Osnova 4. přednášky
– Plasmidy
– Integrace do genomu
– Nadprodukce, delece
– Tetrádová analýza
– Syntetická letalita, suprese
– Teplotně-sensitivní mutanty
GENETIKA
Wang,CurrentGenetics,2016
– obecnější poznání (buněčných/molekulárních procesů)
– aplikační účely (biotechnologie)
kvasinkové modely
• Rychle se množící EUKARYOTNÍ mikroorganismy
(90 min/dělení, 25-30°C)
• Vytváří kolonie na plotnách - mikrobiologické metody (otiskování
ploten, kapkovací test => toxiny v plotnách – HU, MMS …)
• Stabilní haploidní i diploidní formy
• Haploidní buňky lze křížit na diploidní (heterozygotní mutanty)
• Diploidní buňky lze sporulovat a využít pro genetickou analýzu
(tetrádová analýza)
• Lze transformovat DNA (plasmidy i linearní)
• Centromerické a multicopy plasmidy
• Vysoká frekvence homologní rekombinace
(lineární DNA)
• Lze připravovat deleční a mutantní kmeny
• Vydrží v >15% glycerolu na -70°C „indefinitely“
• S.c. má kompaktní genom – knihovny s genomovou DNA (ne cDNA)
• Kompletně osekvenovaný genom (genomové aplikace)
• EuroFan projekt – delece všech S.c. genů (+GFP, +2-hybrid)
Saccharomyces cerevisiae
- oválné, množí se pučením – >diploidní i haploidní buňky
- většina v G1 fázi (zatímco pombe je v G2 fázi)
- Genom 12 Mbp na 16-ti chromosomech
- Krátké centromery a ARS (100bp)
- Kóduje cca 6 500 genů
- 120 kopii rRNA (chr XII), 262 tRNA
- Geny reprezentují 75% celkové sekvence (kompaktní)
- <5% genů obsahuje introny (0.5% genomu), 3% transposony (46% u člověka)
Schizosaccharomyces pombe
- podlouhlé, množí se „polcením“ - většinou haploidní buňky
- má blíž k vyšším eukaryotům (metazoa)
- pouze 3 kondenzované chromozomy (13 Mbp)
- velké repetitivní centromery (40-100kb) a 1kb počátky replikace
- tvorba spindlu až v mitóze
- asi 4800 kodujících genů (nejmeně u eukaryot)
- z nichž 43% má introny
- má geny pro heterochromatin, RNA interferenci (S.c. nemá)
Chromosom III
(nejmenší)
CEN, ARS, TEL, Ty1-5
obsahuje MAT lokus
Nomenklatura pro S.c.:
YCRXXw:
Y=yeast
C= 3. chromosom
R= pravé raménko
XX=pořadové číslo
w/c=Watson/Crick
LEU2 – gen
Leu2p - protein
leu2∆ – delece
leu2-1 – mutace
(identifikační číslo alely)
LEU2::HIS3 – inzerce
genu HIS3 v lokusu
genu LEU2
Nomenklatura pro S.p.:
SPAXXXX:
SP=S. pombe
A= 1. chromosom
…
Forsburg: NRG, 2001
Baudat a Nicolas, PNAS, 1997
S. cerevisiae kompaktní genom
Laboratorní kvasinkové kmeny
S. pombe – „501“
Genotype: h- ura4-∆18 leu1-32 ade6-704
S. cerevisiae – „S288C“ – 1. osekvenovaný kmen
Genotype: MATα SUC2 gal2 mal mel flo1 flo8-1 hap1
Notes: Strain used in the systematic sequencing project, the sequence stored in SGD. S288C does not form
pseudohyphae. In addition, since it has a mutated copy of HAP1, it is not a good strain for mitochondrial studies. S288C
strains are gal2- and they do not use galactose anaerobically.
References: Mortimer and Johnston (1986) Genetics 113:35-43.
Sources: ATCC:204508
„W303“ – nejčastěji používaný laboratorní kmen
Genotype: MATa/MATα leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15
Notes: W303 also contains a bud4 mutation that causes haploids to bud with a mixture of axial and bipolar budding patterns.
In addition, the original W303 strain contains the rad5-535 allele.
References: W303 constructed by Rodney Rothstein
Sources: Biosystems:YSC1058
Dvojhybridní
systém:
auxotrofie – využívána pro selekci
Allele Reverts? Notes Molecular descriptiona Reference
ade2-101 yes
ochre mutation, red
colonies
G to T transversion at nucleotide
190, changing amino acid 64 from
a Glu to a STOP
Gai and Voytas, 2005
his3-200 no
Cold sensitive; high
frequency of petite
formation, especially
during transformation.
