmutá replika
(obr. 58). Není-li možné repliku jednoduše sejmout, musí se snímat jednostupňový otisk pomocí podpůrné
vrstvy plastické hmoty, která se nechá zaschnout, potom se plastická hmota strhne pomocí samolepicí
pásky, a ta se rozpustí v acetonu (obr. 59). Dvoustupňový negativní otisk vznikne, pokud se na objekt
nanese dostatečné množství výše zmíněných roztoků kolodia nebo formvaru a po zaschnutí se první
stupeň repliky sejme pomocí samolepicí pásky. Na otiskovou stranu se napaří ve vakuu vrstva uhlíku a
tato uhlíková vrstva se šikmo nastínuje kovem. V závěru se rozpustí samolepicí páska i plastická hmota.
U pozitivního dvoustupňového otisku se po sejmutí repliky nejprve otisková strana postínuje kovem a
pak se na ni napaří vrstva uhlíku (obr. 60). Ve všech případech tloušťka repliky nesmí přesáhnout 20 nm.
..
.
Obrázek 58: Tvorba negativní repliky: nanesení plastického (nebo C) filmu, sloupnutí a stínování.
..
.
Obrázek 59: Způsob vytváření replik: a) rozpuštěním vzorku a b) odtržením z povrchu a odstraněním pásky.
..
.
Obrázek 60: Příprava pozitivní repliky.
10.12. Stínování těžkými kovy
Ke zvýraznění povrchové topografie ultratenkého řezu nebo repliky se používají „těžké“ kovy, které se
napařují na povrch kovu ze strany (obr. 61). Kovy musí mít vysokou hustotu a musí být inertní vzhledem
k chemickým vlivům a teplotě. Používají se Au, Pd, Cr, Ni, Ge, Pt, U. Nevýhodou Cr je, že pod 5 nm
vykazuje granularitu. Slitina Pt a Pd (v poměru 3 : 1) je vhodnější než čistá platina. Tloušťka stínované
vrstvy je 0,3–1,5 nm. Na obr. 62 jsou latexové kuličky stínované zlatem a slitinou zlata a paladia.
10.13. Metody mrazového sušení, lomu a odpařování
Kromě chemické fixace lze pro TEM připravit vhodné preparáty z biologických objektů i za použití
fyzikálních postupů, tedy nejčastěji prudkým snížením teploty. Jejich předností je, že zachovají preparát
36
..
.
Obrázek 61: Princip stínování.
..
.
Obrázek 62: Latexové kuličky (0,3 µm) stínované a) Au, b) Au–Pd.
co nejblíže nativnímu stavu. Pro tyto metody existuje řada přístrojů, které umožňují biologické objekty
zmrazovat, krájet, sušit atd.
Mrazová fixace využívá toho, že většina živých organismů obsahuje více než 70 % vody nerovnoměrně
rozdělené do membránami ohraničených oblastí. Při zmražování však musíme respektovat fyzikální jevy.
Objem vody ve zmrazeném stavu je zhruba o 9 % větší než v kapalném stavu. Hustota vody není nejvyšší
v bodě tuhnutí, ale v kapalném stavu při teplotě 277 K (anomálie vody). Voda má vysoký bod tání
(273 K), bod varu (373 K) a ve fázovém diagramu odpovídá kritickému bodu teplota 647 K. Voda má vysoké
vypařovací teplo a relativní permitivitu, což napomáhá rozpouštění látek ve vodě. Navíc je známa řada
krystalických forem ledu, což v praxi znamená, že hrozí poškození ultrastruktury v důsledku potrhání
buněk zvětšujícím se objemem nebo tvořícími se krystaly. Bylo by možné popsat mechanismy zamrzání
vody, ale již z naznačeného výčtu vyplývá, že základním podmínkou pro minimalizaci škod při zmrazení
preparátu je dosažení vysoké chladící rychlosti. V literatuře se uvádí [20], že pro kvalitní kryofixaci je
nutná chladící rychlost minimálně 10⁴ K/s−1
. Pokud není této rychlosti dosaženo, je vzorek vystaven
nebezpečí poškození.
Kryofixace má oproti chemické fixaci řadu výhod. Buňky mohou být pozorovány v mikroskopu v jejich
přirozeném extra a intracelulárním prostředí, a to i v případě ultratenkých řezů. Při kryofixaci nedochází
k denaturaci enzymů a antigenů. Buňky jsou při kryofixaci imobilizovány ve zlomku vteřiny, ale pouze
pokud máme vhodná chladicí média.
10.14. Chladicí média
Chladicí médium musí mít velmi dobrou tepelnou vodivost, tekutost při nízkých teplotách a relativně
vysokou hustotu. Navíc by byla ideální nízká cena a možnost bezpečné manipulace s ním. Všechny tyto
podmínky nesplňuje žádné chladivo. Nejběžnějším laboratorním chladivem je kapalný dusík, který má tu
nevýhodu, že má velmi blízko bod tání a bod varu. Důsledkem toho je, že vhození i rozměrově nepatrného
vzorku vede k varu kapalného dusíku na jeho povrchu, spojenému s uvolňováním plynu, který vzorek obalí
a izoluje. Sníží se tak rychlost odvodu tepla. Při použití kapalného dusíku je nezbytné vzorek ošetřit
kryoprotektantem.
