Kvasinková buňka Kvasinky patří mezi houby – Mycota Kvasinky jsou jednobuněčné houby s podobnou organizací jako buňky živočichů a rostlin. Obsahují jádro s chromosomy a dělí se mitózou, jsou to tedy eukaryotické buňky Fylogenetický strom - porovnání genu pro rRNA Historie poznávání kvasinek • 1680 Antonie van Leeuvenhoek pozoroval kvasinky pomocí primitivního mikroskopu • 1818 Friedrich Erxleben postuloval, že kvasinky jsou živé organizmy • 1825 Charles Cagniard de la Tour a Theodor Schwann nezávisle zjistili, že se vinné kvasinky množí pučením • 1837 Julius Meyen použil označení Saccharomyces (cukerné houby) pro pučící kvasinky • 1870 Louis Pasteur postuloval, že fermentace je proces poskytující bakteriím a kvasinkám energii za anaerobních podmínek • 1888 Emil Hansen vypracoval metodu na izolaci čistých kvasinkových kultur • 1890 Hermann Muller-Thurgau zavedl inokulovanou fermentaci moštu Historie poznávání kvasinek • 1918 Karel Kruis a Jan Šatava publikovali fotomikrografie kvasinek. Popsali sporulaci kvasinek a spájení spor, vznik velkých buněk (diploidních) a trpasličích (haploidních) • 1935 Ojvind Winge objevil, že diploidní kvasinky pochází z haploidních askospor • 1943 Carl Lindegren objevil dva párovací typy u Saccharomyces cerevisiae, α a a a vysvětlil životní cyklus • 1955 první ultratenké řezy kvasinkových buněk • 1963 freeze-fracturing kvasinkových buněk • 1978 Gerald Fink a spol. transformovali Saccharomyces cerevisiae - první eukaryotickou buňku - plasmidovou DNA • 1996 André Goffeau a spol. publikovali sekvenci genomu Saccharomyces cerevisiae Fázový kontrast Mikroskopie v procházejícím světle Skenovací elektronová mikroskopie Mateřská buňka s vyrůstajícím pupenem Po oddělení dceřinné buňky zůstává na povrchu mateřské buňky jizva po pučení, na nové buňce jizva zárodečná (genetika stárnutí, 20-30 jizev) Technika mrazového lámání – freeze fracturing Povrch plasmatické membrány S. cerevisiae odhalený technikou mrazového lámání (brázdy) Elektronová mikroskopie ultratenkých řezů – po šetrné fixaci, kontrastování a zalití do pryskyřic se ultramikrotomem krájí tenké řezy – tloušťky 40 nm Pučení S. cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Preparace buněk technikou mrazového lámání Povrch spory s částečně odhalenou plasmatickou membránou Struktura jádra kvasinkové buňky SPB spindle pole body – proteinový komplex v jaderném obalu, který organizuje tvorbu dělícího vřeténka a v telofázi se na něj upínají centromery chromosomů CEN centromera chromosomu TEL telomery chromosomů Technika ultratenkých řezů dovoluje studovat i jemnou strukturu dělícího vřeténka, které je u kvasinek uvnitř jádra Ultrastruktura SPB (spindle pole body) s jadernými a cytoplasmatickými mikrotubuly Cytoskelet kvasinkové buňky: síť vláknitých proteinů aktinu a tubulinů, která -generuje tvar buňky – morfogenezi (kulatý, oválný, vřetenovitý, triangulární, cylindrický, vláknitý atd.) - odpovídá za polaritu klidové i rostoucí buňky -zajišťuje topologii organel v cytoplasmě -umožňuje pohyb organel v cytoplasmě Aktin je organizován do vláken a do granul (patches) vlákna se podílí na polaritě buňky, reguluji pohyb sekrečních váčků a podílí se na cytokinezi granula aktinu jsou angažovány do mechanizmu sekrece a endocytózy Tubuliny (alfa a beta) vytváří mikrotubuly (MT), které vychází ze SPB (spindle pole body), tělíska v jaderném obalu. V nedělící se buňce jsou MT radiálně uspořádány v cytoplasmě a zajišťují polohu jádra. V průběhu mitózy MT vytváří vnitrojaderné dělící vřeténko – spindle, které realizuje karyokinezi – oddělení dceřiných jader Cytoskeletální struktury kvasinkové buňky