1 kb deletion, (-205 to 835)
Struhl 1985; Fasullo and Davis
1988
leu2-3,112 no double mutant
GTT-to-GCT missense change at
codon 69,
G insertion at nucleotide 249,
G insertion at nucleotide 792,
GAC-to-AAC missense change at
codon 300.
Hinnen et al. 1978;
Gaber and Culbertson 1982;
trp1-1 yes amber mutation
GAG-to-TAG amber (STOP)
nonsense change at codon 83
McDonald, et al. 1997
ura3-52 no - Ty1 insertion Rose and Winston 1984
Selekce
Forsburg: NRG, 2001
- geneticin (G418) – podobný kanamycinu (mistranslace)
- nourseothricin (NAT) – inhibitor ribosomalní proteosyntézy = miskodování
(Streptomyces noursei), rezistence pomocí nat1 genu (N-acetyltransferasa –
monoacetyluje NAT)
- hygromycin B – inhibuje translokaci v průběhu translace (aminoglykosid z
Streptomyces hygroscopicus), rezistence kódována hph genem z Klebsiella
pneumoniae
- phleomycin – interkaluje se do DNA a způsobuje DSB (zlomy, glycopeptid z
Streptomyces verticulus), rezistence kódována ble genem z S. hindustanus
Shuttle vektory
MET1
CUP1
MFA1
Methionin repressed
Cu induced
MATa specific (haploid specific)
• vychází z 2µm plasmidů nebo centromer (S.c.; 2µm přítomné také v
Zygosaccharomyces bailii, Z. rouxii a Kluyveromyces drosophilarum)
• Kvasinková část – marker (URA3, NAT …), CEN-ARS (1 kopie) nebo 2µm (~50 kopii
na haploidní buňku) segregace (uchycení chromosomu) a začátek replikace
• Bakteriální část – Kan resistence, replikace
• Promotor, tag, MCS
– Kondicionální mutanty (fenotyp-funkce)
– Nadprodukce (suprese mutací, toxicita, biotechnologie)
Sheng, Front in Microb, 2015FFA- free fatty acids, FAEE - fatty acid ethyl esters
Nadprodukce - integrativní plasmidy
- integrativní plasmid pro P. pastoris
(GS1115, genotype: his4 )
- exprese z AOX1 promotoru v
P.pastoris
- nemají CEN/2µm části
Integrace I
- integrativní plasmid pro P. pastoris
(GS1115, genotype: his4 )
- exprese z AOX1 promotoru
- integrace do AOX1 lokusu
- mechanismus homologní rekombinace
Integrace II.
- integrace do his4 lokusu
mechanismus
homologní
rekombinace
YAC (yeast artificial chromosome)
• Bakteriální část – Amp resistence,
počátek replikace
• Kvasinková část – markery
(TRP1, URA3), CEN4+ARS1,
TEL
• 50-500kbp insert např. lidská
genová banka pro HuGO 80000
klonů YAC (270kbp)
• Klonování, množení, uchování
dlouhých fragmentů DNA
• Výzkum savčích telomer a
centromer
• Pomocí transfekce, lipofekce
nebo elektroporace lze dostat
YAC i do savčích buněk –
náhodně se integrují do genomu výzkum
nesestřihnutých genů
(dlouhé regulační úseky)
Transformační protokol
• Exponenciální kvasinková kultura
• Opláchnout vodou a TE/LiAc roztokem
• Rozsuspendovat v TE/LiAc roztoku a přidat DNA
(plasmidová/cirkulární i lineární DNA)
• Přidat TE/LiAc/PEG4000 roztok
• 30 minut na 30°C a poté teplotní šok při 42°C (15min)
• Stočit a pelet rozsuspendovat v TE roztoku
• Rozetřít na selektivní plotnu
Integrace: disrupce/delece genu
- studium funkce genu – fenotyp (delece/mutace)
- biotechnologie (přesměrování metabolických drah)
- životaschopné – mutace lze přímo integrovat do genomu
- esenciální gen => buňky potřebují gen např. na plasmidu
(plasmid shuffling)
1. krok 2. krok
neesenciální gen
specifická mutace
Využití inhibitoru FOA pro „odléčení“ URA3 markeru (FOA je přeměňována Ura3p
dekarboxylázou na toxický 5-fluorouracil => URA3+ buňky nerostou, zatímco ura3buňky
jsou „rezistentní“) - opět ura-, takže URA3 marker lze znovu využít
homologní rekombinace
Delece genu - PCR
- studium funkce genu – fenotyp
- esenciální gen vs životaschopné
- systematicky provedeno na všech ~6500 genech v rámci projektu EuroFan
- kmeny lze získat z archivu EUROSCARF
http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html
Giaeveretal,Nature,2002
kanMX
kanMX
kanMX
1.PCR (barcode)
2.PCR (homologie)
Kvasinkový ORF
pro rekombinaci stačí pouze krátká
homologie (50-100nt pro S.c.)