O kvalitě mrazové fixace do značné míry rozhoduje způsob jejího provedení. Z podmínek, které musí
být splněny, jsou nejdůležitější jednoduchost, reprodukovatelnost a rychlost. Při imerzní kryofixaci je
kousek tkáně připevněný na kovovém nosiči nebo koncentrovaná suspenze na síťce ponořena do kapalného
chladiva. Sprejová metoda je použitelná pouze pro suspenze buněčných frakcí, izolované buňky,
viry apod., kdy malé kapičky suspenze jsou vstřikovány do chladicího média. Při metodě jet freezing se
vzorek stále pohybuje v chladicím médiu s konstantní teplotou. Při mražení pomocí kovového bloku je
vzorek naražen na povrch vychlazeného a vyleštěného kovového bloku. Vrstva vzorku, která byla v těsném
kontaktu s kovem, obsahuje amorfní led, který ve větší vzdálenosti přechází v klasické hexagonální
uspořádání. Mražení při vysokém tlaku vyžaduje speciální aparaturu (obr. 63), ve které dochází ke zmrazení
vzorku za sníženého tlaku, takže k mrazení lze použít i kapalný dusík. Podle dostupné literatury
poskytuje skvělé a reprodukovatelné výsledky.
37
..
.
Obrázek 63: Přístroj pro dosažení hlubokého a rychlého zamražení ve vakuu (RMC RFD-9010 Freeze Fracture Sys-
tem).
10.15. Zpracování zmraženého preparátu
Po kvalitní kryofixaci je třeba vzorek dále zpracovat pro prohlížení v TEM. K moderním ultramikrotomům
(obr. 64a) je možné zakoupit kryokomoru, ve které se dají připravovat ultratenké řezy při teplotách
okolo −100 °C (obr. 64b). Podle možností laboratoře a vybavení přístroje je možné přímo pozorovat kryořezy,
za předpokladu, že je TEM vybaven kryodržákem, umožňujícím pozorovat vzorky ve zmrazeném
stavu. V souvislosti s tím je nutné mít možnost prohlížet preparáty v režimu minimálního ozáření urychlenými
elektrony (low dose), aby nedocházelo k jejich zahřívání a k odpařování ledu z jejich povrchu.
Další možností je po nakrájení kryořezy vysušit řízenou sublimací ledu a vysušeným vzorkům dodat kontrast
stínováním. Existují však další postupy (imunoznačení, kryosubstituce, atd.), které vyžadují další
pomůcky pro přípravu preparátů. Nevýhodou kryometod je potřeba náročného technického vybavení.
..
.
Obrázek 64: a) Kryoultramikrotom Leica, b) detailní pohled na kryokomoru.
Na obr. 65a) je na příkladu suspenze ultramalých částic schematicky naznačen rozdíl mezi sušením na
vzduchu a mrazovým sušením (freeze drying). Zatímco při vysoušení na vzduchu dochází k agregaci částic,
případně u buněk k jejich deformaci, u mrazového sušení je po sublimaci ledu zachováno rozdělení částic
(buněk) a je zachován i jejich tvar bez deformace. Při mrazovém sušení buněk může být jako mezistupeň
zařazeno nanesení uhlíkového filmu pro dosažení lepšího kontrastu (obr. 65b).
..
.
Obrázek 65: a) Rozdíl mezi sušením na vzduchu a mrazovým sušením, b) kontrastování odsublimovaného povrchu.
Postup metody „mrazového lámání“ (freeze fracturing) je znázorněn na obr. 66. Při mrazovém lomu
je obnažena ultrastruktura, která je po rychlém zamražení (a, b) ve vakuovaném prostoru řezána nožem
nebo kontrolovaně zlomena (c). Absence chemické fixace poskytuje zachování ultrastruktury. Po
odsublimování povrchové vrstvy cca 10–30 nm (d) můžeme vytvořit repliku povrchu (e), která je následně
čištěna ve vhodném roztoku od tkáně (f). Rozlišení je dáno zrnitostí nanášeného materiálu, z něhož je
38
replika vyrobena. Vytvoří se reliéf povrchu. Povrchová topografie kopíruje buněčné membrány a organely
(obr. 67). Povrch se bezprostředně stínuje kovem a nanáší se uhlíkový film pro vytvoření repliky.
..
.
Obrázek 66: Postup při metodě „Freeze fracturing“ a „Freeze etching“.
..
.
Obrázek 67: Repliky izolovaných thylakoidních membrán chloroplastů.
11. Příprava preparátů pro skenovací elektronovou mikroskopii
Skenovací elektronový mikroskop (SEM) má díky svému analytickému potenciálu široké uplatnění
v řadě vědních a průmyslových oborů. V biologii je důležitý pro lékařské vědy (anatomie, histologie,
patologie, …), botaniku a zoologii. Uplatňuje se v geologii, metalografii, mikroelektronice, strojírenství,
gumárenském průmyslu apod.
V SEM je možné pozorovat objemné preparáty, jejichž velikost je limitována velikostí preparátové
komory. Vodivé materiály (kovy, polovodiče) není třeba zvlášť připravovat. Biologické preparáty zpravidla
vyžadují speciální přípravu, neuvažujeme-li mikroskop s volitelným vakuem (environmentální SEM) nebo
nepracujeme-li v režimu nízkého napětí (low voltage SEM).
U biologických preparátů je třeba posoudit, zda se jedná o tkáně tvrdé či měkké. Tvrdé tkáně, jako
jsou např. kosti, vlasy, zuby, kutikulární vrstvy u hmyzu, schránky rozsivek, dřevo aj., vyžadují pouze
zajištění vodivosti povrchu. Měkké tkáně vyžadují složitější postup zahrnující fixaci, odvodnění, vysušení,
pokovení, tedy zhruba stejný postup jako u TEM.
11.1. Zvláštnosti pozorování biologických preparátů v SEM
Biologický materiál je materiál dielektrický (nevodivý), náchylný k poškození elektronovým paprskem.