S. cerevisiae Sch. pombe aktin Sch. pombe mikrotubuly Fluorescenční mikroskopie cytoskeletálních struktur – pomocí fluoreskujících protilátek Sekreční dráha a endocytóza (vesikulární transport) Charakteristika pojmů: endocytóza pinocytóza (tekutiny)fagocytóza (pevné látky) exocytóza (sekrece) regulovaná - konstitutivní Spřažení exocytózy a endocytózy Integrace sekreční dráhy a endocytózy: tok membrán Proteiny syntetizované na ER jsou transportovány přes GA do sekrečních vesiklů, které splývají s PM nebo lyzosomy/vakuolou. Plocha PM se zvětšuje o povrch sekrečních vesiklů. exocytóza Integrace sekreční dráhy a endocytózy: tok membrán Plasmatická membrána se vchlipuje do cytoplasmy, odštěpuje se endosom a splývá s lyzozomem/vakuolou. Vchlipováním měchýřků se plocha PM zmenšuje. endocytóza Integrací sekrečních vesiklů se povrch PM zvětšuje, odštěpováním endosomů se plocha PM redukuje. Rozměr povrchu buňky se tedy nemění. Membránový materiál tak neustále prochází všemi kompartmenty – tok membrán Začátek sekreční dráhy: syntéza proteinů na ribosomech, vázaných na povrch membrán endoplasmatického retikula. Syntéza sekrečního proteinu začíná na cytoplasmatických ribosomech. Po vytvoření ER signální sekvence se na ni naváže SRP částice, komplex se dostane na SRP receptor na povrchu ER, SRP se uvolní a ribosom se přesune na translokační kanál. Syntéza proteinu se obnoví, polypeptid je však nyní translokován do lumina ER. Translokace proteinu do lumina ER Proteiny uvnitř ER jsou glykosylovány: Oligosacharid, obsahující 14 monomerů, se syntetizuje na dolicholu a pak se navazuje na aminoskupinu asparaginu Glykoproteiny, které jsou nyní v cisternách ER se (zabaleny v membránových měchýřcích) dostávají do GA, kde se, opět v měchýřcích, přesouvají z jedné cisterny do další a jejich molekuly jsou chemicky upravovány. Z GA pak putují, zabaleny v měchýřcích, do lyzosomů (vakuoly) nebo do plasmatické membrány Posttranslační modifikace v Golgiho aparátu Jak je kontrolován postup sekrečního produktu po sekreční dráze? U kvasinek S.cerevisiae byly detekovány geny, jejichž produkty jsou potřebné pro průběh sekrece. Mutací těchto genů je blokována sekreční dráha v místě, kde schází genový produkt Randy Schekman Jak se izolují sec mutanty? Jestliže syntéza bílkovin pokračuje, ale sekrece je zastavena, vzrůstá specifická hmotnost buněk a v hustotním gradientu jsou těžší. Z frakce těžších buněk se případně izolují teplotně senzitivní mutanty: v pokojové teplotě 250C probíhá sekrece proteinů normálně, avšak při zvýšení kultivační teploty na 370C je sekrece zastavena na tom místě, kde schází teplotně denaturovaný protein. Sekreční mutanta S. cerevisiae sec 18, přenos z 25 0C do 37 0C 25 0C 37 0C ER Sekreční mutanta S. cerevisiae sec 7 Transfer z 25 0C do 37 0C Sekreční mutanty S. cerevisiae: sec 1 25 oC → 37 oC Proteiny, potřebné k exocytóze sekrečního váčku (post-Golgi secretory vesicle), definované na základě genetické analýzy sekrečních mutant kvasinek Vps1p je dynamin‐like GTPasa a Vps4p je AAA‐type ATPasa zprostředkující pučení vezikul (Candida albicans) PVC - prevacuolar compartments Endocytóza: invaginace plasma-tické membrány, na jejíž receptory jsou navázány makro-molekuly z okolí buňky Organizace molekul, které řídí místo tvorby receptorové jamky a odštěpení endosomu od plasmatické membrány: molekuly clathrinu vytváří kolem vchlipujícího se měchýřku „klícku“ , na jejím povrchu pak polymerizují vlákna aktinu, který spolu s myozinem pomáhá odštěpení endosomu a jeho pohybu do cytoplasmy Aktin myozin clathrin Candida albicans ELM obrázek izolovaných endosomů, pokrytých klatrinovou „klecí“