specifické sekvence pro pozdější
identifikaci a manipulace …
EuroFan projekt - testy fenotypu
Buněčná stěna
(stabilizující)
Oprava DNA
Mikrotubuly
(stabilizující)
ts
cs
- Systematicky provedeno na >6000 genech v rámci projektu EuroFan
- Funkční kategorie genů – anotace v databázích (genová ontologie)
Mikrotubuly
(destabilizující)
Bun. stěna
(destabilizující)
Winzeler et al, Science, 1999; Giaever et al, Nature, 2002
~ 6000 heterozygotních delečních kmenů
~ 5000 homozygotních delečních kmenů (+ ~ 1000 esenciálních genů)
(neesenciální – pro růst za specifických podmínek nebo redundantní procesy)
- Testováno ~400 malých molekul
a stresových podmínek (-aa ...)
- Celkem provedeno ~ 6milionů
testů
- multidrug resistance (MDR)
pokud byl gen potřebný pro
resistenci vůči >20% z
testovaných látek
- Podobné profily svědčí o funkční podobnosti
Hillenmeyer et al, Science, 2008
Geny/Proteiny peroxisomu
Deleční knihovna – S. pombe
- S. pombe potřebuje delší homologii (serial PCR = 40-80bp; block PCR = 80-350bp)
- deleční knihovna od Bioneer (Korea, 25 000$)
Kim et al, Nat Biotech (2010)
- individuální vědecké studie …
Delece genu pomocí transposonů
Defekt buněčné stěny
MacDonald et al.: Nature, 1999
esenciální
Citlivé …
- knihovna konstruktů s náhodnými integracemi
Micheletal,eLife,2017
SAturated Transposon Analysis in Yeast (SATAY)
- generováno 1.000.000 klonů – 300.000 inzercí (vysoké pokrytí na 6.000 genů)
- cirkulární DNA použita pro NGS sekvenování (MiniDs transposon-specifické primery)
- inzerce každých 40bp (preferenčně v nucleosom-free oblastech)
- každý transposon sekvenován 20x …
Michel et al, eLife, 2017
- inzerce chyběly v
esenciálních genech
(zelené šipky)
- charakterizace GO,
drug screening,
syntetická letalita, …
- rozlišení na úrovni
domén (GAL10 – dvě
domény z nichž
esenciální je pouze
první …)
- C-koncové, ale i Nkoncové
delece
Mulleder et al, Cell, 2016
- deleční knihovna
testována na
metabolismus
AMK (změna
koncentrace AMK)
- analýza vztahu
genom-metabolom
Mulleder et al, Cell, 2016
- transport proteinů a váčků (Golgi/ER … degradace proteinů a recyklace AMK) má
zřejmý vztah k hladině AMK – překvapivě velký vliv má struktura chromatinu
vztah genom-metabolom
K integraci u kvasinek není nutný CRISPR
- účinná homologní rekombinace
- CRISPR zvyšuje účinnost integrace a
nezanechává „stopy“Horwitz et al, Cell Syst, 2015
Integrace: inzerce genu (CRISPR/Cas9)
Torres-Garciaetal,WOR,2020
Rodriguez-Lopezetal,WOR,2017
sgRNA kazeta definuje
místo štěpení
donorová DNA nese
HR integrační insert
Horwitz et al, Cell Syst, 2015
Cas9 zaintegrován
sgRNA kazeta definuje
místo štěpení
donorová DNA nese
integrační insert
Integrace: inzerce genu (CRISPR/Cas9)
- CRISPR zvyšuje účinnost integrace a
nezanechává „stopy“
Horwitz et al, Cell Syst, 2015
Phosphoenol pyruvate (glykolýza)
6 integrací do 3 lokusů (po dvou)
syntéza kyseliny mukonové - bioplasty
AroY v pěti kopiích – zvýšilo výtěžek
delece ARO1 blokuje tvorbu aromatických AMK (dráha vede na kys. mukonovou) a nutí
buňky do této dráhy – v biotechnologickém procesu nejdříve na bohatém médiu roste
biomasa – poté se na minimálním médiu (bez aromatických AMK) spouští tato dráha
- sgRNA kazeta
definuje místo štěpení
- donorová DNA nese
homologní integrační
insert
nová metabolická dráha
lokusy: GAL80, HO, ARO1
AroB, D, F, Y a Z = E. coli
CATA = C. albicans
Životní cyklus S. cerevisiae
- Deleci či mutaci lze provést v
haploidní či diploidní buňce
- v haploidní buňce hrozí suprese
defektu proto je lépe používat
diploidní buňky (druhá kopie zůstává
nezměněná)