Při dopadu elektronů na povrch nevodivého vzorku, jsou elektrony špatně odváděny z povrchu a vznikají
na něm oblasti s velkou hustotou plošného náboje. Hovoříme o tzv. „nabíjení“ povrchu (obr. 41). Pokud
k němu dochází, sekundární elektrony jsou ovlivňovány povrchovým nábojem, který zároveň působí svou
negativní povahou na dopadající primární elektrony a povrch není věrně zobrazen.
Pro dosažení kvalitního snímku je možné provést snížení urychlovacího napětí k hodnotám jednotek
kV, případně použít mikroskop v režimu nízkého vakua. Vrstva těžkého kovu, nanesená na povrch, po-
39
skytne větší emisi sekundárních elektronů i tepelnou ochranu biologického vzorku. Z tohoto důvodu se
používají metody katodového naprašování, při němž se na povrch nanese nejčastěji vrstvička Au nebo
slitiny Au-Pd o tloušťce, která nenaruší ultrastrukturu povrchu (10 nm).
Katodové naprašování je založeno na vzniku doutnavého výboje v prostředí nízkotlaké argonové
atmosféry účinkem elektrického napětí mezi katodou a anodou. Při výboji dochází k ionizaci plynu a
vzniklé ionty jsou přitahovány ke katodě, která je tvořena naprašovaným kovem. Urychlené ionty z něj
vyrážejí částice kovu, které nesou záporný náboj a směřují k anodě, tvořené stolkem, na kterém jsou
umístěny vzorky. V prostoru komory naprašovačky se rozptylují srážkami s dalšími molekulami a ionty
plynu, takže vznikne prostorový mrak plazmy, který dokonale obalí povrch preparátu tenkou vrstvičkou
kovu. Magnetické pole hlavy (katody) soustřeďuje ionty směrem na stolek. Tloušťka naprášené vrstvy
by měla být dostatečná, aby odvedla náboj, ale neměla by zakrývat povrchové detaily. Napětí a doba
naprašování určuje tloušťku naprašované vrstvy, čímž je možné tuto tloušťku empiricky stanovit nebo lze
použít krystalové detektory, které měří tloušťku naprášené vrstvy. Detail naprašovacího zařízení je na
obr. 68.
..
.
Obrázek 68: Naprašovací zařízení (SCD – Sputtering coater device).
Měkké tkáně – rostlinná pletiva a buňky, živočišné tkáně a buňky vyžadují větší pozornost. Ve vakuu
dochází k jejich rychlému vysušování a deformaci. Pro srovnání uvádíme obr. 69a), na němž jsou věrně
zobrazené pokožkové buňky listu, a obr. 69b), kde jsou deformované nešetrným vysušením. Příprava
měkkých tkání je obdobná jako příprava tkání pro TEM.
..
.
Obrázek 69: a) Pokožkové buňky na listu s trichomy, b) vysušení rostlinného pletiva ve vakuu.
11.2. Chemické metody
Obvykle příprava biologického objektu pro SEM zahrnuje následující kroky:
1. odběr vzorku, (v případě potřeby očištění),
2. fixace preparátu (nejčastěji ponořením do fixačního činidla),
3. vymytí fixačních roztoků a odvodnění vzorku,
4. vysušení preparátu a jeho nalepení na podložný terčík,
5. zvýšení povrchové vodivosti preparátu.
40
Tento postup je časově náročný a zabere zhruba dva až tři dny. Protože u SEM může být preparát
objemnější, musíme si uvědomit, co nás na něm zajímá. Zda chceme pozorovat jen vnější povrch nebo
budeme pozorovat i detaily uvnitř preparátu. Tomu musíme podřídit režim fixace. U velkých vzorků je
problém s dokonalým vysušením.
Chemická fixace Hlavním úkolem fixace je, stejně jako v TEM, stabilizovat preparát co nejblíže přirozenému
stavu. Navíc má fixace zpevnit struktury preparátu, které chceme pozorovat. K fixaci se nejvíce
používají aldehydy a oxid osmičelý ve stejných koncentracích jako v TEM. Glutaraldehyd je účinnou
fixáží, ale jen velmi pomalu proniká do větších vzorků, které se pro SEM fixují velmi často. Formaldehyd
vyniká rychlejší penetrací do vzorku a proto je vhodnější k fixaci větších objektů, kde nezáleží na
zachování buněčné ultrastruktury. Oxid osmičelý má velkou reaktivitu a z ní vyplývající rychlost fixace,
dále nízký osmotický účinek a zvyšuje permeabilitu membrán. Při fixaci neproniká příliš rychle dovnitř
preparátu, zůstává na povrchu a díky tomu jej zpevňuje a přispívá také ke snížení povrchového náboje.
Cílem odvodnění je postupné nahrazení vody ve vzorku organickým rozpouštědlem. K odvodnění se
používají rozpouštědla dobře mísitelná s vodou, nejčastěji etanol, aceton. Při odvodnění vzorek projde
řadou roztoků se zvyšující se koncentrací organického rozpouštědla, např. 30, 50, 70, 80, 90, 95 a 100 %.
Důležitou podmínkou je, aby preparát během odvodňování byl stále pod hladinou roztoků a nevyschnul.
Čas jednotlivých kroků při odvodňování závisí na velikosti preparátu a pohybuje se od 10 do 30 min.
Pokud k sušení vzorku bude použita metodu obejití kritického bodu, je třeba vzorky v etanolu v závěru
převést do acetonu z důvodu omezené mísitelnosti etanolu s kapalným oxidem uhličitým, který se při
metodě kritického bodu používá.
Po úplném nahrazení vody je vzorek třeba zbavit dehydratačního činidla. K sušení preparátu se využívá
téměř výhradně metody obejití kritického bodu (CPD – Critical Point Drying). Při sušení na vzduchu
by došlo ke tvarovým deformacím v důsledku existence povrchového napětí, navíc zintenzivněného rychlým
odpařením dehydratačního činidla.
Metoda kritického bodu je založena na skutečnosti, že při zahřívání kapaliny v omezeném prostoru se
docílí stavu, který se označuje jako kritický a je charakterizován kritickou teplotou a tlakem (viz fázový
diagram na obr. 70). V tomto stavu mizí veškeré rozdíly mezi oběma fázemi dané látky – fáze mají stejnou
hustotu a měrný objem, nejsou odděleny rozhraním a povrchové napětí klesá na nulu. Právě v tomto bodě
je kapalina převedena na plyn, který se vypustí z uzavřené komory, a tímto způsobem je připravovaný
vzorek vysušen bez poškození povrchovým napětím kapaliny, ve které se nachází.
..
.
Obrázek 70: Fázový diagram s vyznačením kritického bodu.
Dosáhnout kritické teploty a tlaku u vody je v laboratorních podmínkách prakticky nemožné (pK =
21,8 MPa, TK = 647 K, tj. 374 °C). Nejvíce se k těmto účelům využívá kapalný oxid uhličitý, který je běžně
dostupný a levný a parametry kritické teploty a tlaku jsou snadno dostupné – pK = 7,3 MPa, TK = 304 K
(31 °C). Metoda se provádí ve speciálních aparaturách. Pro tento proces se využívají zařízení CPD (Critical
point dryer), která řídí celý proces automaticky (obr. 71). Komora, ve které jsou uloženy vzorky
ve speciálních pouzdrech, se pomalu, aby nevznikly turbulence, které by mohly poškodit preparát, napustí
kapalným oxidem uhličitým. Ten se několikrát vymění, aby došlo k úplnému nahrazení organického
rozpouštědla. Proces obejití kritického bodu je automatický. S rostoucí teplotou roste i tlak v komoře,
až dosáhne kritického bodu. Potom otevřeme vypouštěcí ventil a pomalu, aby rychlá dekomprese nepoškodila
vzorky, vypustíme plynný oxid uhličitý. Po dosažení atmosférického tlaku komoru otevřeme a
vyjmeme vysušené preparáty.
Aby nedošlo k opětovnému zvlhnutí preparátu, je třeba jej co nejdříve nalepit na vhodný nosič a
pokovit. Nosičem jsou nejčastěji hliníkové kruhové podložky lišící se průměrem u různých typů SEM.
Často jsou přizpůsobeny tak, aby bylo možné použít držák pro několik podložek (obr. 72a). Použité
41
..
.
Obrázek 71: Zařízení pro sušení preparátu metodou obejití kritického bodu.
lepidlo musí splňovat řadu podmínek. Nesmí obsahovat vodu, nemělo by být hydroskopické, mělo by
být nevzlínavé, aby nezakrývalo povrchové detaily vzorku, mělo by být stabilní ve vakuu a neměnit
zde své vlastnosti, tzn. udržet vzorek na nosiči při náklonu, mělo by být elektricky vodivé a nemělo by
emitovat stejně jako nosič zpětně odražené elektrony. Velké objekty se zpravidla lepí přímo na hliníkový
terč pomocí koloidního stříbra, malé objekty pomocí oboustranně lepicí uhlíkové nebo adhesivní pásky
(obr. 72b). Je důležité zajistit vodivost preparátu a v případě potřeby pomocí koloidního stříbra vytvořit
vodivé spojení na hranicích mezi povrchem nosiče a lepicí páskou.
..
.
Obrázek 72: a) Hliníkové podložky na preparáty (umístěné na karuselovém držáku podložek), b) oboustranná uhlíková
lepicí páska.
11.3. Mrazové metody
Mrazové metody se vyznačují rychlostí přípravy při zachování povrchové struktury a v případě SEM
dávají možnost nahlédnout do struktury vnitřních tkání nebo buněk prostřednictvím mrazového lámání.
Mrazové lámání odhaluje vnitřní povrchy buněčných organel, protože lom se ve zmrazeném materiálu
šíří cestou nejmenšího odporu, nejčastěji podél membrán. Na obr. 73 je např. snímek mrazového lomu
jdoucího zmraženou ledvinovou tkání. Z obrázku firmy Gatan jsou patrné zachovalé póry v tubulech
tkáně. Mrazové leptání s částečnou sublimací ledu z obnaženého povrchu lomem zvýrazní prohlubně a
vakuoly. Po nastínování se preparát prohlíží ve zmrazeném stavu v mikroskopu vybaveném kryodržákem.
Mrazové sušení spočívá v tom, že zmrazený preparát se přemístí do vakua a nechá se z něj vysublimovat
led. Mrazové sušení se provádí ve specializovaných aparaturách, kde je možné řídit rychlost
sublimace.
..
.
Obrázek 73: Metoda mrazového lomu použitá k zobrazení ledvinové tkáně (použito z materiálu firmy Gatan).
42
12. Příklady aplikací TEM a SEM
12.1. Využití TEM při charakterizaci magnetosomů
Superparamagnetické nanočástice oxidů železa s vhodnou povrchovou modifikací mohou být využívány
v řadě biochemických a biomedicínských aplikací, jako například v zobrazení pomocí magnetické
rezonance (MRI), k léčbě nádorů apod. Všechny tyto aplikace vyžadují nanočástice vykazující vysokou
hodnotu magnetizace, minimální distribuci velikosti, netoxicitu a biokompatibilitu. Jedním z nejvhodnějších
materiálů, splňující tyto podmínky, je biogenní magnetit (Fe₃O₄), vyskytující se v tzv. magnetotaktických
bakteriích.