- lze připravit dvojitého mutanta
křížením haploidních mutant a poté
sporulací diploida
- pouzdro spory je třeba rozrušit a
pomocí mikromanipulátoru získat
jednotlivé haploidní buňky (lze
provést i tzv. random sporulation)
- u S.pombe jsou diploidní buňky
nestálé a okamžitě sporulují
(pouzdro se rozpadá samo)
Životní cyklus S. cerevisiae
- Deleci či mutaci lze provést v
haploidní či diploidní buňce
- v haploidní buňce hrozí suprese
defektu proto je lépe používat
diploidní buňky (druhá kopie zůstává
nezměněná)
- lze připravit dvojitého mutanta
křížením haploidních mutant a poté
sporulací diploida
- delece esenciálního genu lze provést pouze
v diploidní buňce (haploidní nepřežije)
- po iniciaci sporulace dojde k meiotickému
dělení (2n -> 4n -> 4x 1n) a vzniknou 4
haploidní buňky (lze rozdělit
mikromanipulátorem – tetrádová analýza)
Tetrádová analýza
(S. pombe)
spory přeneseny tenkou jehlou a
rozmístěny v pravidelných
odstupech
YPD
Tetrádová analýza
2 spory/kolonie normální
+
2 spory/kolonie mutantní
YPD
Selektivní médium (SD-ura ... testy)
AAaa
aaAA
AaAa
AaAa
.
.
.
Mendelův základní pokus
s hrachem (diploidní) s kvasinkami (haploidní)
URA3
x haploid
haploid
diploid
kontrola bez uracilu
s ade2 by byly červené
+ -
+/-
Genetické interakce
- studium funkce genu – fenotyp
- esenciální gen vs ne-esenciální
(mutantní kmeny se testují na citlivost k různým „toxinům“
- dále je lze křížit s funkčně podobnými geny-mutantami a hledat jejich
funkční vztahy (epistase x syntetická letalita x suprese)
Křížení - dvojité mutanty
- lze připravit dvojitého mutanta křížením
haploidních mutant a poté sporulací diploida
- frekvence typů závisí na vzájemné pozici
genů – různé chromosomy => nezávislá
segregace vs stejný chromosom (Morganovy
zákony – čím blíže, tím méně cross-over)
Delece genu
- studium funkce genu – fenotyp
- esenciální gen vs životaschopné – mutace lze přímo integrovat
do genomu
- mutantní kmeny se testují na citlivost k různým „toxinům“ – dále je lze
křížit s funkčně podobnými geny-mutantami a hledat jejich funkční vztahy
(synthetic lethal x epistatic x suprese)
1. krok 2. krok
neesenciální gen
specifická mutace
- Využití inhibitoru FOA pro „odléčení“ URA3 markeru (FOA je přeměňována Ura3p
dekarboxylázou na toxický 5-fluorouracil => URA3+ buňky nerostou, zatímco ura3buňky
jsou rezistentní) - opět ura-, takže URA3 marker lze využít několikrát
Dvojité mutanty – funkční příbuznost
haploid x haploid => diploid – stejný fenotyp - identický gen
- bez fenotypu – díky wt alele (různé geny)
sporulace => haploid – stejný fenotyp – epistatický (funkčně příbuzné geny)
- aditivní až letální (paralelní dráha, redundance, rozpad
komplexu)
A
b
C
D
e
F
A
B E
A
b
c
D
E
F
Mutageneze pomocí EMS … hledání (screening) letálního mutanta –
mutageneze kmene s vypínatelným plasmidem (promotor nebo FOA – viz
plasmid shuffling)
Epistatický Letální
D
C
F
Proteinový
komplex
Pomocí těchto genetických metod byly analyzovány metabolické dráhy …
proteinové komplexy …
Hledání funkčně příbuzných genů
Luetal.,JACS(2010)
alcohol
dehydrogenase
Fatty
alcohol
oxidase
P450
- delece homologních enzymů (např.
dehydrogenás) potlačí metabolické
schopnosti buňky (DP421 = méně
ω-hydroxymastné kyselin)
Syntetická letalita v léčbě rakoviny
Supresory
Supresory potlačují původní fenotyp – mutace téhož genu „napraví“ původní mutaci
(nebo nedojde k produkci toxického produktu)
- mutace sousedního proteinu zesílí oslabenou
interakci
- nadprodukce proteinu z paralelní dráhy
- nadprodukce proteinu z téže dráhy
A
b
C
D
E
A
b
C
D
E
F
F
A
E
D
C
FF
B E
Proteinový
komplex