Magnetotaktické bakterie (obr. 74a) jsou mikroorganismy, objevené roku 1975, které uvnitř svého těla
syntetizují magnetické částice. Vyskytují se běžně ve sladkovodních i mořských prostředích, prokázána
byla jejich přítomnost v lokalitách v USA, Německu, Číně, Japonsku a Brazílii. Existuje několik druhů
těchto bakterií, lišících se tvarem, velikostí či počtem magnetických částic, tzv. magnetosomů. Magnetosomy
pak v bakteriích vytváří řetízky, které se orientují jako střelky kompasu, které jsou vyrovnány
souběžně se zemským magnetickým polem a umožňují tak, aby bakterie snáze našla její nejpřirozenější
prostředí – mikroaerofilní zónu rozhraní kal/voda.
..
.
Obrázek 74: a) Magnetotaktická bakterie, b) magnetosomy společně se svou biologickou membránou.
Předností magnetotaktických bakterií je produkce biokompatibilního magnetitu. Magnetotaktické
bakterie byly testovány pro použití v řadě aplikací, například identifikaci severního a jižního pólu silně
magnetických granulí v meteoritech nebo k rozpoznání jemných magnetických materiálů. Byly také testovány
v případě adsorpce iontů těžkých kovů v odpadních vodách. Z hlediska nanomateriálového výzkumu
jsou zajímavé především kmeny magnetotaktických bakterií, které jsou kultivovatelné a dostupné v čisté
kultuře.
Výhodou bakteriálních magnetosomů je jejich shodný tvar a fosfolipidová membrána (obr. 74b), která
umožňuje navázání bioaktivních látek. Magnetosomy tedy mohou sloužit jako nosiče léků, enzymů nebo
protilátek v biologických oborech.
Kultivace magnetotaktických bakterií je jedním z nejdůležitějších procesů při získávání magnetosomů.
Magnetotaktické bakterie a jejich magnetosomy, zmiňované v této aplikační části, byly získány z kultivace
bakterií Magnetospirillum gryphiswaldense. Z jednoho litru kultivace lze po rozbití bakterií získat
magnetickou separací až 0,35 g magnetosomů v suchém stavu.
Úprava povrchu magnetosomů a funkcionalizace Hlavním cílem skupiny, zabývající se v Regionálním
centru pokročilých technologií a materiálů PřF UP v Olomouci magnetotaktickými bakteriemi, je získat
čisté magnetosomy bez zbytků bakterií, obalit je a navázat na ně další látky vhodné pro využití v bioaplikacích.
Proto bylo nejprve třeba ověřit, zda jsou izolované magnetosomy čisté, tzn. bez zbytků rozbitých
bakterií. Na obr. 75a) je zřejmé, že suspenze s magnetosomy neobsahuje žádné zbytky rozbitých bakterií,
avšak na obr. 75b), na kterém jsou magnetosomy získané z jiné kultivace, jsou patrné zbytky rozbitých
bakterií.
Povrchová modifikace magnetosomů Z obr. 75b) je zřejmé, že magnetosomy se nevyskytují samostatně,
ale vytváří aglomeráty. Pro řadu aplikací je velice důležité magnetosomy chemicky stabilizovat a zabránit
tak jejich aglomeraci a degradaci. Toho je možné dosáhnout obalením magnetosomů organickými
látkami včetně surfaktantů a polymerů, nebo obalením organickou vrstvou, jako např. polysacharidy.
V mnoha případech pak obalové slupky magnetosomy nejen stabilizují, ale mohou sloužit i pro jejich
další funkcionalizace, v závislosti na dalším využití. Prvním krokem povrchové modifikace magnetosomů
43
..
.
Obrázek 75: Magnetosomy a) bez zbytku rozbitých bakterií, b) se zbytky rozbitých bakterií.
bylo odstranění jejich membrány pomocí cetyl trimethylammonium chloride (CTAC) nebo dodecylsulfátu
sodného (SDS). Z TEM snímků (obr. 76) je zřejmé, že v případě použití SDS-negativního surfaktantu i
CTAC-pozitivního surfaktantu, dojde k rozbití řetízků a zamezení aglomerace po odstranění biologické
membrány.
..
.
Obrázek 76: Magnetosomy bez membrány, která byla odstraněna a) CTAC, b) SDS.
Dalším krokem je samotné obalení magnetosomů biokompatibilními materiály, jako je chitosan, dextran
a Tween 20 (obr. 77a–c).
..
.
Obrázek 77: Magnetosomy obalené a) dextranem, b) chitosanem, c) Tweenem 20.
Z hlediska TEM bylo v některých případech obtížné identifikovat obalení různými činidly. Pro vytvoření
kvalitních snímků bylo nutné nalézt magnetosomy uchycené na vnitřní straně otvorů v uhlíkové
fólii (holey carbon). Tak bylo možné získat na snímcích magnetosomy bez podložního uhlíku a přesně
tak identifikovat obalení. Pro získání přehledu o uspořádání magnetosomů ve vzorcích byl využit také
SEM. Vzorek byl nakápnut na oboustrannou uhlíkovou pásku, uchycenou na kovovou podložku. Poté byl
sušen 20 minut na vzduchu. Urychlovací napětí bylo nastaveno na 3 kV. Při vyšších napětích docházelo
ke značnému nabíjení vzorků. Ze snímků na obr. 78 však není možné rozlišit, zda jsou magnetosomy
obalené či nikoliv, protože v režimu sekundárních elektronů je zobrazován jen povrch magnetosomů.
12.2. Studium sluchových kůstek z archeologických nálezů
Sluchové kůstky jsou příkladem preparátu, který je příliš velký jako histologický objekt a naopak
malý pro anatomy, protože představují nejmenší kůstky v těle. Pomineme-li sníženou tvrdost kostní
tkáně v případě kůstek z archeologických nálezů, stačí pro jejich analýzu ve skenovacím elektronovém
mikroskopu kůstky přilepit na držák a naprášit na ně vrstvičku vodivého materiálu (10 nm slitiny Au-Pd).
44
..
.
Obrázek 78: SEM snímky řetízků magnetosomů.
V této studii [17] byly sluchové kůstky, získané při archeologických vykopávkách z doby kultury
únětické (Nové Dvory), z doby laténské (Ruzyně – Jiviny) a ze středověku (Beroun), po příslušné přípravě
pro studium v SEM (Tesla BS 300) použity pro osteometrické vyšetření. Skenovací mikroskop ukázal
řadu zajímavých nálezů: neobvyklý hrbol na anterolaterální ploše hlavičky kladívka (Beroun), vedoucí
v jednom případě až k primární kostní fixaci kladívka ke stěně středoušní dutiny; kovadlinky s neobvykle
krátkým dlouhým raménkem, s různými formami utváření processus lenticularis a s jeho zánětlivými
apozicemi ve formě kostěných perel na povrchu těla kovadlinky; na třmíncích (obr. 79) bylo možno
pozorovat skořepinovou konstrukci hlavičky.
..
.
Obrázek 79: Sluchová kůstka v SEM – třmínek.
Mezi laténskou skupinou ruzyňskou a středověkou skupinou berounskou se projevila při studiu v SEM
řada diferenciací, které byly důležitým poznatkem při srovnávací anatomii tohoto materiálu s osteometrickými
hodnotami ostatních kostí skeletu příslušných jedinců.
12.3. Včelí pyl jako monitor znečištění životního prostředí
Život včelstva může být negativně ovlivněn neuváženým použitím pesticidů, nevhodně aplikovanými
postřiky, ale také celkovým znečištěním prostředí. Jde zejména o emise chemického průmyslu, tepelných
elektráren, cementáren, dopravy aj. Tyto emise obsahují také těžké a toxické kovy, které se dostávají
z prostředí i k nadzemním částem rostlin a více či méně rozevřenými květy se dostávají k reprodukčním
orgánům rostlin, které včely v době květu navštěvují.
Analytický potenciál elektronové mikroskopie byl v tomto případě [28] využit k nasnímání povrchu
filtru, na který byl usazen depozit pylového materiálu. Zvětšení se pohybovalo do 200. Další rozbor
ve vodě nerozpustných imisních částic na filtrech byl proveden pomocí energiově disperzní elektronové
mikroanalýzy (EDX, Link Systém 860). Výhodou použité EDX analýzy spadu byla možnost získat přehled
o zastoupení prvků na povrchu imisních částic. Výsledky metody upozornily na kovy přítomné v nerozpustných
sloučeninách (např. SiO₂, Fe₂O₃, Al₂O₃). Rentgenová difrakce potom ve shodě s výsledky EDX
upozornila na lokality s vysokým výskytem ekotoxikologického spadu.
12.4. Studium cévního zásobení jater krysy
Na korozivních preparátech, zhotovených nástřikem portálního a arteriálního řečiště krysy monomerem
meatakrylátu, byl ve skenovacím elektronovém mikroskopu studován preterminální a terminální
úsek tohoto řečiště [16]. Naše pozorování podpořily existenci sfinkterů na jaterních sinusoidách i na
45
kapilárách arteriálního stromu v místě vyústění do sinusoid. Obdobným způsobem je možné připravovat
otisky kapilárního řečiště i jiných orgánů. Příklad typického korozivního preparátu kapilárního řečiště
mozku krysy je na obr. 80.
..
.
Obrázek 80: Korozivní otisk kapilárního řečiště mozku krysy v SEM.
12.5. Studium kavitačního opotřebení materiálu
Ideálním pomocníkem je skenovací elektronový mikroskop při analýzách povrchů kovů. Velmi často
se jedná o faktografické analýzy. Při provozu čerpadel, případně armatur, je stále aktuální pochopení
mechanizmu kavitace. Ze studia kavitačního opotřebení exponovaných částí je třeba optimalizovat volbu
kovových materiálů pro provozní podmínky čerpadel s cílem zvýšení jejich životnosti a spolehlivosti.
Ze získaných poznatků vyplývá [8], že k opotřebení materiálu při kavitaci může docházet jen následkem
dynamického kontaktu kapaliny s funkčním povrchem součásti. Kavitační působení je tak intenzivní,
že mu žádný dosud známý materiál nemůže trvale odolávat. Studium povrchu vzorků exponovaných
v podmínkách kavitace blízkých reálným ukázalo, že povrch materiálu při kontaktu s kavitující kapalinou
je vystaven jak mnohonásobnému zatížení, vedoucímu ke kumulaci plastické deformace a únavovému
porušení, tak i k lokálnímu působení, vedoucímu u plastického materiálu ke vzniku kráteru následkem
ojedinělého zatížení. Na vzorcích z hliníku, který je měkkým a tvárným materiálem, lze již v prvních
minutách pozorovat lokální poškození ve tvaru kráterů různých rozměrů (obr. 81a). Na obr. 81b) je deformovaný
povrch vzorku etalonu hliníku ČSN 42 4005 (99,5 % Al) při pokročilém působení kavitace.
..
.
Obrázek 81: a) Účinek kavitační bubliny, b) pokročilý účinek kavitačního působení.
12.6. Studium chloroplastů
Rostlinná pletiva patří mezi biologické materiály, které obsahují velké procento vody. Z tohoto důvodu
je třeba provádět pro analýzu v elektronovém mikroskopu pečlivou přípravu těchto preparátů. Jedna
z aplikací, která vyžadovala vytipování vhodného fixačního a dehydratačního činidla při přípravě vzorků
rostlinných pletiv, byla zaměřena na pozorování intaktních chloroplastů a chloroplastů 2. třídy s různým
stupněm odvodnění. Práce [10] přinesla nové pohledy na vnitřní stavbu chloroplastů a zjištění odolnosti
jejich stavebních prvků proti odvodňujícímu činidlu (acetonu). Obr. 82 ukazuje odolnou stěnu cévy ve
stonku listu špenátu. Na obr. 83a) je vidět izolovaný chloroplast z listu špenátu, s viditelnou strukturou
46
gran ve vnitřním prostoru, zobrazený v SEM. Pro srovnání je na obr. 83b) uveden obrázek vnitřní stavby
chloroplastu s grany a tylakoidními membránami, zobrazený v TEM (University of Sussex).
..
.
Obrázek 82: Stěna cévy ve stonku listu.
..
.
Obrázek 83: Chloroplast v a) SEM, b) TEM.
12.7. Využití SEM při studiu dendritické krystalizace
Krystalografické analýzy s využitím skenovacího elektronového mikroskopu je možné provádět bez
speciální úpravy preparátu. Krystaly jsou dostatečně odolné proti působení urychlených elektronů a je
třeba brát v úvahu pouze jejich nízkou vodivost. V případě krystalů chloridu sodného se jedná o izolant
a pro potřeby pozorování a kvalitního záznamu je třeba jejich povrch pokovit.
Atraktivním příkladem krystalizačních procesů jsou dvojrozměrné krystaly dendritického typu. Typickým
dendritickým krystalem je sněhová vločka, jejíž tvar vychází z hexagonální symetrie ledu (obr. 84).
..
.
Obrázek 84: Sněhová vločka v SEM (Nízkoteplotní SEM Beltsville Agricultural Research Center in Maryland).
Dendritickou krystalizaci je možné pozorovat i u krystalů různých solí v roztocích, které obsahují
organické molekuly, tedy jsou charakterizované určitou viskozitou [9]. Použijeme-li fyziologický roztok
(0,9 % NaCl v destilované vodě) a necháme ho vyschnout na podložním sklíčku, dostaneme typické kubické
krystaly (obr. 85). Pokud však s tímto roztokem postupně smícháme moč (obr. 86a), mozkomíšní mok
(obr. 86b), sliny (obr. 86c) a krevní sérum (obr. 86d), dostaneme pokaždé jiný výsledný tvar dendritického
krystalu, což odpovídá různým hodnotám viskozity a jinému složení příslušné organické tekutiny.
47
..
.
Obrázek 85: Kubické krystaly NaCl.
..
.
Obrázek 86: Krystalogram a) moči, b) mozkomíšního moku, c) slin a d) krevního séra.
48
Poděkování
Autoři děkují za podporu Evropskému sociálnímu fondu v ČR a projektu Vzdělávání výzkumných
pracovníků v Regionálním centru pokročilých technologií a materiálů, r. č. CZ.1.07/2.3.00/09.0042, s jehož
podporou vznikl tento text určený ke vzdělávacím účelům v oblasti skenovací a transmisní elektronové
mikroskopie.
13. Literatura
[1] Aimar P., Lossi L., Merighi A.: Immunogold Labelling for Transmission Electron Microscopy: Exploring
New Frontiers. Cell Vision 4: 394–407, 1997.
[2] Carlemalm E., Colliex C., Kellenberger E.: Contrast Formation in Electron Microscopy of Biological
Material. Adv. Imaging Electron Phys. 63: 269–334, 1985.
[3] Dawes C. J.: Introduction to Biological Electron Microscopy: eory and Techniques. Ladd Research
Industries, Inc. Publisher Burlington, Vermont, 1988.
[4] Hulínský V., Jurek K.: Zkoumání látek elektronovým paprskem. SNTL Praha, 1982.
[5] Kalina T., Pokorný V.: Základy elektronové mikroskopie pro biology. Univerzita Karlova, Praha, 1981.
[6] Karlík M.: Transmisní elektronová mikroskopie. Pohled do nitra materiálů. Čs. čas. fyz. 55: 457–464,
2005.
[7] Karnovsky M. J.: A Formaldehyde-Glutaraldehyde Fixative of High Osmolality for Use in Electron
Microscopy. J. Cell Biol. 27: 137A–138A, 1965.
[8] Koutný A., Kubínek R.: Studium kavitačního opotřebení materiálu pomocí rastrovacího elektronového
mikroskopu. Jemná mechanika a optika 6: 198–203, 2001.
[9] Kubínek R., Hozman J., Vařenka J.: Dendritic Growth from Viscous Solution Containing Organic
Molecules. J. Crystal Growth 193: 174–181, 1998.
[10] Kubínek R., Nauš J.: Investigation of Chloroplasts by Means of Scanning Electron Microscope. Acta
UPO. Fac. rer. nat. 91, Phys. 27: 29–39, 1988.
[11] Kubínek R., Rusek J., Filip P.: Microstructural Investigation of the High-T Superconductors. Acta
UPO, Fac. rer. nat. 99, Phys. 30: 105–121, 1991.
[12] Kubínek R., Rusek J.: A View on X-ray Microanalysis. Acta UPO. Fac. rer. nat. 97, Phys. 29: 137–160,
1990.
[13] Kubínek R., Sobotka J.: Metody zpracování obrazové informace v rastrovacím elektronovém mikroskopu.
Jemná mechanika a optika 11: 239–246, 1993.
[14] Kubínek R.: Využití hloubky ostrosti rastrovacího elektronového mikroskopu ve fraktografii. Jemná
mechanika a optika 10: 269–273, 1984.
[15] Kubínek R.: Metodika přípravy a studium některých rostlinných pletiv v REM. Acta UPO Fac. rer.
nat. 88, Phys. 26: 309–323, 1987.
[16] Kutal M., Kubínek R., Holibka R., Holibka V.: Blood Supply of Rat River in Scanning Electron
Microscopy. Acta UPO. Fac. med. 119: 149–159, 1988.
[17] Lisoněk P., Kutal M., Peške L., Kubínek R.: Human Auditory Ossicles from Archaeological Findings
(e Latene and Medieval periods). Acta UPO, Fac. med. 113: 61–69, 1986.
[18] Mráz P., Polónyi J.: Metody elektronovej mikroskopie živočíšnych tkanív. Veda, Bratislava, 1988.
[19] Reid N., Beesley J. E.: Sectioning and Cryosectioning for Electron Microscopy. Elsevier, Amsterdam,
1991.
[20] Nebesářová J.: Elektronová mikroskopie pro biology. 2001 (http://www.paru.cas.cz/lem/book/)
[21] Robards A. W., Wilson A. J.: Procedures in Electron Microscopy, Willey and Sons, 1993.
49
[22] Robinson D. G., Ehlers U., Herken R., Herrmann B., Mayer F., Schurmann F.-W.: Methods of Preparation
for Electron Microscopy. Springer-Verlag, Berlin, 1987.
[23] Roos N., Morgan A. J.: Cryopreparation of in Biological Specimens for Electron Microscopy:
Methods and Applications. Oxford University Press. Royal Microscopical Society, 1990.
[24] Rumph J. A., Turner W. J.: Alternative to Critical Point Drying for Soft-Bodied Insect Larvae. Ann.
Entomol. Soc. Am. 91: 693–699, 1998.
[25] Ryan K. P.: Cryofixation of Tissues for Electron Microscopy: A Review of Plunge Cooling Methods.
Scanning Microsc. 6: 715–743, 1992.
[26] Sitte H.: Ultramicrotomy—Common Problems and Mistakes. Elektronenmikroskopie: 1–36, 1981.
[27] Šafářová K.: Transmisní elektronová mikroskopie nanopráškových materiálů. Disertační práce. Univerzita
Palackého v Olomouci, 2010.
[28] Tureček R., Bičík V., Kubínek R.: Včelí pyl jako monitoring znečištění životního prostředí. Acta UPO,
Fac. rer. nat. 104, Biologica XXXI, 1990.
[29] Villiger W. and Bremer A.: Ultramicrotomy of Biological Objects: From the Beginning to the Present.
J. Struct. Biol. 104: 178–188, 1990.
[30] Wang W., Cai Z., Du K.: Improved Methods for Making and Using Glass Knives. Biotech. Histochem.
72: 129–134, 1997.
[31] Weibull C., Christiansson A., Carlemalm E.: Extraction of Membrane Lipids during Fixation, Dehydration
and Embedding of Acholeplasma laidlawii-cells for Electron Microscopy. J. Microsc. 129:
201–207, 1983.
[32] Williams D. B., Carter C. B.: Transmission Electron Microscopy, Plenum Press, New York, 1996.
..
.
Autoři textu
doc. RNDr. Roman Kubínek, CSc.
roman.kubinek@upol.cz
tel.: 58 563 4286
Mgr. Klára Šafářová, Ph.D..
klara.safarova@upol.cz
tel.: 58 563 1429
Mgr. Milan Vůjtek, Ph.D..
milan.vujtek@upol.cz
tel.: 58 563 1430
..
.
Pracoviště
Katedra experimentální fyziky
Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci
17. listopadu 1192/12, 771 46 Olomouc
http://www.upol.cz/fakulty/prf/struktura/katedry-a-pracoviste/katedra-experimentalni-fyziky
Regionální centrum pokročilých technologií a materiálů
Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci
Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc
http://rcptm.cz
50
Doc. RNDr. Roman Kubínek, CSc.
Mgr. Klára Šafářová, Ph.D.
Mgr. Milan Vůjtek, Ph.D.
Elektronová mikroskopie
Výkonný redaktor: Prof. RNDr. Tomáš Opatrný, Dr.
Odborný redaktor: Doc. RNDr. Roman Kubínek, CSc.
Odpovědná redaktorka: Mgr. Jana Kreiselová
Technický redaktor: Mgr. Milan Vůjtek, Ph.D.
Určeno pro studenty, odbornou veřejnost a další zájemce.
Vydala Univerzita Palackého v Olomouci
Křížkovského 8, 771 47 Olomouc
www.upol.cz/vup
e-mail: vup@upol.cz
Olomouc 2011
1. vydání
Tato publikace neprošla redakční jazykovou úpravou.
© Roman Kubínek, Klára Šafářová, Milan Vůjtek, 2011
Ediční řada — Ostatní publikace
Online publikace
ISBN 978-80-244-2739-3
fyzika.upol.cz/cs/pro-studenty/elektronova-mikroskopie